우리는 R. 태양과 기여에 대한 첸의 연구실의 학생들은 물질 생성을 심어 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 기술과 혁신 (CTI)의 대학 학부 연구의 그의 지원을 위해 박사 D. 녹색 감사합니다. 이 연구는 Q. 첸에 NIH 보조금 U01 AI075549 및 1R21AI101329, 그리고 Q. 첸 애리조나 주립 대학의 CTI에서 SSE 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다. K. Leuzinger, M. 덴트, J. Hurtado, 그리고 J. Stahnke는 SSE 지원에 의하여 학부생입니다.

1. 식물 성장 <ol><li> 전파 트레이에 위치 60 토탄 펠릿. 수돗물 4 L을 추가하고 토탄 펠릿 2 시간 동안 물을 흡수 할 수 있습니다. </li><li> 2 N. 추가 파종기를 사용하여 각 토탄 펠릿에 benthamiana 씨앗, 투명한 플라스틱 돔 트레이를 커버하고, 그들이 8분의 16 시간 일 / 1 박 사이클 (그림 1A)와 25 ° C, 84 % 습도 환경에서 발아 할 수 있습니다. </li><li> 2 주 파종 후 돔을 제거하고 트레이에서 물을 배수하고, 1.48 g / L (그림 1B)의 농도 잭의 비료 2 L을 추가합니다. 8분의 16 시간 일 / 밤주기 25 ° C, 습도 50 %의 환경에서 식물을 성장하는 것을 계속한다. 잭의 비료 2 L 트레이 당 2 일마다를 제공합니다. </li><li> 그들은 나이가 6 주 (그림에 침투 할 준비가 될 때까지 4 주에서 추가 성장 (그림 1C)에 대한 충분한 공간을 제공하는 6 개 발전소를 호스팅하는 새로운 트레이에 이탄 알약과 식물을 전송1D). </li></ol> 2. A. 박테 리움 문화 준비 주사기 침투 2.1 준비 <ol><li> 줄무늬 A. geminiviral 벡터 P19, pREP110, pBYGFP 및 카나마이신을 (100 ㎍ / ㎖)이 포함 된 LB 한천 플레이트에 pBYDsRed을 포함 박테 리움 균주 GV3101. 연속 한 판 당 변형 및 48 시간 동안 30 ° C에서 성장. </li><li> 마찬가지로, 줄무늬와 LB 한천에 GV3101 5 MagnICON 벡터 숨겨 변종 &#39;모듈 (pICH15879)를, 3&#39;GFP 나는 DsRed (PICH-GFP 또는 PICH-는 DsRed)의 표적 유전자를 포함하는 모듈 및 Integrase (pCH14011)을 성장 carbenicillin을 (100 ㎍ / ㎖)이 포함 된 접시. </li><li> LB 한천 플레이트에 하나의 식민지에서 YENB 미디어 3 ㎖ (0.75 % Bacto 효모 추출물, 0.8 % 영양소 국물, NaOH를 7.5로 산도를 조정)에 geminiviral 벡터를 품고 GV3101 균주를 접종 + 카나마이신 (100 ㎍ / ㎖)의 15 mL 둥근 바닥 문화 관, ° C에서 30 액체 문화를 성장300 RPM의 회전 속도와 하룻밤 셰이커. </li><li> 마찬가지로, 접종 30시 흔드는 하룻밤에 YENB 미디어 + carbenicillin (100 ㎍ / ml)에 MagnICON 벡터를 품고 GV3101 긴장 ° C. 성장 </li><li> 분광 광도계 적절한 항생제로 YENB 미디어 10ml에 0.025의 시작 OD 600 새로운 문화에 대한 계대 배양 할 필요가 볼륨 (V 이하)를 계산하려면 아래 공식을 사용하여 각 액체 문화를 측정하고 기록한다 OD 600 값 . V 이하 (ML) = (10 ㎖) × (0.025) / OD 600 </li><li> 에 하룻밤 문화의 양도 V 이하 (ML) (10 - V 이하) 각 변형에 대한 적절한 항생제 YENB 미디어 ML. 