Agradecemos R. Sun e outros estudantes do laboratório de Chen por sua contribuição para usina de geração de material. Agradecemos também a Dr. D. Green por seu apoio de pesquisa de graduação na Faculdade de Tecnologia e Inovação (CTI). Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo NIH concede U01 AI075549 e 1R21AI101329 para Q. Chen, e uma bolsa de SSE de CTI do Arizona State University para Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, e J. Stahnke são estudantes de graduação apoiados pela concessão SSE.

1. O crescimento das plantas <ol><li> Lugar de 60 de turfa pelotas em uma bandeja de propagação. Adicionar 4 L de água da torneira e deixar a turfa pelotas de absorver a água por 2 horas. </li><li> Adicionar 2 N. benthamiana sementes em cada pastilha de turfa utilizando um semeador, cobrir a bandeja com uma cúpula de plástico transparente, e permitir que elas germinam num ° C, 84% de humidade ambiente de 25 com um ciclo de dia / noite de 16/8 horas (Figura 1A). </li><li> Remover a cúpula de duas semanas após a sementeira, drenar a água da bandeja, e adicionar 2 L de fertilizante de Jack a uma concentração de 1,48 g / L (Figura 1B). Continuar a crescer as plantas numa ° C, 50% de humidade ambiente de 25 horas com um ciclo de dia / noite de 16/8. Fornecimento 2 L de fertilizante de Jack a cada 2 dias por bandeja. </li><li> Na semana 4, transferir as plantas com turfa peletes para uma nova bandeja que hospeda seis plantas para proporcionar um espaço adequado para o crescimento (Figura 1C) até que eles estão prontos para ser infiltrado com 6 semanas de idade (Figura1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Cultura Preparação 2.1 Preparação para a infiltração Seringa <ol><li> Streak A. tumefaciens GV3101 estirpes contendo os vectores geminiviral p19, pREP110, pBYGFP pBYDsRed, e em placas de agar LB contendo canamicina (100 ng / ml). Causadas por uma estirpe de placa e crescer a 30 ° C durante 48 horas. </li><li> Da mesma forma, causadas e crescer estirpes GV3101 albergando os vectores MagnICON do 5 &#39;do módulo (pICH15879), a 3&#39; do módulo que contém o gene alvo de DsRed ou GFP (Pich-GFP ou Pich-DsRed) e da integrase (pCH14011) em LB agar placas contendo carbenicilina (100 ug / ml). </li><li> A partir de uma única colónia na placa de agar LB, inocular estirpes GV3101 abrigando vectores geminiviral em 3 ml de meio YENB (0,75% de extracto de levedura Bacto, 0,8% Nutrient Broth, ajustar o pH para 7,5 com NaOH) + canamicina (100 ng / ml) em um tubo ml de cultura de fundo redondo de 15, cultivar a cultura líquida, a 30 ° C emnum agitador durante a noite com uma taxa de rotação de 300 rpm. </li><li> Da mesma forma, e inocular crescer estirpes GV3101 abrigando vectores MagnICON em meios YENB + carbenicilina (100 ug / ml) num agitador durante a noite a 30 ° C. </li><li> OD valores medir e registrar 600 para cada cultura líquido com um espectrofotômetro e utilizar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V sub) para ser repicadas para uma nova cultura com uma OD de partida 600 de 0.025 em 10 ml de mídia YENB com os antibióticos apropriados . Sub V (mL) = (10 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Transferência V sub (ml) da cultura durante a noite a (10 - sub V) ml de meio YENB com os antibióticos apropriados para cada estirpe. Crescer a nova cultura durante a noite a 30 ° C num agitador com uma velocidade de rotação de 250 rpm, até o valor de DO 600 está na gama de 1,7-2,0. </li><li> Meça e registre OD 600 valores para cada cultura líquido e usar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V inf) para ser diluído em 50 ml de tampão de infiltração para se obter um OD final de 600 de 0,12 para cada estirpe. Inf V (mL) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Transferência V inf (ml) de cada cultura para um tubo de microcentrífuga e girar as células por centrifugação a 12.000 xg durante 2 minutos, em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de tampão de infiltração (MES 10 mM, pH 5,5; MgSO 10 mM 4) em vortex brevemente. </li><li> Misturar as células ressuspensas de pBYGFP pREP110 + + p19, rodar para baixo as células a 12.000 xg durante 2 minutos, e ressuspender em total de 50 ml de tampão de infiltração. Esta combinação de Agrobacterium é geminiviral para expressão da GFP. </li><li> Do mesmo modo, misturar as seguintes combinações de células de Agrobacterium, girar e ressuspender-los em 50 ml de tampão de infiltração. Eles incluem: (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 para a expressão geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 geminiviral por co-expressão da GFP e DsRed, (3) pREp110 + p19 como controlo negativo de expressão geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 MagnICON para a expressão de GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 para a expressão MagnICON de DsRed, e (6) pICH15879 + pCH14011 como controle negativo para a expressão MagnICON. </li></ol> 2.2 Preparação para a infiltração a vácuo <ol><li> Após a inoculação, a cultura de cada estirpe GV3101 contendo vectores ou vectores geminiviral MagnICON em 15 