Questo è un protocollo di cristallizzazione progettato per ottimizzare la crescita di un cristallo proteico mentre allo stesso tempo deriva la proteina con una molecola di fase per determinare la struttura di una proteina mediante cristallografia a raggi X. Per determinare la struttura cristallina a raggi X di una proteina completamente nuova, le condizioni di cristallizzazione sono ottimizzate per produrre cristalli di qualità. Nel caso di una proteina completamente nuova, gli atomi pesanti devono essere introdotti nel cristallo per produrre un cristallo derivatizzato.
I dati di diffrazione dei raggi X vengono raccolti dal cristallo derivatizzato e devono essere risolti computazalmente per produrre una struttura cristallina a raggi X. Cristallizzazione e derivitizzazione sono entrambi processi laboriosi. Per affrontare queste strozzature, abbiamo ideato una procedura di screening ottimizzata che contemporaneamente raggiunge entrambi questi obiettivi.
Questo protocollo utilizza una tecnica precedentemente sviluppata nota come screening casuale della matrice di microseed. Cristalli o precipitato cristallino vengono frantumati in microseedi che possono essere utilizzati per iniziare la crescita cristallina in condizioni completamente indipendenti. Allo stesso tempo, introduciamo una molecola di fase chiamata I3C nella condizione di cristallizzazione.
Questa molecola fornisce un grande segnale anomalo che permette alla struttura di essere risolta da una singola lunghezza d'onda anomica di discussione graduale. Per gli utenti che non hanno familiarità con il dimensionamento sperimentale delle strutture cristalline presentiamo una pipeline software intuitiva per automatizzare parzialmente la soluzione di struttura adattandosi per utilizzare il segnale anomalo di I3C. Il primo passo è creare un magazzino I3C.
Misurare 120 milligrammi di I3C in un tubo di microcentrifugo. Aggiungere 200 microlitri di due idrossido di litio molare al tubo del microcentrifugo. Il riscaldamento del tubo a 40-60 gradi e il vortice possono essere utilizzati per incoraggiare la dissoluzione.
L'unico stock molare di soluzione di litio I3C dovrebbe essere marrone. Due metodi possono essere utilizzati per introdurre I3C allo stock proteico. Litio I3C può essere aggiunto direttamente allo stock proteico.
3,75 microlitri a 30 microlitri di I3C possono essere aggiunti a 150 microlitri di proteine per dare una concentrazione compresa tra cinque e 14 millimolari. Alcune proteine possono precipitare a contatto con alte concentrazioni di I3C. In questi casi, il litio I3C può essere aggiunto a un tampone di diluizione proteica che è tampone abbinato alla proteina campione a una concentrazione finale compresa tra 10 e 80 millimolare.
Aggiungere 150 microlitri del tampone di diluizione proteica a 150 microlitri di campione proteico. Una sonda di vetro per schiacciare i cristalli è realizzata con una pipetta Pasteur in vetro. Con un bruciatore Bunsen sulla fiamma blu, scaldare la pipetta Pasteur verso il centro.
Utilizzando un paio di pinzette, estrarre le estremità della pipetta Pasteur in un diametro sottile inferiore a 0,3 millimetri. Tenere quel segmento nella fiamma per separare la pipetta a questo punto e arrotondare l'estremità della pipetta per completare la sonda di vetro. Questo è un esempio di come dovrebbe apparire la pipetta di vetro.
Le frane di cristallo potrebbero anche essere ordinate da fornitori di terze parti in alternativa alla creazione del proprio stock di microseed A generato schiacciando cristalli proteici o precipitati cristallini. Posizionare cinque tubi di microcentrifugo da 1,5 ml sul ghiaccio. Al microscopio leggero, selezionare i migliori cristalli morfologici o precipitati cristallini che possono essere sacrificati.
Per 96 vassoi di cristallizzazione del pozzo aprire il pozzo tagliando il nastro di tenuta in plastica. Per appendere i vassoi di caduta, lo scivolo del coperchio può essere rimosso utilizzando una pinzetta e invertito su una superficie piana. Trasferire 70 microlitri di soluzione di serbatoio in uno dei tubi di microcentrifugo e raffreddare sul ghiaccio.
