Questo progetto è stato il supporto in parte dalla Johns Hopkins University, Ufficio del prevosto attraverso il Science Initiative Gateway.

<ol><li> Inizia il funzionamento con l&#39;installazione nave. Un fermentatore convenzionale ha i seguenti componenti che devono essere installati (Figura 1): <ol><li> pH sonda - per la misura del pH nella cultura vivo. Calibrazione del tastatore prima dell&#39;installazione e sterilizzare con la nave. Installare sonda nella piastra di testa. </li><li> sonda pO 2 - per la misurazione del contenuto di ossigeno disciolto all&#39;interno del recipiente durante la fermentazione. Installa nella piastra di testa. </li><li> Tubo di raccolta per il campionamento della cultura. Installare questo componente regolabili in altezza con la piastra di testa. </li><li> Scambiatore gas - risiede nella parte inferiore del recipiente e fornisce infusione gas alla cultura. Agganciare irroratore fino alla sorgente di gas in fermentatore e montare nella piastra di testa. </li><li> Albero girante e - la girante agita la cultura ed è fondamentale per il mantenimento della uniformità della cultura nel vaso. </li><li> Condensatore dei gas di scarico - per arginare la perdita per evaporazione nel serbatoio raffreddando il percorso dei gas di scarico. </li><li> Linee pompa del reagente per il controllo del pH o aggiunta mangimi. </li></ol></li><li> Pulire il vaso e la piastra di testa con acqua e sapone. Una spazzola morbida è raccomandato per il lavaggio della nave e piastra di testa. Candeggina o detergenti con cloro non possono essere utilizzati per pulire il vaso. </li><li> Se il supporto non è termolabile, aggiungerlo alla nave pulito. Aggiungere solo fino al raggiungimento del volume massimo di lavoro. In questo caso, il volume di lavoro massimo è di 3,3 L per un volume totale del vaso 5 L. </li><li> Montare la piastra di testa imbarcazione, assicurandosi che la guarnizione O-ring sia posizionato correttamente. </li><li> Installare il condensatore gas di scarico. </li><li> Installare la sonda antischiuma nella sua porta 10 mm. </li><li> Installare il tubo di raccolta nella propria porta 10 mm. Mettere un pezzo di tubo sulla parte superiore di esso e bloccarlo off. </li><li> Installare i tubi ed un filtro 0.20 micron in ingresso sparge quindi bloccare questa via. </li><li> Calibrare la sonda pH: <ol><li> Raccogliere 2 buffer di riferimento in piccoli bicchieri, una bottiglia di lavaggio e un wa ricambiobecher sh. </li><li> Agganciare il pH sonda fino al fermentatore e girare il fermentatore su. </li><li> Scorrere fino al parametro pH e tramite il tasto menu, scorrere l&#39;opzione &#39;Cal&#39;, e premere &#39;Invio&#39;. </li><li> Selezionare &#39;2 &#39;per la taratura a 2 punti. </li><li> Lavare la punta della sonda e immergerlo nel buffer di riferimento basso. Il valore sul fermentatore si stabilizzerà. Utilizzando i tasti + e - tasti, regolare il valore visualizzato corrisponda al valore del buffer di riferimento pH. Una volta che si smette di lampeggiare, premere il tasto &#39;Invio&#39;. </li><li> Lavare la sonda e inserirla nel secondo buffer di riferimento. Lasciare che il valore si stabilizzi e quindi utilizzare la tastiera per rendere il valore visualizzato corrisponde l&#39;alto valore del buffer di riferimento. Premere &#39;Invio&#39; per confermare. </li><li> Lavare la punta della sonda spento e scollegarlo dal fermentatore. Mettere il cappuccio protettivo sulla connessione e installarlo in piastra di testa. </li></ol></li><li> Aprire la punta della sonda pO 2 e controllare che non vibasta elettrolita a coprire la punta. In caso contrario, aggiungere un po &#39;al serbatoio e chiudere il backup. </li><li> Installare la sonda pO 2 nella piastra di testa e assicurarsi che il tappo autoclave è messo su di proteggere i suoi collegamenti elettrici. Sarà tarato dopo la sterilizzazione. </li><li> Ottenere una bottiglia per l&#39;alimentazione reagente con un tubo tuffo e filtro aria. Aggiungi il tubo della pompa per il porto pescante e collegare l&#39;altra estremità alla porta di ingresso del fermentatore. </li><li> Posizionare il tubo su tutte le porte inutilizzate poi morsetto del tubo off. </li><li> Installare un filtro da 0,45 micron sul condensatore gas di scarico. Questo filtro garantisce