ml de meio YENB com antibióticos apropriados em um frasco de 50 ml e autoclavado a crescer durante a noite como descrito acima para a seringa de infiltração. </li><li> OD valores medir e registrar 600 para cada cultura líquido com um espectrofotômetro e utilizar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V sub) para ser repicadas para uma nova cultura com uma OD de partida 600 de 0.025 em 250 ml de mídia YENB com os antibióticos apropriados . V sub </sub&gt; (Ml) = (250 ml) x (0,025) / OD 600 </li><li> Transferência V sub (ml) da cultura durante a noite a (250 - V sub) mL de meio YENB num balão de 1 L autoclavado com os antibióticos apropriados para cada estirpe e crescer uma nova cultura durante a noite como descrito acima, para a infiltração de seringa. </li><li> Medir e registar valores de OD 600 de cada líquido de cultura e utilizar a seguinte fórmula para calcular o volume necessário (V inf) para ser diluído em 3 L de tampão de infiltração para se obter um OD final de 600 de 0,12 para cada estirpe. Inf V (mL) = (3000 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Ressuspender o sedimento e V inf (ml) de cada cultura em tampão de infiltração, tal como descrito para a infiltração de seringa e misturar as culturas ressuspensas de acordo com as combinações descritas para a infiltração de uma seringa. Repellet Agrobacteria as células mistas e ressuspender-los em 3 L de tampão de infiltração. </li></ol> 3.1 Seringa Infiltração <ol><li> Escolha quatro de 6 semanas de idade N. benthamiana plantas com folhas de 5 cada. As três primeiras folhas de contagem a partir do topo de cada planta vai ser infiltrada inteiramente com uma das combinações de A. tumefaciens estirpes em tampão de infiltração. A quarta folha será spot-infiltrada com todas as quatro combinações de tensão para a expressão geminiviral ou três combinações de expressão MagnICON. A última folha de cada planta será infiltrada com combinações de controles negativos. </li><li> Criar uma pequena incisão com uma agulha na epiderme, no lado de trás da folha (Figura 2A). Atenção: certifique-se de modo a não arranhar duro como para perfurar a folha através de ambos os lados, tal como as células de Agrobacterium na mistura infiltração irá passar através do furo para o outro lado da folha. </li><li> Tome um firme do lado da frente da folha e ao aplicar suavecontrapressão para o entalhe com o polegar de uma mão, injecta-se as misturas de Agrobacterium, em tampão de infiltração no entalhe com uma seringa sem agulha (Figura 2B). Nota: A mistura de Agrobacterium entra no espaço intercelular da folha, a área infiltrada ficará visivelmente mais escura verde (Figura 2C). </li><li> Continuar a injectar as misturas Agrobacterium no nick até que o círculo verde mais escuro pára de se expandir. Criar outro nick e repita os passos 3.1.2-3.1.4 até que toda a folha é infiltrada e toda a folha fica verde mais escuro para as três primeiras folhas ea última folha. </li><li> Para a quarta folha de cada planta, todas as combinações de quatro geminiviral (vector) ou três (MagnICON vector) serão infiltrados nela. Faça um nick para cada combinação de cepas de Agrobacterium, e se infiltrar cada nick com uma combinação. </li><li> Após a infiltração, mova plantas de volta para a sala de crescimento e moniexpressão da proteína tor entre 2-15 dias após a infiltração (dpi). </li></ol> 3.2 Vacuum Infiltração <ol><li> Depositar uma banheira num exsicador de vácuo e de transferência 3 tampão de infiltração L contendo as estirpes de Agrobacterium para a banheira. Ligue o exsicador de vácuo a uma bomba de diafragma Vacuubrand (Figura 3A). </li><li> Coloque uma planta de cabeça para baixo sobre a placa exsicador (Figura 3B) e baixar a placa com a planta, até que todo o sistema de folha e caule é submerso no tampão de infiltração com a placa que descansam sobre a cuba. Coloque o secador O anel ao longo da borda e coloque a tampa do secador na câmara (Figura 3C). </li><li> Ligar a bomba de vácuo e iniciar a contagem, quando o vácuo atinge 100 mbar. Lentamente abrir a válvula de libertação no exsicador após 1 min a 100 mbar para permitir a entrada de Agrobacterium para dentro dos espaços intersticiais do tecido da planta submersa. Repita este passo um additional tempo para garantir uma boa infiltração. </li><li> Após infiltração, levar a planta para fora do secador e colocá-lo de volta à sua posição vertical. Mover as plantas de volta para a sala de crescimento e expressão da proteína do monitor entre 2-15 dpi. </li></ol> 4. Proteína fluorescente de detecção e Fotografia <ol><li> A partir de 2 dpi, as plantas se movem em quarto escuro e brilhar a luz UV na parte de trás das folhas infiltradas com uma lâmpada UV de mão. </li><li> Observar a fluorescência verde de GFP ou a fluorescência vermelha de DsRed. GFP emite um sinal mais forte com o tempo de luz UV de ondas, enquanto DsRed é mais forte sob luz ultravioleta de onda curta. </li><li> Tire fotos de folhas fluorescentes com uma câmera digital comum, sem flash. </li><li> Mover as plantas de volta para a sala de crescimento após a observação ou fotografia. </li></ol>

