Gli studi sono stati condotti presso l&#39;Irving Moskowitz e Cherna Centro di Nano e Bio-Nano Imaging presso il Weizmann Institute of Science. Siamo grati a Orna Yeger per il suo aiuto nella progettazione e l&#39;esecuzione di questo protocollo.

1. Preparazione del campione <ol><li> Dopo l&#39;estrazione del tessuto che deve essere esaminato, i tessuti mineralizzati possono essere posizionati nello strumento e immagine. Per l&#39;immagine quella del femore del mouse dovrebbe seguire i seguenti passi: <ol><li> Rimuovere leg post mortem da un embrione C57/Bl6 postceutus 18,5 giorni (E18.5). </li><li> Sigillare la parte più stretta di un puntale di polistirolo (20-200 microlitri) con resina epossidica o altro collante, e riempire la punta con il tampone di lavoro (PBS o altro). </li><li> Montare saldamente la gamba nella punta e sigillare l&#39;altra estremità con il foglio di parafilm. </li><li> Posizionare la punta della pipetta in un supporto adatto e seguire il protocollo dal capitolo 3. Per visualizzare il femore dall&#39;embrione gamba del mouse, lo strumento si trova a 40 KV e 200 μA. Per 8μ risoluzione 1000 immagini di proiezione con ingrandimento 4x devono essere acquisite. </li></ol></li><li> Tessuti non mineralizzati devono essere inizialmente fissate e colorate in modo da aumentare la radiografia attenuazione del tessuto di interesse, utilizzando uno dei numerosi protocolli disponibili 8,9. Per i polmoni di ratto e campioni simili, il protocollo di preparazione è la seguente: <ol><li> Impianto Orthotopical di non carcinoma polmonare a piccole cellule (NSCLC) NCI-H460 sui polmoni di ratto nudo </li><li> Noduli cancro ai polmoni iniziano ad essere rilevabili 4 settimane dall&#39;impianto </li><li> Il sacrificio del ratto e subito in infusione con soluzione fisiologica mescolata con eparina </li><li> Iniettare con una soluzione diluita di Microfil (Flowtech), (2 ml di soluzione composta, 3 ml di diluente e 0,3 ml di induritore) nel ventricolo sinistro di macchiare la circolazione bronchiale </li><li> Estrarre i polmoni e il cuore del ratto </li><li> Immobilizzare il campione (si veda il capitolo 2 del protocollo) inserendo saldamente in un tubo di plastica da 50 ml di prova </li><li> Creare un atmosfera satura di etanolo mettendo sul fondo della provetta un panno inumidito in etanolo </li><li> Colla o avvitare il tubo in un possessore dello strumento </li><li> Procedere con l&#39;impostazione dei parametri di imaging (capitolo 3). Per l&#39;imaging completo dei polmoni ratto la fonte è fissato a 40KV e 100 μA. Al fine di raggiungere la risoluzione 16μ si deve acquisire 2500 immagini di proiezione con un ingrandimento di 0.5x. </li></ol></li></ol> 2. Esempio di immobilizzazione Ad alta risoluzione, è importante evitare qualsiasi cambiamento nella posizione del campione durante la misura. Per questo, il campione è saldamente fissata in un recipiente di plastica che si adatta la sua dimensione. Puntali polistirolo, plastica pipette Pasteur o appositamente costruite titolari di plastica vengono utilizzate al riguardo. A seconda delle esigenze sperimentali, il campione può essere esaminato in aria o immersi in soluzioni di etanolo o buffer. Immobilizzazione tipici e posizionamento finale della gamba del embrione di topo nello strumento è mostrata in Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Posizionamento finale della gamba embrionali di topo nello strumento micro-CT. 3. L&#39;impostazione dei parametri di acquisizione: radiografia di tensione e corrente, CCD tempo di esposizione <ol><li> Inserito in un supporto, il campione viene messo in fase di rotazione dello strumento </li><li> Una prima radiografia immagine è