새로운 문화 30 하룻밤 250 RPM의 회전 속도와 셰이커 ° C OD 600 값이 1.7-2.0의 범위가 될 때까지. 성장 </li><li> 측정하고 기록 OD 각각의 액체 배양 600 값을 계산기에 아래 수식을 사용각 변형에 대해 0.12의 최종 OD 600을 제공하기 위해 침투 버퍼의 50 ML에 희석 할 필요 체적 (V INF)을 ulate. V INF (ML) = (50 ML) × (0.12) / OD 600 </li><li> 전송 V microcentrifuge 관에 각 문화의 INF (ML)과 2 분 12,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 스핀 뜨는 제거하고 (10 MM MES, 산도 5.5 10 ML 침투 버퍼에 세포를 resuspend을, 10 mM의 황산 마그네슘 4) 잠시 텍싱 있습니다. </li><li> 혼합 pBYGFP + pREP110 + P19의 세포를 재 부유, 2 분 12,000 XG에서 세포를 스핀 다운, 그리고 침투 버퍼의 50 ML의 총에 resuspend을. 이 Agrobacteria 조합은 GFP의 geminiviral 표현입니다. </li><li> 마찬가지로, Agrobacteria 세포의 다음과 같은 조합을 혼합 스핀 다운 및 침투 버퍼의 50 ML에서 그들을 resuspend을. 그들은 다음을 포함한다 (1) pBYDsRed + pREP110는 DsRed의 geminiviral 표현, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110에 대한 + P19GFP와는 DsRed, (3) pREp110 GFP의 MagnICON 식 (5)에 대한 geminiviral 식의 부정적인 컨트롤과 + P19, (4) PICH-GFP + pICH15879 + pCH14011 PICH -는 DsRed + pICH15879는 +의 공동 발현 geminiviral위한 + P19 MagnICON의는 DsRed의 표현, 그리고 MagnICON 식에 대한 대조군으로 (6) pICH15879 + pCH14011에 대한 pCH14011. </li></ol> 진공 침투 2.2 준비 <ol><li> 접종과 문화 각 GV3101 50 ML 멸균 플라스크에 적절한 항생제로 YENB 미디어의 15 ML에 geminiviral 벡터 또는 MagnICON 벡터를 포함하는 변형과 성장은 하룻밤 위의 주사기 침투에 대해 설명했다. </li><li> 분광 광도계 적절한 항생제로 YENB 미디어 250 ㎖에 0.025의 시작 OD 600 새로운 문화에 대한 계대 배양 할 필요가 볼륨 (V 이하)를 계산하려면 아래 공식을 사용하여 각 액체 문화를 측정하고 기록한다 OD 600 값 . V 이하 </sub&gt; (ML) = (250 ML) × (0.025) / OD 600 </li><li> 전송 V의 하룻밤 문화의 하위 (ML) (250 - V 이하) 각 변형에 대한 적절한 항생제로 1 L 멸균 플라스크에 YENB 미디어의 ML과 하룻밤 위의 주사기 침투에 대해 설명 된 새로운 문화를 성장. </li><li> 측정하고 기록 OD 각각의 액체 배양 600 값을 각 변형에 대해 0.12의 최종 OD 600을 제공하기 위해 침투 버퍼의 3 L에 희석 할 필요 체적 (V INF)를 계산하려면 아래 공식을 사용합니다. V INF (ML) = (3000 ML) × (0.12) / OD 600 </li><li> 펠렛 및 주사기 침투에 대한 설명과 주사기 침투에 대해 설명 된 조합에 따라 재 부유 문화를 혼합으로 침투 버퍼에있는 각 문화를 Resuspend V INF (ML). Repellet 혼합 Agrobacteria 세포 침투 버퍼의 3 L에서 그들을 resuspend을. </li></ol> 3.1 주사기 침투 <ol><li> 네 6 주 이전 N. 