che la nave non pressurizzare in autoclave. </li><li> Verificare che tutti i tubi che vanno sotto il livello del supporto vengono bloccati off per evitare che i supporti di uscire. </li><li> Mettere il recipiente in autoclave per 25-30 minuti a 121 ° C, ciclo di liquido. Attenzione: Quando si esce sarà molto caldo. </li><li> Installare la nave sulla base fermentatore. </li><li> Collegare il pHsonda cavo. </li><li> Collegare il cavo della sonda pO 2. </li><li> Agganciare il sparger fino al rotametro aggiunta gas. </li><li> Sterilmente aggiungere 1 M NaOH reagente alla bottiglia con il pescante e installare la testa della pompa sulla testa mandrino pompa base. </li><li> Mettere il sensore di temperatura nel pozzetto sulla piastra di testa. Assicurarsi che va tutto il modo al fondo del pozzetto. </li><li> Abbassare il braccio agitazione sul giunto della girante navi. </li><li> Assicurarsi che il fermentatore è acceso. </li><li> Verificare che l&#39;acqua è a disposizione del fermentatore. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione dell&#39;aria al fermentatore. </li><li> Scorrere fino al parametro temperatura e impostare la temperatura a 37 ° C. Premere il tasto &#39;Invio&#39; per avviare il controllo della temperatura. La nave si riscalda in 15 min o meno. </li><li> Ruotare il flusso di gas di 1 volume del serbatoio di supporti per minuto o meno. Per questa configurazione, il flusso di gas è 3 L / min. Bubbles dovrebbero apparire in fondo. </li><li> Scorrere fino al agitazione parameter e impostare a 300 rpm. Premere &#39;Enter&#39; per attivare l&#39;agitazione. </li><li> Una volta che la temperatura ha raggiunto 37 ° C, scorrere fino al parametro pH e impostarlo a 6,8. Girare il controllo del pH premendo il tasto &#39;Invio&#39;. </li><li> Impostare agitazione alla velocità massima di 1.000 rpm per la corsa. </li><li> Assicurarsi che la sonda pO 2 è polarizzato correttamente per visualizzare i valori corretti. Dopo 2 ore, scorrere fino al parametro pO 2 e usare il tasto &#39;Menu&#39; per selezionare il &#39;Calibrate Function&#39; e selezionare la taratura 1 punto. </li><li> Dopo 15 minuti, utilizzare i cursori per impostare il valore a 100 e premere &#39;Invio&#39;. Questo calibrare pO 2. </li><li> Scorrere fino agitazione e impostare a 300 rpm. </li><li> Utilizzando il tasto &#39;Menu&#39;, girare la &#39;cascata&#39; su &#39;on&#39; nel menu agitazione. Ciò consentirà di aumentare la velocità di agitazione nel tentativo di tritare bolle d&#39;aria e forzare più ossigeno nella soluzione l&#39;aumento della domanda di crescita. </li&gt; <li> Scorrere fino al parametro pO 2 e impostare il valore a 30. Premere il tasto &#39;Invio&#39; per avviare pO 2. </li><li> Avviare il pacchetto software di controllo sul PC. </li><li> Una volta che le sonde sono tarate, è stabile agitazione a 300 rpm, temperatura a 37 ° C e pH sia prossimo a 6,8, è tempo di inoculare. Uso di alcol, sterilizzare la porta che verrà utilizzata per l&#39;inoculazione. </li><li> Disegnare l&#39;inoculo in una siringa e inserirlo nella porta sterilizzato. Chiudere la porta. </li><li> Segnare il tempo di inoculazione in un registro. </li><li> E &#39;anche importante prendere un campione al tempo di sterilizzazione. Sterilizzare l&#39;estremità del tubo tubo di raccolta con l&#39;alcol. </li><li> Aprire il morsetto copre la porta raccolto e utilizzare una siringa per estrarre un campione. Questo primo campione è solitamente scartata poiché è stato seduto nel tubo. </li><li> Utilizzare un altro siringa per tirare un altro campione. </li><li> Con un terzo siringa, spingere l&#39;aria indietro attraverso il tubo per rimuovere quanto più volume mortodalla linea ed attaccarla off line. </li><li> Determinare la densità cellulare e pH e registrare i valori. Con colture microbiche, è utile per registrare i valori ogni ora. Interval è cultura dipendente. </li><li> Metodologia raccolto dipende dal intenti per la coltura dopo la crescita è completata. In questo caso, il campione di cultura un tempo finale di ricevere il finecorsa per densità cellulare e possibile pH o misura di peso cella umida. Aprire la piastra di testa smaltiti dei contenuti in un designato &quot;serbatoio kill&quot; con candeggina o altri agenti antimicrobici. </li></ol>

