Questo lavoro è stato sostenuto da parte dell&#39;Ufficio di Ricerca e Sviluppo, RR &amp; D Service, Department of Veterans Affairs, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 e Dipartimento della Difesa W81XWH-10-1-0643.

1. Biassiale Caricamento bioreattore design <ol><li> Il bioreattore impiega due stadi fabbricati da Thor-laboratori (Newton, MA) per applicazioni laser a guida di precisione per l&#39;applicazione di sollecitazioni meccaniche uniassiale o biassiale per tessuti ingegnerizzati, con grande precisione di dose di carico (ampiezza e frequenza) e applicata a una vasta gamma di condizioni di coltura di tessuto da sola a piastre da 24 pozzetti (Figura 1). </li><li> Carico biassiale è compiuta da due fasi travelmax (LNR50SE). Queste fasi sono montati ortogonalmente in una configurazione XZ. La fase orizzontale prevede movimenti di rottura dinamica oscillando lungo l&#39;asse X. La fase verticale consente il caricamento dinamico a compressione da oscillante lungo l&#39;asse Z. Queste fasi hanno una gamma di corsa 50 mm e sono azionati in modo indipendente da stepper attuatori motore (DRV014), controllati da un driver del motore passo-passo ad anello chiuso (BSC102) che dispone di funzionalità di micro-stepping, consentendo dimensioni passo inferiori50 nm. </li><li> Il dispositivo è montato su un rigido 25 cm x 30 cm x 12,5 millimetri piastra di base in alluminio che viene utilizzato come piattaforma per l&#39;assemblaggio di componenti di macchine e per il montaggio delle piastre di coltura tissutale. Fermate cinematici regolabili sono utilizzati per bloccare piastre di coltura tissutale in posizione sulla piastra di base in alluminio. Queste fermate cinematici hanno viti di regolazione di precisione per consentire l&#39;allineamento preciso che non è altrimenti raggiungibile a mano. La struttura modulare della piastra di base consente la collocazione di queste fermate cinematici per accogliere lastre di diverse dimensioni e forme (piastre Petri vs piastre multi-pozzetto). </li><li> Un custom-lavorata polisulfone caricamento lastra è accoppiata alla piattaforma mobile bi-assiale tramite una parentesi angolare destra una macchina di precisione. Materiale polisulfone è stato scelto per la sua biocompatibilità, la facilità di lavorazione, e la facilità di sterilizzazione. </li><li> Movimenti delle fasi sono controllate da Advanced Technology Posizionamento Thor-Labs (APT) software. Il driver di motore passo-passo è noied in combinazione con il software che permette la regolazione dei parametri di carico di frequenza e ampiezza di taglio e compressione sia indipendente e simultaneo. </li><li> Retroazione di posizionamento è fornita da encoder ottici lineari che sono attaccati ad ogni piattaforma mobile e sono integrati con il software. Il sistema encoder ha una ripetibilità bidirezionale di 0,1 micron e una risoluzione di 20 nm, traducendo ad una precisione di posizionamento inferiore a 3 m oltre i ben 50 mm di corsa. Questi encoder forniscono la necessaria retroazione di posizione per l&#39;elettronica di azionamento per garantire vere capacità nanopositioning e una lettura diretta della posizione assoluta. </li><li> Al fine di fornire la retroazione di forza necessaria per rivelare il contatto tra piastra e campioni e valutare le risposte di carico, una cella di carico miniatura di precisione (Honeywell Modello 31) è posizionato tra il carico platina e la piattaforma mobile (Figura 2). La cella di carico ha alte precisioni di0,15% al ​​0,25% del fondo scala. L&#39;unità di visualizzazione (SC500) per la cella di carico può anche fornire misurazioni di carico fino a 5 decimali. Inoltre, dispone di una porta RS-232 per consentire la raccolta di dati su un computer. </li></ol> 2. Cella testa di serie agarosio costrutti <ol><li> Preparare 4% agarosio: Aggiungere 0,8 g di agarosio a 20 ml di DMEM (senza additivi) in un pallone da 50 ml, bollire, e poi tenere in forno a 70 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Regolare il volume di sospensione cellulare per doppio importo della densità di semina cellulare desiderato. Questa sospensione viene miscelata con un volume uguale del 4% w / v agarosio per creare un gel di agarosio al 2% alla densità di semina desiderata. </li><li> Posto sia la sospensione cellulare e una pipetta 10 ml nell&#39;incubatrice. </li><li> Configurare il sistema di colata di gel. Uno 1,5 mm e uno 0,75 millimetri piastra distanziale dovrebbe essere messo insieme per creare un gel di spessore 2,25 millimetri. Altre piastre distanziatrici dimensioni possono essere utilizzati per creare gel diversi spessori. Il sistema di colata di gel non è abbastanza grande per contenere questi piatti togetlei, in modo che deve essere registrato in modo sicuro per evitare perdite. </li><li> Il passo successivo è quello di miscelare rapidamente la sospensione cellulare con l&#39;agarosio precedentemente preparato e pipetta nello stampo gel prima l&#39;agarosio si solidifica. Rimuovere l&#39;agarosio liquido dal forno e posizionare un termometro sterile in esso. L&#39;agarosio deve raffreddare a 42-43 ° C prima della miscelazione con celle. Riscaldare la sospensione cellulare a 37 ° C. Una volta che l&#39;agarosio colpisce 43 ° C, pipettare rapidamente l&#39;importo desiderato e quindi dispensare immediatamente la sospensione cellulare su e giù un paio di volte per mescolare. Quindi dispensare immediatamente la miscela nello stampo gel. </li><li> Lasciar