선택 5와 benthamiana 공장은 각각의 잎. 각 공장의 상단부터 시작하는 처음 세 개의 잎은 A.의 조합 중 하나에 완전히 침투 될 것입니다 침투 버퍼의 변종을 박테 리움. 네 번째 잎이 될 것입니다 스포트 침투 geminiviral 표현을위한 네 가지 변형 조합 또는 MagnICON 식에 대한 세 가지 조합. 각 공장의 마지막 잎 부정적인 컨트롤의 조합으로 침투 될 것입니다. </li><li> 잎의 뒷면 (그림 2A)의 표피에 바늘로 작은 흠을 만듭니다. 주의 : 침투 혼합물 Agrobacteria 세포가 잎의 다른 측면에 구멍을 통과하므로, 양쪽을 통해 잎 관통하는만큼 열심히 긁히지 않도록해야합니다. </li><li> 잎의 앞면의 확고한 보류를 가지고 부드러운 적용하는 동안한 손의 엄지 손가락 닉 반대 압력, 니들 (그림 2B)이없는 주사기 닉에 침투 버퍼에있는 아그로 박테 리움 혼합물을 주입. 참고 : 아그로 박테 리움 혼합물 잎의 세포 사이 공간을 입력으로 침투 영역 (그림 2C) 눈에 띄게 어두운 녹색으로 바뀔 것이다. </li><li> 어두운 녹색 원이 확장 멈출 때까지 별명으로 아그로 박테 리움 혼합물을 주입하는 것을 계속한다. 전체 잎이 침투하고 전체 잎의 처음 세 잎 마지막 잎에는 짙은 녹색으로 점등 될 때까지 또 다른 별명 단계를 반복 3.1.2-3.1.4을 만듭니다. </li><li> 각 공장의 네 번째 잎의 경우, 모든 4 개 (geminiviral 벡터) 또는 세 (MagnICON 벡터) 조합은 그것으로 침투 될 것입니다. 아그로 박테 리움 균주의 각 조합에 대해 하나의 별명을 만들고, 하나의 조합으로 각 닉에 침투. </li><li> 침투 한 후, 성장 방 모니 식물을 다시 이동2-15일 포스트 침투 수 (dpi) 간의 토르 단백질 발현. </li></ol> 3.2 진공 침투 <ol><li> 진공 건조기와 욕조에 아그로 박테 리움 균주를 포함하는 전송 3 L 침투 버퍼에 욕조를 배치합니다. Vacuubrand 다이아 프램 진공 펌프 (그림 3A)을 데시 케이 터에 연결합니다. </li><li> 데시 케이 터 플레이트 (그림 3B)에 거꾸로 공장을 배치하고 전체 잎과 줄기 시스템은 욕조의 꼭대기 휴식 플레이트 침투 버퍼에 빠져들 때까지 식물로 판을 낮 춥니 다. 가장자리를 따라 데시 케이 O 링을 배치하고 챔버 (그림 3C)에 데시 케이 터의 뚜껑을 넣어. </li><li> 진공 펌프를 켜고 진공 100 밀리바에 도달 할 때 타이밍을 시작합니다. 천천히 물속에 잠긴 식물 조직의 틈새 공간에 Agrobacteria의 입학을 허용하는 100 mbar에 1 분 후 데시 케이 터에서 방출 밸브를 엽니 다. 이 단계를 한 책상 외에도 반복좋은 침투을 보장하기 위해 각형 시간입니다. </li><li> 침투 한 후, 데시 케이 터의 공장을 가지고 그 직립 위치에 다시 넣어. 2-15 dpi로 간 성장 방 모니터 단백질 발현에 식물을 다시 이동합니다. </li></ol> 4. 형광 단백질의 검출 및 사진 <ol><li> 어두운 방에 dpi로, 이동 공장 2에서 시작하여 소형 UV 램프로 침투 잎의 뒷면에 UV 빛을. </li><li> GFP 나는 DsRed의 붉은 형광 녹색 형광을 관찰한다. 는 DsRed는 단파 UV 빛의 밑에 강한 반면 GFP는 장파 자외선에 강한 신호를 제공합니다. </li><li> 아니 플래시 일반 디지털 카메라로 형광 잎의 사진을 가져 가라. </li><li> 관찰 또는 촬영 후 성장 방에 식물을 다시 이동합니다. </li></ol>

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저자는 아무런 재정적 이익을 경쟁 없다.