Ai tubi rimanenti, trasferire 90 microlitri di soluzione di serbatoio ad esso e tornare al ghiaccio per raffreddare. Se il volume insufficiente del serbatoio è presente, il serbatoio di cristallizzazione può essere effettuato mescolando i reagenti appropriati e può essere utilizzato. Agitare i cristalli nella goccia di cristallizzazione usando la sonda di vetro schiacciarla accuratamente.
I progressi possono essere monitorati al microscopio fino a quando non sono visibili cristalli o materiale cristallino. Trasferire tutto il liquido dalla goccia al tubo di microcentrifugo contenente 70 microlitri di soluzione di serbatoio. Mescolare pipettando su e giù.
Trasferire da due a tre microlitri di miscela al pozzo e risciacquare il pozzo tubazione su e giù. Trasferire la miscela nel tubo di microcentrifugo. Questo passaggio di risciacquo deve essere ripetuto ancora una volta.
Il tubo di microcentrifugo deve essere tenuto freddo da questo punto in avanti per evitare la fusione dei microseedi. Vortice il tubo alla massima velocità a quattro gradi per circa tre minuti raffrecciando regolarmente il tubo sul ghiaccio per evitare il surriscaldamento. effettuare una diluizione seriale su 10 del patrimonio di semi trasferendo in sequenza 10 microlitri tra le soluzioni del serbatoio refrigerato.
Tra le diluizioni dello stock di semi, il tubo deve essere vortice. Le scorte di semi che non verranno utilizzate immediatamente, devono essere conservate in un congelatore ultra freddo meno 80 gradi. Uno schermo a matrice di microseed ben casuale può essere impostato utilizzando un robot di erogazione del liquido.
Posizionare lo stock di semi, la soluzione di stock proteico integrata con I3C e lo schermo di cristallizzazione nel robot. Utilizzando il robot trasferire 75 microlitri dallo schermo di cristallizzazione al vassoio del pozzo 96. Aggiungere un microlitro alla goccia di cristallizzazione e 74 microlitri al serbatoio.
Trasferire un microlitro di proteine integrato con I3C alla goccia di cristallizzazione. Trasferire 0,1 microlitri di materiale di semi alla goccia di cristallizzazione. Sigillare la piastra utilizzando nastro adesivo.
Gli schermi a goccia appesi possono essere impostati in 24 vassoi di cristallizzazione a goccia ben appesi. Ungere i bordi dei pozzi di caduta appesi. Trasferire 500 microlitri di soluzione di cristallizzazione nel serbatoio.
Vicino al centro di uno scivolo di copertura in vetro posizionare una goccia di microlitro di soluzione di cristallizzazione. A questa goccia, aggiungere un microlitro di proteine integrato con litio I3C e 0,1 microlitri di stock di semi. Invertire lo scivolo del coperchio e sigillare bene la cristallizzazione spingendo il coperchio scivolare nel grasso.
I vassoi di caduta e sigillatura appesi vengono incubati a temperatura costante per consentire la forma dei cristalli. Dovrebbero essere regolarmente ispezionati al microscopio per la crescita dei cristalli. Dopo che i dati di diffrazione sono stati ottenuti, integrati e scalati come spiegato nel protocollo scritto accompagnato, la pipeline automatizzata di determinazione della struttura cristallina Auto-Rickshaw può essere utilizzata per risolvere il problema di fase e modellare la proteina.
Nella pagina di destinazione Auto-Risciò fare clic sul pulsante procedi. Inserisci la tua e-mail istituzionale nel modulo Web Autori risciò e fai clic su procedi con l'esecuzione di Autori risciò. Per le proteine senza un modello moto di omologia eseguire il protocollo SAD di Auto-Risciò in modalità avanzata.
Immettere i parametri richiesti. Selezionare la proteina come tipo di molecola. Immettere la lunghezza d'onda della raccolta dati negli angstrom.
Così come io come elemento di sottostruttura per indicare gli atomi di iodio sono stati usati. Selezionare il tipo di sottostruttura I3C per indicare che I3C era la molecola di fase. Selezionare sub_direct come metodo di determinazione della sottostruttura.
Selezionarne tre come numero di sottostrutture previste per monomero. Immetterne uno come limite di prenotazione della ricerca della sottostruttura. Ciò consente all'auto-risciò di determinare automaticamente un taglio di risoluzione adatto.