presa con la tensione e la corrente arbitrariamente. </li><li> Se l&#39;immagine è troppo scura, si dovrebbe aumentare il numero di fotoni prima, in modo da aumentare un po &#39;la corrente. Se questo non è sufficiente, si dovrebbe aumentare leggermente l&#39;energia del fotoni di raggi X, cioè la tensione sul tubo radiogeno. </li><li> Se l&#39;immagine è troppo luminosa, si dovrebbe prima diminuire la tensione, poi la corrente. </li><li> La luminosità dell&#39;immagine può essere aumentata con binning. Binning di 1 tiene conto della intensità di ogni pixel dell&#39;immagine, mentre binning di 2 prende la somma di ogni matrice di pixel 2x2. L&#39;immagine sarà di circa 4 volte più luminoso in caso di binning 1, ma avrà la metà della risoluzione. </li><li> Dopo aver impostato la luminosità ottimale, si deve ottimizzare il tempo di esposizione della fotocamera per il miglior compromesso tra contrasto da un lato e una durata ragionevole del esperimento su un altro lato. </li><li> Il contrasto delle immagini, in particolare dei campioni a basso assorbimento, può essere migliorata utilizzando i filtri, che riducono il flusso di fotoni, soprattutto quella dei fotoni di energia inferiore. </li></ol> 4. Esempio di posizionamento <ol><li> Scegliete l&#39;ingrandimento di lavoro. Scelte possibili sono 0.5x, 4x, 10x, 20x e 40x. Il campo visivo si riduce con l&#39;aumento di ingrandimento. </li><li> Ottenere la risoluzione ottimale e campo visivo impostando le distanze tra la sorgente di raggi X e il campione e tra il campione e il rivelatore. Aumentare la fonte a distanza campione riduce il campo visivo e aumenta la risoluzione. Campione di distanza rilevatore ha l&#39;effetto opposto. </li></ol> Tutto il campo per essere visualizzati in 3D dovrebbe essere presente nellaimmagine di proiezione a tutti gli angoli. Si dovrebbe controllare questo ruotando il campione a diverse angolazioni e portando il campione il più vicino possibile all&#39;asse di rotazione. Per questo, si dovrebbe seguire la seguente procedura: <ol start="3"><li> Scattare una foto a 0 gradi, e quindi ruotare il campione a -20 gradi. Se il volume desiderato è spostato lateralmente, si dovrebbe correggere la sua posizione, riposizionando l&#39;asse di rotazione. </li><li> Dopo la correzione, il campione deve essere ruotato in un altro angolo e la posizione corretta di nuovo, fino a quando il campo di interesse è dentro l&#39;immagine a tutti gli angoli da -90 a 90 gradi. </li></ol> 5. Tomografia ad alta risoluzione <ol><li> Durante la misurazione, il campione viene ruotato di un piccolo angolo alla volta e ad ogni angolo di proiezione una immagine è presa. Il numero totale di immagini è sempre un compromesso tra la risoluzione desiderata da un lato e il tempo della misura e la dimensione del file da un altro lato. Come mostrato nella figura 2, ogni singola proiezione comprende tutte le sezioni del campione sovrapposti uno sull&#39;altro, e quindi non può rivelare la struttura 3D del campione. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Proiezione immagini del polmone di ratto a 0 ° (A), 45 ° (B) e 90 ° (C), angolo di rotazione. <ol start="2"><li> Solo dopo aver preso le immagini di proiezione almeno tra -90 e 90 gradi, si può procedere alla ricostruzione del volume di campione. Ricostruzione dura tra 10 minuti e 2 ore, a seconda del software utilizzato e del numero di proiezioni. Ancora una volta, la qualità finale delle immagini 3D è un compromesso tra la risoluzione desiderata e il tempo si vuole spendere e la dimensione del file risultante. </li></ol> 6. Immagine scala di calibrazione Il livello di pixel (valore) in una immagine ricostruita è unico per quell&#39;immagine. Al