단백질 기반의 의약품에 대한 증가하는 요구는 전 세계적으로 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 새로운 생산 플랫폼을 필요로합니다. 식물은 제약 단백질 생산을위한 가장 유망한 대체 생산 시스템 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 최근 몇 년 동안, 해체 바이러스 기반 벡터의 개발은 크게 속도와 식물 발현 시스템 2,10의 수율을 향상 식물에서 단백질의 일시적인 표현을 사용?...

1970 년대 이후, 식물 재조합 단백질 및 단백질 치료제 1의 상업 생산을위한, 포유 동물 곤충 및 세균 세포 배양에 대한 대안으로 모색되고있다. 바이오 의약품의 표현을위한 식물 기반 시스템은 임상 시험에서 성공을 보여, 고셔병의 질병 2, 조류 H5N1 독감 3과 같은 질병에 대한 몇 가지 새로운 치료법으로 최근 몇 년 동안 약속을 보여 주었다. 이러한 초기 실험 이후 수십 년 동안 공장에서 재조합 단백질 발현 능력 메커니즘의 개발은 세 가지 주요 이유로 단백질 생산의 현재 패러다임을 변경하는 식물 기반 시스템의 가능성을 만들었습니다. 첫째, 포유류 곤충, 및 세균 바이오 리액터 상당한 초기 비용, 비싼 성장 매체와 하류 정화 4 복잡한 과정을 필요로 비용 주목할만한 감소가있다. 안정적인 형질 전환 식물의 생성라인은 또한 단백질 발현 식물이 재배 농업 규모 5에 수확 할 수로 다른 표현 시스템의 확장 성을 능가 할 수 있습니다. 둘째, 식물 기반의 발현 시스템은 크게 공공 안전 6 우수성을 보여주는, 인간 단백질 발현 호스트에서 사람 또는 동물 병원체 전송의 위험을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 식물은 당화와 여러 소단위 단백질 7의 조립을 포함한 단백질의 적절한 번역 후 수정을 허용하는, 포유 동물 세포와 유사한 진핵 endomembrane 시스템을 사용합니다. 이 기능은 더 복잡한 구조를 가지고 광범위한 전사 후 수정 또는 어셈블리 8가 필요 단클론 항체 (드을) 등의 제약 재조합 단백질의 넓은 수 있기 때문에, 박테리아와 같은 원핵 생물 시스템에 따라 그 앞두고 식물 기반 시스템을 넣습니다. 두 가지 주요 APPRO이 있습니다식물에서 재조합 단백질을 발현에 아파. 첫 번째는 대상 단백질 코딩 DNA가 발현 카세트에 복제 및 핵 또는 엽록체 게놈 중 하나에 도입 안정적으로 형질 전환 라인의 개발이다. 이 과정에서 외국의 DNA가 다음 세대를 통해 유전되고 지금까지 다른 발현 시스템 1을 넘어, 엄청난 확장 성이 향상 할 수 있습니다. 핵 게놈에 외래 DNA의 도입은 일반적으로 조직 9 microprojectile 폭격에 의해, 덜 자주, 식물 조직의 아그로 박테 리움 감염에 의해 달성되거나. 식물 호르몬은 그 차별화와 뿌리와 잎 같은 형질 전환 식물 조직의 성장을 유도하는 데 사용됩니다. 엽록체 게놈의 변환은 A. 달성 할 수 없다 DNA로 코팅 박테 리움하지만, 금 또는 텅스텐 입자에 전적으로 의존 식물 세포로 탄도 발사. 재조합을 표현하는 두 번째 방법은식물 NT 단백질은 과도 표현을 통해 10입니다. 이 시나리오에서, 관심의 유전자를 품고 바이러스 유래 벡터는 A. 통해 전달됩니다 과정을 통해 완전히 개발 식물 박테 리움은 agroinfiltration을했다. 대신에 식물의 게놈에 통합으로, 전달 된 유전자 구조는 짧은 잠복기 후 수확하고 분리 할 수​​ 있습니다 원하는 단백질의 과도 생산을 지시하기 시작합니다. 식물 agroinfiltration 11 후 약 1-2 주를 수확 할 준비가 일시적인 유전자 발현은 큰 전체 단백질 축적뿐만 아니라 단백질의 생산 시간을 단축의 이점을 제공합니다. 이 1 년 몇 개월이 걸릴 수있는 안정적인 형질 전환 식물 라인의 생성, 선택 및 확인 프로세스보다 훨씬 빠릅니다. 이 유전자 안정적인 공장 리튬을 얻을하지 않으므로 그러나, 이것은 또한 일시적인 발현 시스템의 한계입니다대규모 상업 생산을위한 종자 은행을 생성 할 수 있습니다 NES. 그럼에도 불구하고, 접근 방식은 대규모의 일시적 발현을 개선하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 우리는 A.에 의해 전달 해체 바이러스 벡터를 사용하여 과도 단백질 발현은 Nicotiana benthamiana 공장의 생성하는 한 가지 방법을 보여 박테 리움. 두 가지 주요 방법은 A.의 배달을 위해 개발되고있다 식물 조직에 박테 리움 : 진공 챔버를 통해 주사기와 대규모 침투를 통해 벤치 스케일 침투. 두 프로토콜은 N.를 사용하여 여기에 설명되어 있습니다 밀접 일반 담배 공장과 관련된 benthamiana, 두 형광 단백질의 과도 발현 기주 식물로 : 해파리 Aequorea 빅토리아 Discosoma 산호 (는 DsRed) 12,13에서 붉은 형광 단백질의 녹색 형광 단백질 (GFP). N. benthamiana에 대한 가장 일반적인 호스트 식물그것은 유전자 변형 의무가 있기 때문에 재조합 단백질은 빠르게 바이오 매스의 높은 금액을 산출하고, 스케일 업 생산 14 다작 종자 생산자 수 있습니다. N. 사용의 또 다른 이점 단백질 발현을위한 호스트로 benthamiana는 발현 벡터 2.5의 다양한 가용성이다. 본 연구에서는 두 해체 바이러스 성 벡터, 담배 모자이크 바이러스 (TMV) RNA의 replicon 시스템 (MagnICON 벡터)와 빈 노란색 난쟁이 바이러스 (BeYDV) DNA의 replicon 시스템 (geminiviral 벡터) 4,11에서 파생 된 다른 기준으로 한 15-18는 GFP와는 DsRed 유전자를 운반 N.에 그들을 제공하는 데 사용됩니다 A. 통해 benthamiana 세포 박테 리움. 세 DNA의 구조는 GFP 또는 MagnICON 벡터와는 DsRed 표현에 사용됩니다. 그들은 관심의 유전자를 포함하는 모듈 (PICH 5 &#39;대상 유전자 3의 발현 운전 발기인 및 기타 유전 적 요소를 포함하는 모듈 (pICH15879)&#39;을 포함- GFP 또는 PICH-는 DsRed) 및 integrase 모듈 (pICH14011)는 expression 8,15에 5 &#39;와 3&#39;모듈을 함께를 통합하는 효소를 코딩. 