<ol>
	<li>Shuler, M., Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).</li><li>Hambor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing.">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).</li><li>Julien, C., Whitford, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor,+Monitoring,+Modeling+and+Simulation.">Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation.</a> BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).</li><li>Fike, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+Supplementation+Strategies+for+Biopharmaceutical+Production.+Part+1:+Identifying+a+Formulation.">Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation.</a> BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).</li><li>Jana, S., Deb, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+efficient+production+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).</li><li>Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+K5+fermentation+and+the+preparation+of+heparosan,+a+bioengineered+heparin+precursor.">E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Infors, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Minifors operating Manual and user guide. , .</li></ol>

Autore A. Magno è un dipendente di ATR Biotech che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Bioreattori serbatoi agitati sono gli standard nel settore Biotecnologie e sono stati utilizzati per oltre 40 anni 1. Il piccolo serbatoio di agitazione è stato importante per scale-up, scale-down, ottimizzazione ceppo, caratterizzazione e sviluppo di processo. Esso può anche avere un ruolo importante nello sviluppo della medicina individualizzata 2. Il bioreattore piccola scala è più simile a condizioni in situ per la crescita cellulare, perché può essere monitorato e ottimizzato tutta una corsa. Molto spesso, i primi esperimenti sono eseguiti utilizzando palloni di scuotimento ma le condizioni del bioreattore piccola scala differiscono significativamente dal dibattimento in pallone. In un esperimento abbiamo scoperto che le condizioni per la crescita ottimale di E. coli e produzione di proteina fluorescente verde (GFP) nel pallone shake non si traducono al serbatoio agitato (dati non pubblicati). Altri metodi di cellule in coltura su larga scala includono bottiglie di rulli, unico use a dondolo bioreattori piattaforma 3 e grandi bioreattori monouso con volumi di lavoro da 50 a 5.000 L. Ogni metodo prevede sfide per scale-up, ma ha trovato un posto in produzione. L&#39;uso singolo dondolo piattaforma bioreattore è simile al serbatoio agitato, e fornisce un ambiente regolato. Si differenzia dal serbatoio agitato dal fatto che la miscelazione avviene a causa di un movimento oscillante per generare onde per prevenire sedimentazione delle cellule e fornire ossigenazione. L&#39;idrodinamica per questo metodo sono diversi dal serbatoio agitato e volume massimo è limitato a 1.000 L. Le differenze possono influenzare la crescita cellulare e la produzione del prodotto. Altri sistemi monouso uniscono il serbatoio agitato con il reattore usa e getta per, fornire una piattaforma con un minimo di infrastrutture e overhead associato, e la capacità di high-throughput Bioprocessing 4. I nuovi utenti di bioreattori da banco possono avere difficoltà a determinare valori di riferimento iniziali per pH, pO 2 e temtemperatura, tuttavia, la ricerca pubblicata possibile fare riferimento per queste informazioni 5, 6, 7, 8, 9. Con colture batteriche in particolare, si raccomanda di iniziare agitazione alla stessa velocità del matraccio agitatore e la temperatura alla stessa setpoint. Cultura pH da precedenti boccette shake piste può essere utilizzato anche come punto di partenza. Impostazione del valore di pO 2 è più difficile ed è tipicamente determinata empiricamente. Tuttavia, a partire 50% pO 2 è un punto di partenza raccomandata.