fine di confrontare le due immagini diverse, una scala di intensità unica deve essere imposto su ogni immagine. Per questo <ol><li> Eseguire una tomografia con uno standard fantasma con le stesse condizioni sperimentali, come per il campione </li><li> Ricalibrare l&#39;immagine campione utilizzando i valori ottenuti per il fantasma. La scala più comune è la (o CT) Hounsfield scala. Per ingrandimento 4x il valore di fondo di 15.000 (per l&#39;acqua o PBS) è stato sostituito con 0 e il valore massimo di 35.000 per l&#39;osso è stato sostituito con il valore standard di Hounsfield 3000. Valori dei pixel altri il risultato di interpolazione lineare o estrapolazione sulla base di tali limiti. </li></ol> 7. Elaborazione delle immagini e analisi Dopo aver ottenuto immagini ad alta risoluzione, si deve estrarre informazioni rilevanti, utilizzando software di analisi delle immagini. Il pacchetto software da utilizzare deve essere progettata per lavorare con file molto grandi (fino a 20GB). 8. Rappresentante Risultati Una rappresentazione di un femore di un topo C57/Bl6 al giorno embrionale 18,5 (E18.5) - quattro giorni dopo l&#39;avvio del processo di mineralizzazione è mostrato in Fig. 3. Gli strati di minerale sono ben visibili (bianco), mentre i tessuti molli non sono visibili in questa preparazione. Abbiamo preso 1000 immagini di proiezione con un ingrandimento lineare di 4x. La risoluzione finale è di 8 micron. Un&#39;attenta analisi del volume rendering mostrato in Fig.1, mostra che la frazione di volume osseo (la frazione del volume osseo che è occupato da tessuto mineralizzato) è 0,18, e la densità minerale ossea è 723 mg / cm 3. Questi valori ci permettono di confrontare questa struttura con le ossa in altre fasi di sviluppo. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Rappresentazioni differenti di una immagine 3D di un embrione di topo femore. La trasversale (sezione) (A), la sagittale (medio-laterale), sezione (B) e uno snapshot del volume rendering (C) sono mostrati. La Figura 4 mostra una immagine 3D dei polmoni di un topo nudo femminile (RNU), 12 settimane di età, impiantati ortotopicamente con i carcinoma polmonare a piccole cellule (NSCLC) NCI-H460. 2500 immagini di proiezione sono state scattate con un ingrandimento lineare di 0,5 x, garantendo una risoluzione finale di 16 micron. L&#39;immagine mostra i vasi sanguigni Microfil macchiato (fino a 20 micron di diametro). L&#39;analisi delle immagini mostra che 4 settimane dopo l&#39;impianto, i noduli tumorali più sono formate. Essi coprono una frazione significativa del volume polmonare (17%). La maggior parte della colorazione polmonare è stato trovato nella aree periferiche dei tumori. Significativamente, come mostrato nella figura 4B, i vasi sanguigni diversi sono presenti anche all&#39;interno della noduli, che coprono, secondo l&#39;analisi preliminare circa il 3% del loro volume. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Immagine 3D di noduli tumorali in crescita in un topopolmonare. Un&#39;istantanea del volume rendering (A) e una sezione del volume (B) sono mostrati. I noduli tumorali sono contrassegnate con frecce. Movie 1. Rappresentazione volumetrica del femore del mouse nella Figura 1. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">Clicca qui per guardare il film.</a> Movie 2. Rappresentazione volumetrica dei polmoni di ratto in Figura 2. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">Clicca qui per guardare il film.</a> Movie 3. Sezioni seriali attraverso i polmoni. I noduli appaiono come aree grigie nella maggior parte delle fette. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">Clicca qui per guardare il film.</a>