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Os autores não competindo interesses financeiros.

A crescente demanda por produtos farmacêuticos à base de proteínas em todo o mundo exigem novas plataformas de produção que são robustas, escaláveis ​​e de baixo custo e segura. As plantas têm demonstrado ser um dos sistemas de produção alternativos mais promissores para a produção de proteínas farmacêuticas. Em anos recentes, o desenvolvimento de vectores baseados em Desconstruído vírus permitiu a expressão transitória de proteínas em plantas, o que aumenta grandemente a velocidade e o rendimento...

Desde os anos 1970, as plantas foram explorados como alternativas a culturas de células de mamíferos, insectos, bactérias e para a produção comercial de proteínas recombinantes e uma proteína terapêutica. Sistemas à base de plantas para a expressão de biofármacos têm se mostrado promissor nos últimos anos, vários novos tratamentos para doenças, como a doença de Gaucher 2 e 3 da gripe aviária H5N1, têm demonstrado sucesso em ensaios clínicos. O desenvolvimento de mecanismos competentes para a expressão de proteínas recombinantes em plantas nas décadas desde os primeiros experimentos criou o potencial para sistemas à base de plantas para alterar o paradigma atual de produção de proteína por três razões principais. Em primeiro lugar, há uma diminuição notável do custo como bioreactores de mamíferos, insectos, bactérias e exigem custos consideráveis ​​de arranque, meios de cultura caros e processos complicados para a purificação a jusante 4. A criação de planta transgênica estávellinhas também lhes permite superar a escalabilidade de outros sistemas de expressão como plantas que expressam proteínas poderiam ser cultivadas e colhidas em escala agrícola 5. Em segundo lugar, os sistemas de expressão à base de plantas reduzem significativamente o risco de transmissão de um agente patogénico humano ou animal, a partir do hospedeiro que expressa a proteína para os seres humanos, demonstrando a superioridade em segurança pública 6. Por fim, as plantas utilizam um sistema endomembranar eucariota que é semelhante à de células de mamífero, permitindo a correcta modificação pós-tradução, incluindo a glicosilação de proteínas e o conjunto de proteínas de várias subunidades 7. Esta capacidade coloca sistemas baseados em plantas antes de aqueles baseados em sistemas procariotas, tais como bactérias, uma vez que um número maior de proteínas recombinantes farmacêuticos, incluindo os anticorpos monoclonais (mAbs), tem uma estrutura complicada e requer extensas modificações pós-tradução ou de montagem 8. Existem dois grandes adedores de expressar proteínas recombinantes em plantas. O primeiro é o desenvolvimento de uma linha transgénica de forma estável, onde o ADN que codifica para a proteína alvo é clonado em uma cassete de expressão e introduzido tanto o genoma nuclear ou do cloroplasto. Ao fazer isso, o DNA estranho se torna hereditário através de gerações sucessivas e permite tremendamente melhorado escalabilidade, além de outros sistemas de expressão 1. A introdução de ADN exógeno no genoma nuclear é geralmente conseguido por infecção por Agrobacterium tumefaciens de tecido de planta ou, menos frequentemente, por bombardeamento de microprojécteis de tecido 9. Hormonas de plantas são depois utilizados para induzir a diferenciação e o crescimento de tecido de planta transgénica como raízes e folhas. A transformação do genoma do cloroplasto não pode ser conseguido com A. tumefaciens, mas depende inteiramente de partículas de ouro ou tungstênio revestidas com DNA demitido balisticamente em células vegetais. O segundo método de expressar recombinaçãont proteína em plantas é através da expressão transitória 10. Neste cenário, os vetores de vírus derivados abrigando o gene de interesse são entregues via A. tumefaciens para plantas