I recettori immunitari NLR svolgono un ruolo cruciale nella mediazione della difesa delle piante contro vari agenti patogeni. Descriviamo un metodo di etichettatura di prossimità basato su TurboID per l'identificazione di partner di interazione del dominio del recettore Toll / interleuchina-1 contenente NLR come recettori immunitari nelle piante di Nicotiana benthamiana. Questo protocollo fornisce un importante riferimento per lo studio delle interazioni proteina-proteina in altre specie vegetali e può essere esteso a qualsiasi proteina di interesse per Nicotiana benthamiana.
L'approccio di etichettatura di prossimità basato su TurboID ha un netto vantaggio rispetto agli approcci tradizionali perché può essere utilizzato per catturare interazioni proteina-proteina transitoria o debole in vivo. Inizia coltivando semi di N.benthamiana in terreno umido ad alta densità. Mantienili in una camera climatica con una luce di 18 ore e un periodo di foto scure di otto ore a 23-25 gradi Celsius.
Tenere le piante nella camera per circa quattro settimane fino a quando non crescono fino a una fase fogliare da quattro a otto per la successiva agroinfiltrazione. Costruisci fusioni TurboID e trasforma i plasmidi in cellule competenti agrobacterium tumefaciens come descritto nel protocollo di testo. Utilizzare una siringa senza ago millilitro per infiltrarsi nell'inoculo dell'epidermide abassiale delle foglie di N.benthamiana completamente mature.
A 36 ore dalla postfiltrazione, infiltrarsi in 200 biotina micromolare nelle foglie e mantenere la pianta per altre tre o 12 ore prima di raccogliere il tessuto fogliare. Per raccogliere il campione fogliare, tagliare le foglie infiltrate alla base del picciolo, rimuovere la vena fogliare e congelare il tessuto in azoto liquido. Macinare il tessuto fogliare con un pestello e malta e conservare la polvere in tubi Falcon da 15 o 50 millilitri a meno 80 gradi Celsius.
Per estrarre la proteina totale, trasferire circa 0,35 grammi di polvere fogliare in un tubo da due millilitri. Assicurarsi di mantenere il tessuto a bassa temperatura nell'azoto liquido durante questo processo. Aggiungere 700 microlitri di tampone dilisi RIPA alla polvere.
Vortice il tubo per 10 minuti e lasciare il campione sul ghiaccio per 30 minuti, mescolando il contenuto ogni quattro o cinque minuti invertendo i tubi. Centrifugare i tubi a 20.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi raccogli il supernatante.
Rimuovere la biotina libera eseguendo il campione attraverso una colonna di desalinizzazione. Rimuovere il sigillatore nella parte inferiore della colonna e posizionarlo in un tubo da 50 millilitri. Quindi allentare il tappo e centrifugare la colonna a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius per due minuti.
Posizionare la colonna di desalinizzazione in un tubo fresco da 50 millilitri ed equilibrare la colonna tre volte con cinque millilitri di tampone dilisi RIPA. Centrifugarlo a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius per due minuti e scartare il flusso ogni volta. Aggiungere 1,5 millilitri di estratto proteico sulla parte superiore della resina nella colonna equilibrata.
E quando l'estratto entra nella resina, aggiungere altri 100 microlitri di tampone dilisi RIPA. Centrifugare la colonna per due minuti e lasciare i campioni dissalati sul ghiaccio fino a un ulteriore utilizzo. Per quantificare gli estratti proteici dissalti, misurare l'OD595 utilizzando uno spettrofotometro Bio-Rad.
Disegnare la curva standard in base al valore della soluzione BSA gradiente e calcolare la concentrazione dei campioni proteici dissalati. Equilibrare le perle magnetiche coniugate streptavidin C1 con un millilitro di tampone dilisi RIPA per un minuto a temperatura ambiente. Utilizzare il rack magnetico per assorbire le perline per tre minuti e aspirare delicatamente la soluzione.
Quindi ripetere il lavaggio un'altra volta. Trasferire l'estratto proteico sulle perline magnetiche equilibrate e incubare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte su un rotatore per purificare l'affinità delle proteine. Il giorno dopo, cattura le perline con un rack magnetico e aspira il supernatante.
Successivamente, lavare le perline con 1,7 millilitri di tampone di lavaggio uno aggiungendolo al tubo e incubarlo sul rotore per otto minuti. Rimuovere il supernatante come descritto in precedenza e ripetere il lavaggio con 1,7 millilitri di tampone di lavaggio due e lavare il tampone tre. Aggiungere 1,7 millilitri di Tris HCL da 50 millimolare per rimuovere il detergente.
Quindi posizionare il tubo sul rack magnetico e rimuovere il supernatante. Ripetere il lavaggio con un millilitro di Tris HCL da 50 millimolare e trasferire le perline in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Infine, lavare le perline sei volte con tampone in bicarbonato di ammonio millimolare per cinque minuti per lavaggio.
Utilizzare 100 microlitri di perline per l'analisi immunoblot per confermare l'arricchimento delle proteine biotinilate e congelare flash il resto del campione da stoccare a meno 80 gradi Celsius. Le macchie occidentali sono state utilizzate per analizzare l'espressione proteica e la biotinylation nelle foglie agroinfiltrate di N.benthamiana. Le proteine biotinilate nelle foglie infiltrate sono state efficacemente arricchite con perline magnetiche coniugate streptavidina C1 per successive analisi della spettrometria di massa.
Sono state catturate diverse proteine di varie dimensioni e l'analisi western delle proteine arricchite ha mostrato bande spalmato. Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di rimuovere il sigillare nella parte inferiore della colonna di desalinizzazione e allentare i tappi prima di ogni centrifugazione. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre proteine di interesse per Nicotiana benthamiana e può anche essere utilizzato per estendere il TurboID PL in altre specie vegetali.
