Ringraziamo R. Sun e altri studenti del Laboratorio di Chen per il loro contributo alla centrale di generazione di materiale. Ringraziamo anche il Dott. D. Green per il suo sostegno alla ricerca di laurea presso la Facolta &#39;di tecnologia e l&#39;innovazione (CTI). Questa ricerca è stata sostenuta in parte da sovvenzioni NIH U01 AI075549 e 1R21AI101329 al D. Chen, e una borsa di SSE da CTI della Arizona State University di Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, e J. Stahnke sono studenti universitari finanziati dalla sovvenzione SSE.

1. Crescita delle piante <ol><li> Luogo 60 torba pellet in un vassoio di propagazione. Aggiungere 4 L di acqua di rubinetto e lasciare che la torba pellet assorbire l&#39;acqua per 2 ore. </li><li> Aggiungere 2 N. benthamiana semi in ogni torba pellet utilizzando una seminatrice, coprire il vassoio con una cupola di plastica trasparente, e permettere loro di germinare in ° C, umidità ambiente 25 84% con un hr ciclo giorno / notte 16/8 (Figura 1A). </li><li> Rimuovere la cupola due settimane dopo la semina, drenare l&#39;acqua dal vassoio, e aggiungere 2 litri di fertilizzante di Jack ad una concentrazione di 1,48 g / L (Figura 1B). Continuare a crescere piante in ° C, umidità ambiente 25 50% con un hr giorno / ciclo notte 16/8. Fornitura 2 L di concime di Jack ogni 2 giorni per ogni vassoio. </li><li> Alla settimana 4, trasferire le piante con palline di torba a un nuovo vassoio che ospita sei impianti di fornire uno spazio adeguato per l&#39;ulteriore crescita (Figura 1C) fino a quando non sono pronti per essere infiltrato a 6 settimane di età (Figura1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Cultura Preparazione 2.1 Preparazione per Siringa Infiltration <ol><li> Streak A. tumefaciens GV3101 ceppi contenenti i vettori geminiviral p19, pREP110, pBYGFP e pBYDsRed su piastre di LB agar contenenti kanamicina (100 pg / ml). Striatura un ceppo per piastra e crescere a 30 ° C per 48 ore. </li><li> Allo stesso modo, striscia e crescere GV3101 ceppi ospitano i vettori MagnICON del 5 &#39;modulo (pICH15879), al 3&#39; del modulo contenente il gene bersaglio di GFP o DsRed (Pich-GFP o Pich-DsRed) e dell&#39;integrasi (pCH14011) su LB Agar piastre contenenti carbenicillina (100 pg / ml). </li><li> Da una singola colonia sulla piastra di agar LB, inoculare GV3101 albergano ceppi vettori geminiviral in 3 ml di YENB supporti (0,75% estratto di lievito Bacto, 0,8% Nutrient Broth, aggiustare il pH a 7,5 con NaOH) + kanamicina (100 pg / ml) in una provetta di coltura ml a fondo rotondo 15, crescere la coltura liquida a 30 ° C inun agitatore notte con una velocità di rotazione 300 rpm. </li><li> Allo stesso modo, inoculare e crescere GV3101 ceppi ospitano vettori MagnICON in YENB supporti + carbenicillina (100 mcg / ml) in un agitatore notte a 30 ° C. </li><li> Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida con uno spettrofotometro e utilizzare la formula seguente per calcolare il volume necessario (V sub) possibile replicare per una nuova cultura con un diametro esterno di partenza 600 di 0.025 in 10 ml di mezzi YENB con antibiotici appropriati . V inf (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Trasferimento V inf (ml) della coltura overnight a (10 - V sub) ml di mezzo YENB con antibiotici appropriati per ogni ceppo. Crescere la nuova cultura notte a 30 ° C in un agitatore con un tasso di rotazione 250 rpm finché il valore di OD 600 è nell&#39;intervallo 1.7-2.0. </li><li> Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida e utilizzare la formula seguente per calcUlate il volume necessario (V inf) diluiti in 50 ml di tampone di infiltrazione che invia un diametro finale 600 di 0,12 per ogni ceppo. V inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Trasferimento V inf (ml) di ogni cultura in una provetta e centrifugare le cellule per centrifugazione a 12.000 xg per 2 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di tampone di infiltrazione (10 mM MES, pH 5.5, 10 mM MgSO 4) nel vortex brevemente. </li><li> Mescolare risospeso cellule pBYGFP + pREP110 + p19, girare le celle in basso a 12.000 xg per 2 minuti, e risospendere in totale di 50 ml di tampone di infiltrazione. Questa combinazione Agrobacteria è per geminiviral espressione di GFP. </li><li> Allo stesso modo, mescolare le seguenti combinazioni di cellule Agrobacteria, centrifugare e risospendere in 50 ml di tampone di infiltrazione. Essi includono (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 per l&#39;espressione geminiviral di DsRed, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110+ P19 per geminiviral co-espressione di GFP e DsRed, (3) pREp110 + p19 come controllo negativo di espressione geminiviral, (4) Pich-GFP + pICH15879 + pCH14011 per MagnICON espressione di GFP, (5) Pich-DsRed pICH15879 + + pCH14011 per l&#39;espressione di MagnICON DsRed, e (6) pICH15879 + pCH14011 come controllo negativo per l&#39;espressione MagnICON. </li></ol> 2.2 Preparazione per l&#39;infiltrazione di vuoto <ol><li> Seminare e cultura ogni ceppo GV3101 contenente vettori geminiviral o vettori MagnICON in 15 ml di mezzi YENB con antibiotici appropriati in un pallone autoclavato 50 ml e crescere