Tecnologia di base fermentazione è un&#39;estensione della tecnica semplice in pallone per la coltivazione di colture. Essa nasce dalla volontà di controllare gli ambienti di crescita per le colture vive in modo più completo e quantitativa. Batch fiaschi cultura scuotimento sono in genere limitati dal controllo impreciso della temperatura. Uniformità di temperatura in un agitatore incubate o camera calda è molto variabile, a volte allontanandosi 5 ° C o più dal valore di riferimento previsto. Poiché l&#39;in pallone viene normalmente agitata ad una velocità fissa, scambio consumo di ossigeno e gas è limitata. Una volta che l&#39;ossigeno ambiente disponibile è esaurito, la maggior parte delle culture non riescono a prosperare. Non vi è alcun controllo del pH in flaconi di scuotimento. In molti casi, se la cultura non è limitata dalla scorta di alimentazione, diventa acida al punto di danno alla cultura e la respirazione rallenta drasticamente. La maggior parte delle culture del dibattimento in pallone vengono eseguiti anche come un &#39;lotto&#39;, il che significa che sono alimentati solo una volta o vicino all&#39;inizio delle culture inoculation. Dopo questa fonte di carbonio iniziale è consumato, la cultura smette di crescere. In alcuni casi il suo metabolismo può spostarsi e cominciare a consumare altri metaboliti nel brodo di coltura, a volte cambiando le caratteristiche della biomassa risultante o proteine. Fiaschi di scuotimento sono di solito soggetti a perdite per evaporazione media in ambienti di coltura più caldi, in genere il 10% del volume per 24 ore a 37 ° C. Questa perdita, la densità della cultura e proibisce il funzionamento a lungo termine del sistema. Infine, l&#39;utente può verificare la formazione di schiuma dal supporto dopo agitazione. La presenza di schiuma nello spazio di testa al di sopra della cultura limiterà lo scambio di gas e di ulteriore crescita ginocchio. Il sistema di fermentazione di base è progettato per soddisfare tutte queste limitazioni. Controllo della temperatura attenta è raggiunto in vasi di fermentazione con l&#39;uso di girante agitazione e una camicia di riscaldamento. Un sensore inserito nel recipiente e retroazione di controllo di riscaldamento e raffreddamento di questa giacca solitorisultati nel controllo della temperatura ± 0.1 ° C intorno al setpoint. Fermentatori da banco in genere forniscono il controllo del pH tramite aggiunta del reagente liquido attraverso una pompa. Il valore del pH è costantemente monitorato nel tentativo di mantenere la ottimale per la crescita delle cellule. Aerazione corretta è mantenuta dalla girante miscelazione o la suddetta dall&#39;infusione di aria o gas ossigeno integrato direttamente nella cultura. Con colture sensibili al taglio, gas ossigeno integrato è il meccanismo principale per il mantenimento del livello di ossigeno nella cultura. Misura di ossigeno in soluzione si ottiene di solito da una sonda polarografica che non è normalmente disponibile per l&#39;uso in flaconi di scuotimento. È anche possibile aggiungere continuamente o periodicamente mangime al recipiente per mantenere la crescita in modo lineare o esponenziale. Il condensatore di gas in uscita fornisce una superficie fredda per il vapore nel flusso di gas di scarico di condensare, preservando in tal modo il volume cultura e densità. Aggiunta periodica di antischiuma tensioattivo è azionatoda una sonda di conducibilità nella cultura, riducendo schiuma sulla superficie e consentendo lo scambio di gas. La nave, con tutte le sonde, raccordi, giranti, tubi di raccolta, e tubi, viene assemblato e sterilizzato in autoclave standard. Dopo calibrazioni di sonde finale e stabilizzazione di ambiente operativo, la coltura è aggiunto al recipiente. Il sistema può quindi essere utilizzato per caratterizzare la cultura in un modo che è più quantitativa e precisa che con un metodo in pallone. Stretto controllo della temperatura, pH, contenuto di ossigeno, consumo di mangime, liquido evaporazione, e livelli di schiuma contribuiscono a una biomassa molto elevata e quindi un rendimento proteina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="356">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">ampicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A1593-25G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">antifoam 204</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A8311</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1 M Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td>38215-1EA-R</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 4.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B5020</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 7.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B4770</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">pO2 probe electrolyte</td>
			<td style="width:117px;">Broadley James</td>
			<td>AS-3140-C30-0025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.45 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-02915-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.22 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-29950-40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Luer Lock syringe, 10 mL</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-07940-12</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Minifors Bioreactor</td>
			<td style="width:117px;">Infors HT</td>
			<td style="width:117px;">B-Pack 5.0</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Air Admiral air pump</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-79202-00</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1175 PD Chilling circulator</td>
			<td style="width:117px;">VWR</td>
			<td style="width:117px;">13721-204</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