totalmente desenvolvidas através de um processo chamado agroinfiltration. Em vez de integração no genoma da planta, a construção de gene entregue começará então a dirigir a produção transiente da proteína desejada, que pode ser colhida e isolado após um curto período de incubação. A expressão do gene transitório oferece a vantagem de uma maior acumulação de proteína total, bem como um tempo melhorado de produção de proteínas, como as plantas estarão prontas para a colheita, aproximadamente 1-2 semanas após agroinfiltration 11. Isto é significativamente mais rápido do que os processos de produção, selecção e confirmação de linhas de plantas transgénicas estáveis, o que pode levar vários meses a um ano. Isto, no entanto, é também a limitação do sistema de expressão transitória, uma vez que não irá produzir geneticamente estável planta line que podem ser usados ​​para gerar um banco de sementes para a produção comercial em grande escala. Apesar disso, as abordagens têm sido desenvolvidos para melhorar a expressão transiente em larga escala. Aqui demonstramos um método de geração de proteínas expressam plantas de Nicotiana benthamiana transitórios utilizam vetores virais desconstruídas entregues pela A. tumefaciens. Existem dois métodos principais estão a ser desenvolvidos para a entrega de A. tumefaciens em tecido vegetal: banco de infiltração escala via seringa e infiltração em larga escala via câmara de vácuo. Ambos os protocolos são descritos aqui, usando N. benthamiana, que está intimamente relacionada com a planta do tabaco comum, como a planta hospedeira para expressão transitória de duas proteínas fluorescentes: a proteína verde fluorescente (GFP) de água-viva Aequorea victoria ea proteína fluorescente vermelha de Discosoma coral (DsRed) 12,13. N. benthamiana é a planta hospedeira mais comum paraproteína recombinante porque é susceptível à transformação genética, podem produzir quantidades elevadas de biomassa rapidamente, e é um produtor de sementes para a produção prolífica aumento de escala 14. Outra vantagem do uso de N. benthamiana como hospedeiros para a expressão da proteína é a disponibilidade de uma variedade de vectores de expressão de 2,5. Neste estudo, dois vetores virais desconstruídas, uma baseada em um vírus do mosaico do tabaco (TMV) RNA sistema replicon (vetores MagnICON) eo outro derivado do vírus anã amarela feijão (BeYDV) sistema replicon DNA (vetores geminiviral) 4,11, 15-18, são usados ​​para transportar o gene GFP e DsRed e entregá-los em N. células benthamiana via A. tumefaciens. três construções de DNA serão utilizados para GFP ou com vectores de expressão DsRed MagnICON. Eles incluem &quot;módulo (pICH15879) contendo o promotor e outros elementos genéticos para a condução da expressão do gene alvo, a 3 &#39;do módulo 5 que contém o gene de interesse (Pich-GFP ou Pich-DsRed), e o módulo de integrase (pICH14011) que codifica para uma enzima que integra a 5 &#39;e 3&#39; módulos juntos após expressão 8,15. Três construções de DNA também são necessários para a expressão com vetores geminiviral. Em adição a vectores que contêm o replicão do gene-alvo (ou pBYGFP pBYDsRed), um vector que codifica para a proteína de replicação (pREP110) é necessária para a amplificação do alvo replicão 11,14,16. Além disso, a inclusão de um vector que codifica para o silenciamento p19 supressor de tomate espesso vírus duplos é desejado para a expressão do gene alvo de elevado nível de 11,16. Em geral, há três passos principais para a introdução de genes de proteínas recombinantes em células de plantas por agroinfiltration incluindo o crescimento das plantas, A. tumefaciens cultura de preparação, e a infiltração. Como cada passo é crítico para o sucesso final deste procedimento, por conseguinte, uma descrição detalhada de cada uma é fornecidatanto para a infiltração seringa e infiltração por vácuo abaixo.