durante la notte come descritto per la siringa infiltrazione sopra. </li><li> Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida con uno spettrofotometro e utilizzare la formula seguente per calcolare il volume necessario (V sub) possibile replicare per una nuova cultura con un diametro esterno di partenza 600 di 0.025 in 250 ml di mezzi YENB con antibiotici appropriati . V sub </sub&gt; (Ml) = (250 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Trasferimento V inf (ml) della coltura overnight a (250 - V sub) ml di mezzo YENB in un pallone da 1 L autoclavato con antibiotici appropriati per ogni ceppo e crescere la nuova coltura durante la notte come descritto sopra per siringa infiltrazione. </li><li> Misurare e registrare OD 600 valori per ogni coltura liquida e utilizzare la formula seguente per calcolare il volume necessario (V inf) da diluire in 3 L di tampone infiltrazione di dare un OD finale 600 di 0,12 per ogni ceppo. V inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Pellet e risospendere V inf (ml) di ciascuna cultura in tampone infiltrazione come descritto per siringa infiltrazione e mescolare le culture risospeso secondo le combinazioni descritte per siringa infiltrazione. Repellet le cellule Agrobacteria misti e li Risospendere in 3 L di tampone infiltrazione. </li></ol> 3.1 Siringa Infiltrazione <ol><li> Scegliere quattro di 6 settimane vecchio N. piante benthamiana con 5 foglie ciascuno. Le prime tre foglie contando dall&#39;alto di ogni pianta saranno infiltrate interamente con una delle combinazioni di A. tumefaciens tensioni nei buffer di infiltrazione. La quarta foglia sarà posto-infiltrati con tutte le combinazioni di deformazione quattro per l&#39;espressione geminiviral o tutte e tre le combinazioni per l&#39;espressione MagnICON. L&#39;ultima foglia su ogni impianto verrà infiltrata con combinazioni di controlli negativi. </li><li> Creare un piccolo nick con un ago nell&#39;epidermide sul lato posteriore del foglio (Figura 2A). Attenzione: assicurarsi di non graffiare così difficile da perforare il foglio attraverso entrambi i lati, come le cellule agrobatteri nella miscela infiltrazione passeranno attraverso la puntura per l&#39;altro lato della foglia. </li><li> Prendere una stretta costante del lato anteriore della foglia e durante l&#39;applicazione delicatacontropressione al nick con il pollice di una mano, iniettare miscele Agrobacterium in tampone infiltrazione nel nick con una siringa senza ago (Figura 2B). Nota: Poiché la miscela Agrobacterium entra nello spazio intercellulare della foglia, la zona infiltrata diventa verde visibilmente più scuro (Figura 2C). </li><li> Continuare a iniettare miscele Agrobacterium nel nick fino a quando il cerchio verde scuro smette di espandersi. Creare un altro nick e ripetere i punti 3.1.2-3.1.4 finché l&#39;intera foglia è infiltrata e tutta la foglia diventa verde scuro per le prime tre foglie e l&#39;ultima foglia. </li><li> Per la quarta foglia di ogni pianta, ogni quattro (vettore geminiviral) o tre (MagnICON vettore) combinazioni saranno infiltrati in esso. Fai un nick per ogni combinazione di ceppi di Agrobacterium, e infiltrarsi ogni nick con una combinazione. </li><li> Dopo l&#39;infiltrazione, muovere le piante di nuovo alla stanza crescita e Moniespressione della proteina tor tra 2-15 giorni dopo l&#39;infiltrazione (dpi). </li></ol> 3.2 Vacuum Infiltrazione <ol><li> Mettere una vasca in un essiccatore a vuoto e il trasferimento 3 L tampone infiltrazione contenente i ceppi di Agrobacterium alla vasca. Collegare l&#39;essiccatore ad una pompa a vuoto a membrana Vacuubrand (Figura 3A). </li><li> Posizionare una pianta capovolta sulla piastra essiccatore (Figura 3B) e abbassare la piastra con la pianta finché l&#39;intera foglia e sistema di gambo è sommersa nel buffer infiltrazione con la piastra di riposo in cima della vasca. Posizionare l&#39;anello O essiccatore lungo il bordo e mettere il coperchio sulla camera di essiccatore (Figura 3C). </li><li> Accendere la pompa del vuoto e avviare il cronometro quando il vuoto raggiunge 100 mbar. Aprire lentamente la valvola di rilascio sul essiccatore dopo 1 min a 100 mbar per consentire l&#39;ingresso di Agrobacteria negli spazi interstiziali del tessuto vegetale sommersa. Ripetere questo passo si additionale tempo per assicurare una buona infiltrazione. </li><li> Dopo l&#39;infiltrazione, prendere la pianta di un essiccatore e rimetterlo in posizione verticale. Spostare le piante di nuovo alla stanza crescita e l&#39;espressione della proteina del monitor tra 2-15 dpi. </li></ol> 4. Fluorescent Protein Detection e Fotografia <ol><li> Partendo da 2 dpi, piante spostare nella stanza buia e brillare luce UV sul lato posteriore delle foglie infiltrate con una lampada UV portatile. </li><li> Osservare la fluorescenza verde della GFP o la fluorescenza rossa di DsRed. GFP emette un segnale forte con luce UV a onda lunga, mentre DsRed è più forte sotto raggi UV a onde corte. </li><li> Scattare fotografie di foglie fluorescenti con una normale fotocamera digitale, senza il flash. </li><li> Spostare le piante di nuovo alla stanza crescita dopo l&#39;osservazione o la fotografia. </li></ol>