Immettere il numero di residui in un singolo monomero, il gruppo spaziale del set di dati e il numero di molecole nell'unità asimmetrica in base al coefficiente di Matthews. Seleziona il livello di diffusione appropriato dei dati a raggi-X che si adatta alle tue esigenze. Immettere i dati anomali come file impostato vuoto.
Inserire la sequenza proteica come file SEQ, PIR o TXT. Inserisci il tuo indirizzo email istituzionale. I risultati ti vengono consegnati tramite un link web inviato all'indirizzo e-mail fornito.
Se Auto-Risciò non riesce a risolvere la struttura utilizzando la sottostruttura determinata che convalida la sottostruttura, potrebbe essere d'aiuto nella risoluzione dei problemi della soluzione della struttura. Scarica l'elenco dei siti di atomi pesanti dalla pagina dei risultati di Auto-Risciò. È un collegamento ipertestuale chiamato siti atomi pesanti.
Questo scarica un file di testo con i siti atomi pesanti. Modificare l'estensione del file da txt a pdb. Aprire il file pdb in Coot.
Attiva la simmetria per vedere tutti gli atomi pesanti delle unità asimmetriche vicine. Misurare le distanze tra gli atomi pesanti, anche tra unità asimmetriche. I3C apparirà come un triangolo equilatero con una lunghezza laterale di sei angstrom.
La presenza di un triangolo con queste dimensioni indica che i posizionamenti di quegli atomi pesanti sono corretti. Se la sottostruttura di esecuzione auto-risciò non è corretta, è possibile testare altre impostazioni auto-risciò come discusso nel protocollo scritto. Il metodo I3C RMMS è stato testato su due proteine, il lisozima bianco uovo di gallina utilizzando lo schermo in HT di Hampton Research e il dominio della proteina Orf11 lisina dal batteriofago P68.
Sono stati allestiti schermi completi per ogni proteina corrispondente alla schermata di controllo senza I3C o microseed, schermo con microseed aggiunto, schermo con I3C e infine schermo con I3C e microseed. L'aggiunta di I3C a uno schermo di cristallo non sembra aumentare il numero di riscontri di cristallizzazione. Con il lisozima dell'albume di gallina, il numero di condizioni è sceso da 31 a 26.
Con il dominio Orf11 è stata trovata una singola condizione di hit nella schermata di controllo. L'aggiunta di I3C allo schermo ha anche dato un singolo colpo nelle stesse condizioni. L'aggiunta di microseed al pozzo ha comportato un aumento significativo del numero di condizioni di hit con conseguente aumento di 2,1 e sei volte rispettivamente per il lisozima dell'uovo di gallina e il dominio Orf11.
Questo risultato è coerente con altri studi che testano RMMS. Ancora più importante, l'aggiunta di I3C e microseed su uno schermo ha anche aumentato il numero di condizioni di hit relative alla schermata di controllo dimostrando un aumento di 2,3 e sette volte rispettivamente per il lisozima dell'albume di gallina e il dominio Orf11. Ciò dimostra che il metodo I3C RMMS può produrre in modo efficiente nuove condizioni per i cristalli derivati.
I cristalli di queste condizioni potrebbero essere raccolti e utilizzati per risolvere la struttura cristallina. Sia la struttura del dominio orf11 dell'uovo di gallina potrebbe essere risolta con la fase SAD sulla pipeline Auto-Risciò, utilizzando il segnale anomalo di I3C che dimostra una derisione riuscita da parte dello schermo I3C RMMS. Abbiamo presentato un protocollo semplice ed efficiente per produrre cristalli di alta qualità derivatizzati con la molecola di fase I3C.
Riduce al minimo il numero di schermi e passaggi di movimentazione cristallina, ed è quindi di particolare interesse per i biologi strutturali che studiano nuove proteine. Si consiglia vivamente di ottimizzare le dimensioni del cristallo testando diverse diluizioni dello stock di semi che sono state effettuate durante la preparazione del campione di semi. E questo passaggio è completato dopo che le schermate iniziali sono state fatte.
I3C è ampiamente disponibile ed è economico da acquistare e quindi crediamo che questo metodo sia alla portata della maggior parte dei laboratori di biologia strutturale.