operation of a benchtop bioreactor

Sistemi di fermentazione sono utilizzati per fornire un ambiente di crescita ottimale per diversi tipi di colture cellulari. La possibilità offerta dalla fermentatori per controllare accuratamente la temperatura, il pH e la concentrazione di ossigeno disciolto in particolare rende indispensabile efficiente crescita su grande scala e l&#39;espressione di prodotti di fermentazione. Questo video descrivere brevemente i vantaggi del fermentatore sul in pallone. Sarà inoltre identificare i componenti fondamentali di un tipico sistema di fermentazione da banco e dare istruzioni di base sulla configurazione della nave e la taratura delle sue sonde. Lo spettatore sarà familiarizzato con il processo di sterilizzazione e mostrato come inoculare il terreno di coltura in vaso con la cultura. Saranno inoltre dimostrato concetti di base di funzionamento, il campionamento e raccolta. Saranno inoltre discussi l&#39;analisi dei dati semplice e la pulizia del sistema.

Il bioreattore può essere eseguito con o senza il software IRIS. Tuttavia, per acquisire i dati, si consiglia di utilizzare il software. Prima aggiunta di batteri, i sensori di pH e ossigeno devono essere calibrati, il set di velocità girante e la temperatura impostata. In figura 2, l&#39;uscita dati per una corsa bioreattore è presentato. La temperatura è stata regolata a 30 ° C, la velocità della girante a 200 rpm. I parametri possono essere diverse per ogni esperimento, ma prima aggiunta di batteri, il sistema dovrebbe essere a regime. In Figura 3 viene mostrata la variazione della concentrazione di ossigeno con l&#39;aggiunta della coltura batterica. I set-point per questo esperimento sono 37 ° C, agitatore a 200 rpm, O 2 al 70%. Al tempo 19:20, la pompa di alimentazione batte coltura batterica seme in un OD di 0,1 causando un calo immediatamente a livello O 2. Il bioreattore risponde ai mutamenti O 2 livello con un aumento della velocità del flusso d&#39;aria e girante. Tegli set-point per gli aumenti sono fissati in cascata (passo 35). Il pH del reattore è stata monitorata in tempo reale, con il pH decrescente poi crescente come dimostrato dalla fluttuazione linea pH nel tempo (Figura 4). L&#39;intera corsa può essere analizzato e parametri rettificato per esperimenti successivi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig1.jpg" /> Figura 1. Bioreattore da banco con tutte le parti etichettati e collegate. Questa figura mostra il reattore serbatoio agitato all&#39;inizio di una corsa. Le parti del reattore vengono etichettati e comprendono i sensori, girante, indicatore temperatura, bottiglie di mangimi e di campionamento, di scarico, manometro, camicia di riscaldamento, condensatore torre, e pannello di controllo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;immagine dello schermo del bioreattore software all&#39;inizio del periodo. All&#39;inizio di una corsa serbatoio agitato, la temperatura è stata regolata a 30 ° C (linea gialla), velocità girante a 200 rpm (linea rossa), pH 6,5 (linea verde), e pO 2 al 57,2% (linea blu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig3.jpg" /> Figura 3. L&#39;immagine dello schermo del software bioreattore durante la corsa come ossigeno diminuisce. Quando la coltura è in fase di crescita attiva, consuma ossigeno e la quantità di ossigeno nel reattore è diminuita (linea blu). Aumentando la velocità del girante, più ossigeno può essere aggiunto alla coltura (linea rossa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig3large.jpg" target="_blank">clicca qui per ingrandire la figura</a> . Figura 4. L&#39;immagine dello schermo del software bioreattore mostrando cambiamento di pH nel tempo. Il pH della coltura viene monitorata continuamente e nel tempo diminuisce in acido lattico viene prodotto e poi aumenta come base si aggiunge al bioreattore (linea blu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig4large.jpg" target="_blank">clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentatori sono utilizzati per aumentare la cultura resa e produttività delle cellule bioingegneria. Dopo la proiezione più microbiche o animali candidati colture di cellule in fiasche di scuotimento, il prossimo passo logico è quello di aumentare la biomassa della coltura selezionata con il fermentatore. Questo video dimostra l&#39;installazione e il funzionamento di un tipico sistema di bioreattore da banco.