<ol>
	<li>Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. , 86-126 (2011).</li><li>Chen, Q., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+virus-like+particles+as+vaccines.">Plant-derived virus-like particles as vaccines.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).</li><li>Landry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+and+clinical+development+of+plant-made+virus-like+particle+vaccine+against+avian+H5N1+influenza.">Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza.</a> PLoS One. 5, e15559 (2010).</li><li>Lai, H., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+plant-derived+virus-like+particles+of+Norwalk+virus+capsid+protein+under+current+Good+Manufacture+Practice+regulations.">Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations.</a> Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).</li><li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+Pharmaceutical+Proteins+in+Plants.">Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants.</a> Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).</li><li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+new+leaf.">Turning a new leaf.</a> European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).</li><li>Chen, Q., Levine, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).</li><li>Lai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+produced+in+plants+efficiently+treats+West+Nile+virus+infection+in+mice.">Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).</li><li>Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+porcine+prorelaxin+in+transgenic+tobacco.">Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).</li><li>Lico, C., Chen, Q., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants.">Viral vectors for production of recombinant proteins in plants.</a> J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).</li><li>Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geminiviral+vectors+based+on+bean+yellow+dwarf+virus+for+production+of+vaccine+antigens+and+monoclonal+antibodies+in+plants.">Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants.</a> Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).</li><li>Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+production+of+virus-like+particles+and+monoclonal+antibodies+with+geminiviral+replicon+vectors+in+lettuce.">Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce.</a> Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).</li><li>Giritch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+high-yield+expression+of+full-size+IgG+antibodies+in+plants+coinfected+with+noncompeting+viral+vectors.">Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).</li><li>Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+replicon+system+for+rapid+high-level+production+of+virus-like+particles+in+plants.">A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).</li><li>Santi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+plant+viral+expression+system+generating+orally+immunogenic+Norwalk+virus-like+particles.">An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles.</a> Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).</li><li>He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+System+for+Rapid+and+Cost-Effective+Production+of+Detection+and+Diagnostic+Reagents+of+West+Nile+Virus+in+Plants.">A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+rapid+production+of+full-size+monoclonal+antibodies+in+plants+by+a+single-vector+DNA+replicon+system.">High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).</li><li>Kuta, D., Tripathi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-induced+hypersensitive+necrotic+reaction+in+plant+cells:+a+resistance+response+against+Agrobacterium-mediated+DNA+transfer.">Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).</li><li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+immunogenic+Ebola+immune+complex+in+Nicotiana+benthamiana.">Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).</li><li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonreplicating+subunit+vaccine+protects+mice+against+lethal+Ebola+virus+challenge.">A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).</li><li>Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus-like+particles+as+vaccines.">Norwalk virus-like particles as vaccines.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione.