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	<li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging.">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50, 2-13 (2010).</li><li>Bauer, J. S., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoporosis+imaging.">Advances in osteoporosis imaging.</a> Eur J Radiol. 71, 440-449 (2009).</li><li>Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+insight+bone+measurements+by+histomorphometry+and+microCT.">Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT.</a> J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).</li><li>Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+human+bone+biopsies:+a+quantitative+structural+comparison+of+histological+sections+and+micro-computed+tomography.">Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography.</a> Bone. 23, 59-66 (1998).</li><li>Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Aliased+3D+Cone-Beam+Reconstruction+Of+Low-Contrast+Objects+With+Algebraic+Methods.">Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).</li><li>Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+single-slice+rebinning+in+cone-beam+spiral+CT.">Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT.</a> Med Phys. 27, 754-772 (2000).</li><li>Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination-weighted+Feldkamp-based+reconstruction+algorithm+for+cone-beam+CT.">A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT.</a> Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).</li><li>Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging.">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med Phys. 31, 305-313 (2004).</li><li>Plourabou&#233;, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+high-resolution+vascular+network+imaging.">X-ray high-resolution vascular network imaging.</a> J Microsc. 215, 139-148 (2004).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

C57/Bl6 del mouse al giorno embrionale 18,5 (E18.5) è quattro giorni dopo l&#39;avvio del processo di mineralizzazione. A questo stadio di sviluppo, l&#39;osso futuro è fatto di molti strati di osteoids mineralizzato, chiaramente visibile in figura 3. A questo punto, si dovrebbe sottolineare che i tessuti mineralizzati possono essere visualizzate a bassa risoluzione con strumenti diversi che richiedono un trattamento del campione di meno. Il protocollo attuale (e lo strumento di micro-CT utilizzato in esso) oltre a fornire una risoluzione più alta, offre la massima flessibilità per l&#39;utente di scegliere i migliori parametri geometrici per la misurazione. I risultati in Fig. 4 mostrano che nei modelli ortotopico cancro al polmone animale, umana non a piccole cellule cancro ai polmoni può indurre il reclutamento dei vasi sanguigni e neovascolarizzazione. Riteniamo che il tessuto polmonare non era né trasferito, né ha cambiato la sua forma durante la misurazione. L&#39;utente deve prendere precauzioni particolari per evitare tali cambiamenti nel corso di una tomografia. Per alcuni campioni, in particolare per il tessuto più morbido, si deve costruire speciali supporti che immobilizzare perfettamente il campione durante la misura. Purtroppo la presenza di perdite elevate di mezzo di contrasto nei dintorni dei tumori impedito quantificazione attendibile dei vasi sanguigni periferici. Di conseguenza le immagini sono contaminate da qualche agente colorazione specialmente ai bordi, che è chiaramente presente nel film 2 e 3. Non abbiamo potuto evitare questo sversamento, ma le informazioni utili sul noduli tumorali, tra le loro dimensioni, la forma e la presenza di vasi sanguigni interna non è stata influenzata. Potremmo concludere con chiarezza che, almeno per la circolazione bronchiale che è stato studiato qui, flusso ematico periferico partecipa perfusione del tumore, con alcuni perfusione presente anche all&#39;interno del tumore.

Per l&#39;acquisizione di immagini che abbiamo utilizzato una MICRO XCT-400 microfocussed raggi X prodotti dal sistema tomografico Xradia, Concord, USA. Le immagini sono state elaborate e analizzate utilizzando ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, Francia) e MicroView (General Electric, USA), pacchetti software. Qualsiasi disponibile il software di analisi immagine può essere utilizzata al posto

high resolution 3d imaging of ex-vivo biological samples by micro ct

Non distruttivo di visualizzazione volume può essere raggiunto solo con tecniche tomografiche, di cui il più efficiente è la tomografia a raggi X micro computerizzata (μCT). Ad alta risoluzione μCT è molto versatile ma accurato (1-2 micron di risoluzione) tecnica per l&#39;esame 3D di campioni biologici ex-vivo 1, 2. A differenza degli elettroni tomografia, la μCT consente l&#39;esame di fino a 4 cm di spessore dei campioni. Questa tecnica richiede solo poche ore di misura rispetto alle settimane in istologia. Inoltre, μCT non si basa su modelli 2D stereologic, così possono integrare e in alcuni casi può anche sostituire i metodi istologici 3, 4, che sono sia in termini di tempo e distruttivo. Condizionamento del campione e il posizionamento in μCT è semplice e non necessita di alto vuoto o di basse temperature, che possa ledere la struttura. Il campione viene posizionato e ruotato di 180 ° o 360 ° tra un microfocused sorgente di raggi X ed un rivelatore, che include uno scintillatore e una fotocamera CCD accurata, per ogni angolo è preso una immagine 2D, e poi l&#39;intero volume viene ricostruita utilizzando uno dei diversi algoritmi disponibili 5-7. La risoluzione 3D aumenta con il diminuire del passo di rotazione. Il protocollo video presenti mostra le fasi salienti della preparazione, immobilizzazione e posizionamento del campione, seguita da immagini ad alta risoluzione.

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non distruttivo di visualizzazione volume può essere raggiunto solo con tecniche tomografiche, di cui il più efficiente è la tomografia a raggi X micro computerizzata (TAC).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

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Bioingegneria

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-Particle Image Velocimetry per Velocity Misure profilo dei flussi Micro sangue

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Corretto posizionamento e trattenuta di un ratto dell'arto per l'Imaging mirato ad alta risoluzione dell'osso utilizzando Micro-architettura In Vivo Micro-tomografia computerizzata

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Immagini 3D ad alta risoluzione della rete Neuro-insulari Pancreas umano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Imaging ad alta risoluzione di dinamiche nucleari in cellule vive sotto tensione uniassiale

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...