세 DNA의 구조는 geminiviral 벡터를 표현 필요합니다. 표적 유전자 (pBYGFP 또는 pBYDsRed)의의 replicon를 포함하는 벡터뿐만 아니라, 복제 단백질 (pREP110)에 대한 코딩 벡터는 대상의 replicon 11,14,16의 증폭이 필요합니다. 또한, 토마토 덤불 스턴트 바이러스에서 침묵 억압 P19 인코딩 벡터의 포함은 높은 수준의 목표 유전자의 발현 11,16 위해 원하는. 식물의 성장, A. 등 agroinfiltration에 의해 식물 세포에 재조합 단백질의 유전자의 도입을위한 세 가지 주요 단계는 일반적으로있다 박테 리움 문화 준비 및 침투. 각 단계마다이 절차의 궁극적 인 성공에 중요한이기 때문에, 따라서 자세한 설명이 제공됩니다주사기 침투 아래 진공 침투 모두.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V353-20</td>
			<td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> See reference: Lico and Chen, et al 2008</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632152</td>
			<td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> See reference: Baird and Zacharias, et al 2000</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MagnICON Vector</td>
			<td>Icon Genetics</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Geminiviral Vector</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Chen and He, et al 2011</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>N. benthamiana</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Lai and Chen 2012</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Carbenicillin-100, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0418</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Kanamycin-50, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0543</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium sulfate hepa hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773-500 g</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difco Nutrient Broth</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 234000</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MES hydrate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-1kg</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1613-1ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70560-51-9</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's Fertilizer</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Jul-25</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuubrand MD4 Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-878-113</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuum Air Regulator Valve</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386590</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Desiccator 12 1/8" with O ring</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-594-15C </td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>3 L Tub</td>
			<td>Rubber-Maid</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>plate/shelf 230ML</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9489269</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peat Pellet</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-2370-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagation Tray Dome</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>132052</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagaiton Tray</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>138758</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Virbo Hand Seeder</td>