La crescente domanda di prodotti farmaceutici a base di proteine ​​a livello mondiale richiedono nuove piattaforme di produzione che sono robusti, scalabili, a basso costo e sicuro. Piante hanno dimostrato di essere uno dei sistemi di produzione alternativi più promettenti per la produzione di proteine ​​farmaceutiche. Negli ultimi anni, lo sviluppo di vettori basati sul virus destrutturati ha consentito espressione transiente di proteine ​​nelle piante, che migliora notevolmente la velocità e la resa dei ...

Dal 1970, le piante sono state esplorate come alternative alle colture cellulari di mammifero, insetto, e batteriche per la produzione commerciale di proteine ​​ricombinanti e proteine ​​terapeutiche 1. Sistemi a base vegetale per l&#39;espressione di biofarmaci hanno mostrato risultati promettenti negli ultimi anni come molti nuovi trattamenti per le malattie, come il morbo di Gaucher 2, e l&#39;influenza aviaria H5N1 3, hanno dimostrato il successo negli studi clinici. Lo sviluppo di meccanismi competenti per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti nelle piante nei decenni successivi gli esperimenti iniziali ha creato il potenziale per i sistemi a base di piante per alterare l&#39;attuale paradigma di produzione di proteine ​​per tre motivi principali. In primo luogo, vi è una notevole diminuzione dei costi come bioreattori mammiferi, insetti e batteri richiedono notevoli costi di avvio, i media di crescita costosi e complicati processi di depurazione a valle 4. La creazione di pianta transgenica stabilelinee permette loro anche di surclassare la scalabilità di altri sistemi di espressione di proteine ​​come le piante che esprimono possono essere coltivate e raccolte su scala agricola 5. In secondo luogo, sistemi di espressione a base vegetale riducono significativamente il rischio di trasmissione di un patogeno umano o animale dall&#39;host proteina-esprimendo agli esseri umani, dimostrando superiorità nella pubblica sicurezza 6. Infine, impianti utilizza un sistema eucariotico endomembrane che è simile alle cellule di mammifero, permettendo una corretta modificazione post-traduzionale di proteine ​​compreso glicosilazione e l&#39;assemblaggio delle proteine ​​multiple-subunità 7. Questa capacità pone sistemi a base vegetale avanti di quelli basati su sistemi procariotici, come batteri, poiché un numero più ampio di proteine ​​ricombinanti farmaceutiche, inclusi anticorpi monoclonali (mAb), hanno una struttura più complessa e richiedono ampie modifiche post-traduzionali o da montaggio 8. Ci sono due principali approdolori ad esprimere proteine ​​ricombinanti nelle piante. Il primo è lo sviluppo di una linea transgenica stabilmente, in cui il DNA codificante per la proteina bersaglio viene clonato in una cassetta di espressione e introdotto sia ad genomi nucleari o cloroplasto. Così facendo, il DNA estraneo diventa ereditabile attraverso successive generazioni e consente enormemente migliorata scalabilità, ben oltre quella di altri sistemi di espressione 1. Introduzione di DNA esogeno al genoma nucleare è di solito realizzato da Agrobacterium tumefaciens infezione del tessuto vegetale o, meno spesso, da microproiettili bombardamento del tessuto 9. Ormoni vegetali sono poi utilizzati per indurre il differenziamento e la crescita di tessuto vegetale transgenica come radici e foglie. Trasformazione del genoma del cloroplasto non può essere raggiunto con A. tumefaciens, ma si basa interamente su particelle di oro o di tungsteno rivestite di DNA sparato balisticamente nelle cellule vegetali. Il secondo metodo di esprimere ricombinazionent proteina nelle piante è attraverso l&#39;espressione transiente 10. In questo scenario, vettori derivati ​​da virus ospitano il gene di interesse sono consegnati via A. tumefaciens di piante completamente sviluppate attraverso un processo chiamato agroinfiltration. Invece di integrare nel genoma della pianta, il costrutto genico espresso inizierà a dirigere la produzione transiente della proteina desiderata, che può essere raccolto e isolato dopo un breve periodo di incubazione. Espressione genica transiente offre il vantaggio di una maggiore accumulo di proteine ​​generale così come un tempo maggiore di produzione di proteine, come piante saranno pronte raccogliere circa 1-2 settimane dopo agroinfiltration 11. Questo è significativamente più veloce rispetto ai processi di generazione, la selezione e la conferma delle linee di piante transgeniche stabili, che può richiedere diversi mesi a un anno. Questo però, è anche la limitazione del sistema di espressione transiente, in quanto non produrrà geneticamente stabile pianta lines che possono essere utilizzati per generare una banca di seme per la produzione commerciale su larga scala. Nonostante questo, sono stati sviluppati approcci per migliorare larga scala espressione transiente. Qui mostriamo un metodo di generazione di proteine ​​che esprimono piante di Nicotiana benthamiana transitori utilizzando vettori virali decostruiti consegnati da A. tumefaciens. Due metodi principali sono in sviluppo per la fornitura di A. tumefaciens in tessuto vegetale: panchina scala infiltrazione tramite siringa e infiltrazione larga scala tramite camera a vuoto. Entrambi i protocolli sono descritti usando N. benthamiana, che è strettamente legato alla pianta del tabacco comune, come la pianta ospite per l&#39;espressione transiente di due proteine ​​fluorescenti: la proteina fluorescente verde (GFP) dalle meduse Aequorea victoria e la proteina fluorescente rossa da Discosoma corallo (DsRed) 12,13. N. benthamiana è la pianta ospite più comune per laproteina ricombinante