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			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V353-20</td>
			<td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> See reference: Lico and Chen, et al 2008</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632152</td>
			<td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> See reference: Baird and Zacharias, et al 2000</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MagnICON Vector</td>
			<td>Icon Genetics</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Geminiviral Vector</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Chen and He, et al 2011</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>N. benthamiana</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Lai and Chen 2012</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Carbenicillin-100, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0418</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Kanamycin-50, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0543</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium sulfate hepa hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773-500 g</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difco Nutrient Broth</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 234000</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MES hydrate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-1kg</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1613-1ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70560-51-9</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's Fertilizer</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Jul-25</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuubrand MD4 Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-878-113</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuum Air Regulator Valve</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386590</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Desiccator 12 1/8" with O ring</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-594-15C </td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>3 L Tub</td>
			<td>Rubber-Maid</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>plate/shelf 230ML</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9489269</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peat Pellet</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-2370-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagation Tray Dome</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>132052</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagaiton Tray</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>138758</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Virbo Hand Seeder</td>
			<td>Gro-Mor INC</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank">www.gro-morent.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flora Cart 4 shelf</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>65-6924-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Round Bottom Culture Tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430172-500EA</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>223-9950</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>166-0602EDU</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator/Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank">www.eppendorf.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultraviolet Light Model#: UVGL-25</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0021-12</td>
			<td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins

Cultura de células de mamífero é a plataforma principal para a produção comercial de vacinas humanas e proteínas terapêuticas. No entanto, ele não pode atender à crescente demanda mundial por produtos farmacêuticos, devido à sua escalabilidade limitada e de alto custo. As plantas têm demonstrado ser uma das plataformas de produção farmacêuticos alternativos mais promissores que são robustas, adaptar, de baixo custo e segura. O recente desenvolvimento de vectores baseados em vírus, permitiu a expressão transiente rápida e de alto nível de proteínas recombinantes em plantas. Para optimizar ainda mais a utilidade do sistema de expressão transitória, que demonstram uma metodologia simples, eficiente e de adaptar a introdução do gene alvo contendo de Agrobacterium para o tecido vegetal neste estudo. Os nossos resultados indicam que tanto a seringa agroinfiltration com vácuo e métodos têm como resultado a introdução eficiente de Agrobacterium em folhas e robusta de produção de duas proteínas fluorescentes; GFP e DsRed. Além disso,que demonstram as vantagens únicas oferecidas pelos dois métodos. Infiltração seringa é simples e não precisa de equipamentos caros. Ele também permite a flexibilidade, quer se infiltrar toda a licença com um gene alvo, ou a introdução de genes de múltiplos alvos em uma folha. Assim, ele pode ser usado para a expressão à escala laboratorial de proteínas recombinantes, bem como para a comparação de diferentes proteínas ou vectores para a cinética de produção ou expressão. A simplicidade de infiltração seringa também sugere a sua utilidade no ensino médio e educação superior para o tema da biotecnologia. Em contraste, a infiltração por vácuo é mais robusto e pode ser dimensionada e para produção comercial de proteínas farmacêuticas. Também apresenta a vantagem de ser capaz de agroinfiltrate espécies de plantas que não são passíveis de seringa infiltração tais como a alface e Arabidopsis. Em geral, a combinação de uma seringa e agroinfiltration vácuo fornece investigadores e formadores de uma simples, eficiente e robustametodologia para a expressão da proteína transiente. Vai facilitar muito o desenvolvimento de proteínas farmacêuticas e promover a educação científica.

1. Expressão de proteínas fluorescentes por infiltração Seringa Para demonstrar a eficácia da seringa infiltração de Agrobacterium para o tecido vegetal, testou-se a expressão das duas proteínas fluorescentes - GFP e DsRed - por dois vectores virais diferentes de plantas Desconstruído - geminiviral e MagnICON - em N. benthamiana. Para N. benthamiana folhas que foram completamente infiltrados com Agrobacteria geminiviral vectores contendo, a express?...

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Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo contendo<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Em plantas para a expressão transiente da proteína.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

47.7K visualizações.  Arizona State University. Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo contendo Agrobacterium Em plantas para a expressão transiente da proteína.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Transformação transitória de plantas de cacau em plantas de cacau usando Agrobacterium tumefaciens

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation rely on the use of Agrobacterium-mediated transformation. However, the protocols currently in use are standardized for small-sized plants due to the physical and economic constraints of submitting large-sized plants to a vacuum treatment. This work presents an effective protocol for localized vacuum-based agroinfiltration customized for large-sized plants. To assess the efficacy of the proposed method, we tested its use in cacao plants, a tropical plant species recalcitrant to genetic transformation. Our protocol allowed applying up to 0.07 MPa vacuum, with repetitions, to a localized aerial part of cacao leaves, making it possible to force the infiltration of Agrobacterium into the intercellular spaces of attached leaves. As a result, we achieved the Agrobacterium-mediated transient in planta transformation of attached cacao leaves expressing for the RUBY reporter system. This is also the first Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao. This protocol would allow the application of the vacuum-based agroinfiltration method to other plant species with similar size constraints and open the door for the in planta characterization of genes in recalcitrant woody, large-size species.

Autor em destaque: Transformação mediada por agrobacterium livre de cultura de tecidos em grandes plantas lenhosas

Here, we present the first protocol for localized vacuum infiltration for in vivo studies of the genetic transformation of large-sized plants. Using this methodology, we achieved for the first time the Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao.

Agroinfiltração Forçada a Vácuo para Transformação In planta de Plantas Recalcitrantes: Cacau como Estudo de Caso

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...