			<td>Gro-Mor INC</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank">www.gro-morent.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flora Cart 4 shelf</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>65-6924-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Round Bottom Culture Tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430172-500EA</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>223-9950</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>166-0602EDU</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator/Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank">www.eppendorf.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultraviolet Light Model#: UVGL-25</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0021-12</td>
			<td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins

포유류 세포 배양 인간 백신과 치료 단백질의 상업 생산을위한 주요 플랫폼입니다. 그러나, 제한된 확장 성 및 높은 비용으로 인해 의약품에 대한 증가하는 세계적 수요를 충족 할 수 없습니다. 식물은 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 가장 유망한 대체 의약품 생산 플랫폼 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 바이러스 기반 벡터의 최근 발전은 식물에서 재조합 단백질의 신속하고 높은 수준의 일시적인 표현을 허용했다. 또한 과도 발현 시스템의 유틸리티를 최적화하기 위해, 우리는이 연구에서 식물 조직에 표적 유전자가 포함 아그로 박테 리움을 소개하는 간단하고 효율적이며 확장 가능한 방법을 보여줍니다. GFP와는 DsRed, 우리의 결과는 방법은 잎 두 형광 단백질의 강력한 생산에 아그로 박테 리움의 효율적인 도입에 성공 주사기, 진공 모두에 해당 agroinfiltration을 나타냅니다. 또한,우리는 두 가지 방법으로 제공하는 독특한 장점을 보여줍니다. 주사기 침투가 간단하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다. 또한 유연성 하나 표적 유전자의 전체 휴가를 침투하거나 하나의 잎에 여러 대상의 유전자를 도입 할 수 있습니다. 따라서,이 재조합 단백질의 실험실 규모의 발현뿐만 아니라 수확량 또는 식 속도론에 대해 서로 다른 단백질이나 벡터를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 주사기 침투의 단순함은 생명 공학의 주제에 대한 고등학교와 대학 교육의 실용성을 제안한다. 반면, 진공 침투는 더 강력하고 제약 단백질의 상업적 제조를위한 스케일 업 할 수 있습니다. 그것은 또한 양상추와 애기 장대와 같은 주사기 침투에 대한 의무가없는 식물 종을 agroinfiltrate 할 수 있다는 장점을 제공합니다. 전반적으로, 주사기 및 진공 agroinfiltration의 조합은 연구자와 교육자를 제공하는, 간단하고 효율적이며 강력한과도 단백질 발현을위한 방법론. 그것은 크게 제약 단백질의 개발을 촉진하고 과학 교육을 추진합니다.

1. 주사기 침투에 의한 형광 단백질의 발현 geminiviral 및 MagnICON - - N.의 두 가지 해체 식물 바이러스 벡터에 의해 - GFP와는 DsRed - 식물 조직에 아그로 박테 리움의 주사기 침투의 효과를 입증하기 위해, 우리는 두 개의 형광 단백질의 발현을 테스트 benthamiana. N.위한 전체 Agrobacteria 포함 geminiviral 벡터로 침투했다 benthamiana 잎, GFP 발현은 빠르면 2와 d...

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Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근 방법을보고<em&gt; 아그로 박테 리움</em&gt; 단백질의 과도 발현 식물에.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

48.4K 조회수.  Arizona State University. 식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근 방법을보고 아그로 박테 리움 단백질의 과도 발현 식물에.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Methylotrophic 효모에서 재조합 단백질의 표현 Pichia pastoris의</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

의 발현에 대한 헬라 세포를 기반으로 무료 발현 시스템<em&gt; 변형체</em&gt; Rhoptry 단백질

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...