perché è suscettibile di trasformazione genetica, può produrre elevate quantità di biomassa rapidamente, ed è un produttore di seme prolifico per la produzione su scala industriale 14. Un altro vantaggio di usare N. benthamiana come ospiti per l&#39;espressione proteica è la disponibilità di una varietà di vettori di espressione 2,5. In questo studio, i due vettori virali decostruiti, uno basato su un virus del mosaico del tabacco (TMV) RNA sistema replicone (vettori MagnICON) e l&#39;altro derivato dal virus del nanismo giallo fagiolo (BeYDV) sistema replicone DNA (vettori geminiviral) 4,11, 15-18, sono utilizzati per trasportare il gene GFP e DsRed e consegnarli in N. cellule benthamiana via A. tumefaciens. tre costrutti di DNA saranno utilizzati per la GFP o espressione DsRed con vettori MagnICON. Essi comprendono &#39;modulo (pICH15879) contenente il promotore ed altri elementi genetici per guidare l&#39;espressione del gene bersaglio, il 3&#39; del modulo 5 contenente il gene di interesse (Pich-GFP o PICH-DsRed), e il modulo integrasi (pICH14011) codifica per un enzima che integra il 5 &#39;e 3&#39; insieme moduli sull&#39;espressione 8,15. Sono necessari anche tre costrutti di DNA per l&#39;espressione con vettori geminiviral. Oltre a vettori contenenti il replicone del gene target (pBYGFP o pBYDsRed), è richiesto un vettore codificante per la proteina di replica (pREP110) per l&#39;amplificazione del target replicone 11,14,16. Inoltre, l&#39;inserimento di un vettore codificante il tacere soppressore p19 del virus del rachitismo cespuglioso pomodoro è desiderato per il livello di espressione del gene target alto 11,16. Ci sono generalmente tre fasi principali per l&#39;introduzione di geni di proteine ​​ricombinanti in cellule vegetali per agroinfiltration compresi crescita delle piante, A. tumefaciens cultura preparazione, e infiltrazione. Come ogni passaggio è fondamentale per il successo finale di questa procedura, quindi, una descrizione dettagliata per ognuno è fornitosia per infiltrazione siringa e vuoto infiltrazione sotto.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V353-20</td>
			<td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> See reference: Lico and Chen, et al 2008</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632152</td>
			<td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> See reference: Baird and Zacharias, et al 2000</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MagnICON Vector</td>
			<td>Icon Genetics</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Geminiviral Vector</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Chen and He, et al 2011</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>N. benthamiana</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Lai and Chen 2012</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Carbenicillin-100, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0418</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Kanamycin-50, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0543</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium sulfate hepa hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773-500 g</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difco Nutrient Broth</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 234000</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MES hydrate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-1kg</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1613-1ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70560-51-9</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's Fertilizer</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Jul-25</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuubrand MD4 Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-878-113</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuum Air Regulator Valve</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386590</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Desiccator 12 1/8" with O ring</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-594-15C </td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>3 L Tub</td>
			<td>Rubber-Maid</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>plate/shelf 230ML</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9489269</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peat Pellet</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-2370-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagation Tray Dome</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>132052</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagaiton Tray</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>138758</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Virbo Hand Seeder</td>
			<td>Gro-Mor INC</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank">www.gro-morent.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flora Cart 4 shelf</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>65-6924-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Round Bottom Culture Tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430172-500EA</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>223-9950</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>166-0602EDU</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator/Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank">www.eppendorf.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultraviolet Light Model#: UVGL-25</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0021-12</td>
			<td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins

Colture cellulari di mammifero è la più importante piattaforma per la produzione commerciale di vaccini umani e delle proteine ​​terapeutiche. Tuttavia, non può soddisfare la crescente domanda mondiale di prodotti farmaceutici grazie alla sua scalabilità limitata e costo elevato. Le piante hanno dimostrato di essere una delle più promettenti alternative piattaforme di produzione farmaceutica che sono robuste, scalabili, a basso costo e sicuro. Il recente sviluppo di vettori basati sul virus ha permesso rapida e di alto livello di espressione transiente di proteine ​​ricombinanti in piante. Per ottimizzare ulteriormente l&#39;utilità del sistema di espressione transiente, dimostriamo una metodologia semplice, efficiente e scalabile per introdurre target-gene contenente Agrobacterium in tessuto vegetale in questo studio. I nostri risultati indicano che agroinfiltration sia con siringa e vuoto metodi hanno portato alla introduzione efficiente di Agrobacterium in foglie e produzione robusta di due proteine ​​fluorescenti, GFP e DsRed. Inoltre,dimostriamo i vantaggi unici offerti da entrambi i metodi. Siringa infiltrazione è semplice e non richiede attrezzature costose. Esso permette anche la flessibilità di entrambi infiltrare l&#39;intero congedo con un gene bersaglio, o per introdurre geni di bersagli multipli su un unico foglio. Quindi, può essere utilizzato per l&#39;espressione scala di laboratorio di proteine ​​ricombinanti e per confrontare diverse proteine ​​o vettori di espressione yield o cinetica. La semplicità della siringa infiltrazione suggerisce anche la sua utilità nella scuola superiore e l&#39;istruzione universitaria per il soggetto delle biotecnologie. Al contrario, l&#39;infiltrazione di vuoto è più robusto e può essere scalata-up per la produzione commerciale di proteine ​​farmaceutiche. Esso offre anche il vantaggio di poter agroinfiltrate specie vegetali che non sono suscettibili di infiltrazione siringa come lattuga e Arabidopsis. Nel complesso, la combinazione di siringa e agroinfiltration vuoto fornisce ai ricercatori ed educatori un semplice, efficiente e robustometodologia per l&#39;espressione proteica transiente. Esso agevolerà notevolmente lo sviluppo di proteine ​​farmaceutiche e promuovere l&#39;educazione scientifica.