Il funzionamento di un bioreattore da banco

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

88.6K Views.  Johns Hopkins University.  Fermentatori sono utilizzati per aumentare la cultura resa e produttività delle cellule bioingegneria. Dopo la proiezione più microbiche o animali candidati colture di cellule in fiasche di scuotimento, il prossimo passo logico è quello di aumentare la biomassa della coltura selezionata con il fermentatore. Questo video dimostra l'installazione e il funzionamento di un tipico sistema di bioreattore da banco. 

Video: Operation of a Benchtop Bioreactor

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l&#39;ingegneria tissutale

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Costruzione e caratterizzazione di un Fold bioreattore Novel Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Un bioreattore Novel per l&#39;alta densità di coltivazione diverse comunità microbiche

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.

Assemblaggio e funzionamento di un dispositivo acoustofluidico per una maggiore consegna di composti molecolari alle cellule

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This paper presents a cleanroom "light" fabrication process of carbon fiber neural electrode arrays that can be learned quickly by an inexperienced cleanroom user. This carbon fiber electrode array fabrication process requires just one cleanroom tool, a Parylene C deposition machine, that can be learned quickly or outsourced to a commercial processing facility at marginal cost. This fabrication process also includes hand-populating printed circuit boards, insulation, and tip optimization. 
The three different tip optimizations explored here (Nd:YAG laser, blowtorch, and UV laser) result in a range of tip geometries and 1 kHz impedances, with blowtorched fibers resulting in the lowest impedance. While previous experiments have proven laser and blowtorch electrode efficacy, this paper also shows that UV laser-cut fibers can record neural signals in vivo. Existing carbon fiber arrays either do not have individuated electrodes in favor of bundles or require cleanroom fabricated guides for population and insulation. The proposed arrays use only tools that can be used at a benchtop for fiber population. This carbon fiber electrode array fabrication process allows for quick customization of bulk array fabrication at a reduced price compared to commercially available probes.

Here, we describe fabrication methodology for customizable carbon fiber electrode arrays for recording in vivo in nerve and brain.

Toolkit open source: array di microelettrodi in fibra di carbonio da banco per la registrazione nervosa

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in regenerative medicine and bioreactor technologies offer opportunities to produce lab-grown functional tissue and organ constructs that can be used to screen drugs, model disease, and engineer tissue replacements. Here, a miniaturized bioreactor coupled with an imaging modality that allows in situ visualization of the inner lumen of explanted rat trachea during in vitro tissue manipulation and&#160;culture is described. Using this bioreactor, the protocol demonstrates imaging-guided selective removal of endogenous cellular components while preserving the intrinsic biochemical features and ultrastructure of the airway tissue matrix. Furthermore, the delivery, uniform distribution, and subsequent prolonged culture of exogenous cells on the decellularized airway lumen with optical monitoring in situ are shown. The results highlight that the imaging-guided bioreactor can potentially be used to facilitate the generation of functional in vitro airway tissues.

The protocol describes an imaging-enabled bioreactor that allows the selective removal of the endogenous epithelium from the rat trachea and homogenous distribution of exogenous cells on the lumen surface, followed by long-term in vitro culture of the cell-tissue construct.

Bioreattore guidato da imaging per la generazione di tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...