1. Espressione di proteine ​​fluorescenti con Siringa Infiltration Per dimostrare l&#39;efficacia della siringa infiltrazione di Agrobacterium in tessuto vegetale, abbiamo testato l&#39;espressione di due proteine ​​fluorescenti - GFP e DsRed - da due diverse piante vettori virali decostruiti - geminiviral e MagnICON - in N. benthamiana. Per N. foglie benthamiana che sono stati interamente infiltrato con Agrobacteria vettori geminiviral conte...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins at JoVE.com

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene contenente<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; In impianti per la proteina espressione transitoria.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

47.7K Views.  Arizona State University. Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene contenente Agrobacterium tumefaciens In impianti per la proteina espressione transitoria.

Video: Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Ricerca

Biologia

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Espressione di proteine ​​ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

In Planta Trasformazione transitoria delle piante di cacao utilizzando Agrobacterium tumefaciens

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation rely on the use of Agrobacterium-mediated transformation. However, the protocols currently in use are standardized for small-sized plants due to the physical and economic constraints of submitting large-sized plants to a vacuum treatment. This work presents an effective protocol for localized vacuum-based agroinfiltration customized for large-sized plants. To assess the efficacy of the proposed method, we tested its use in cacao plants, a tropical plant species recalcitrant to genetic transformation. Our protocol allowed applying up to 0.07 MPa vacuum, with repetitions, to a localized aerial part of cacao leaves, making it possible to force the infiltration of Agrobacterium into the intercellular spaces of attached leaves. As a result, we achieved the Agrobacterium-mediated transient in planta transformation of attached cacao leaves expressing for the RUBY reporter system. This is also the first Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao. This protocol would allow the application of the vacuum-based agroinfiltration method to other plant species with similar size constraints and open the door for the in planta characterization of genes in recalcitrant woody, large-size species.

Autore in primo piano: Trasformazione mediata da agrobatteri senza colture di tessuti in grandi piante legnose

Here, we present the first protocol for localized vacuum infiltration for in vivo studies of the genetic transformation of large-sized plants. Using this methodology, we achieved for the first time the Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao.

Agroinfiltrazione forzata sottovuoto per la trasformazione in planta di piante recalcitranti: il cacao come caso di studio

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ricombinanti