solidificare il gel per 10-15 minuti e poi inclinare accuratamente in una posizione orizzontale. </li><li> Rimuovere la lastra di vetro superiore e dischi punzone con la biopsia. I dischi possono essere raccolti con una piccola spatola sterile. Nella nostra esperienza, un ml di gel 9 era abbastanza grande per fare più di un centinaio di dischi di 5 mm di diametro. </li></ol> 3. Cultura dei dischi </p&gt; <ol><li> Mettere un disco in ciascun pozzetto di una cultura non-tessuto piatto 24 trattati bene. </li><li> Aggiungere 2 ml di siero terreno di differenziamento condrogenico in ciascun pozzetto. </li><li> Mettere le piastre in incubatore (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Per i cambiamenti dei media, sostituire 1 ml per bene ogni 2-3 giorni. </li></ol> 4. Immobilizzazione di campioni per il carico meccanico <ol><li> Preparare 4% agarosio (senza sospensione cellulare aggiunta) e il gel dovrebbe essere più sottile rispetto agli stessi campioni (per evitare interferenze durante il carico). Lo spessore consigliato è di 1,5-1,9 mm (2,25 campioni per mm di spessore). </li><li> Una volta gelificato, punzone 16 millimetri dischi di diametro per 24 pozzetti. In ogni disco, un punzone foro 5 mm per il campione da collocare in Se desiderato, punzone altro foro 5 mm sul bordo del disco per la pipetta ad essere immessi durante sostituzioni di supporti. </li><li> Una volta agarosio pozzi sono stati fatti, posto in 24 pozzetti, come mostrato in Figura 3. </li><li> Una volta che l&#39;agarosio wells sono nel piatto ben 24, Press Fit campioni in ciascun pozzetto. Il campione deve sporgere dalla parte superiore del pozzo agarosio. </li></ol> 5. Carico meccanico <ol><li> Sterilizzare piastra (Figura 2). </li><li> Fissare piastra di alluminio a cella di carico. Sicuro di carico lastra / cella di carico / alluminio assieme piastra sul palco. </li><li> Accendere il controller del motore passo-passo (interruttore sul retro). </li><li> Accendere il programma aperto &quot;APT utente&quot; (Figura 4) e PC. <ol><li> Schermo di sinistra controlla motore passo-passo orizzontale. Schermo destro controlla motore passo-passo verticale. In ogni schermata, &quot;Graphical Control&quot; scheda consente il posizionamento manuale e scheda &quot;Sposta Sequencer&quot; permette di automazione. Tutte le unità sono mm. </li></ol></li><li> Vai alla scheda &quot;Graphical Control&quot; su entrambi gli schermi e premere il tasto &quot;Home page / Zero&quot;. Entrambi i motori passo-passo hanno una gamma di 50 mm. Premendo il tasto &quot;Home page / Zero&quot; invierà entrambi i motori passo-passo alla posizione zero (top-e più a destra le posizioni). </li><li> Prepare i campioni nella piastra a 24 pozzetti per carico rimuovendo alcuni media da ciascun pozzetto. Non più di 1 ml di media dovrebbe essere lasciato in ciascun pozzetto per evitare overflow durante il caricamento. Assicurarsi che sufficienti mezzi è lasciato nel bene per mantenere il campione coperto. <ol><li> Si noti che l&#39;incubatore è tenuto in condizioni di bassa umidità per evitare il fallimento dello strumento. </li></ol></li><li> Luogo 24 pozzetti in bioreattore e con attenzione allinearsi con il rullo. <ol><li> La piastra è fissata al bioreattore mediante quattro localizzatori cinematiche regolabili. Per rendere più facile allineare la piastra, i due locatori sinistro sono stati pre-posizionati. Serrare i due locatori giusti in modo che la piastra è sicuro. Assicurarsi di allineare la piastra fino a filo con la parte anteriore della base bioreattore. </li><li> Nella scheda &quot;Graphical Control&quot;, una posizione specifica del motore passo-passo può essere inserito manualmente facendo clic sulla casella di posizione. Utilizzare questa funzionalità per abbassare lentamente il rullo e spostarlo orizzontalmente per allinearsi con la piastra. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Una volta che la piastra è vicino a venire a contatto con i campioni, iniziare a portare la piastra verso il basso con incrementi molto lenti (0,1 mm) fino a raggiungere la posizione di partenza prestabilito (vedi parte 6). </li><li> Una volta raggiunta la posizione di partenza, andare su &quot;Sposta Sequencer&quot; scheda e caricare la sequenza di spostamento desiderata premendo il tasto &quot;Load&quot;. Quindi premere &quot;Esegui&quot; per iniziare. (Figura 5) Cfr. parte 7. Scrittura di un protocollo di dosaggio. </li><li> Una volta terminato il caricamento, sollevare manualmente la piastra. Se i campioni sono attaccati alla piastra, con attenzione riporli negli appositi bene con una spatola sterile. </li><li> Togliere 24 pozzetti da bioreattore e sostituire i mezzi di comunicazione. </li><li> Rimuovere con cautela la piastra dalla cella di carico e poi spegnere gli strumenti. </li></ol> 6. Calibrazione Caricamento Platen Per garantire che i ceppi adeguate sono applicati ai campioni, ciascuna piastra deve essere attentamente calibrata prima di iniziare un esperimento. <ol><li&gt; Eseguire i punti da 5.1 a 5.8. </li><li> Mettere manualmente motore passo-passo orizzontale alla posizione 25 mm. </li><li> Platina attenzione abbassare che sia a malapena entra in contatto con la base del bioreattore. Cella di carico mostrerà maggiori carichi a questo punto. Prendere nota della posizione esatta del motore passo-passo verticale (essere il più preciso possibile, come tutte le misure di deformazione a compressione saranno calcolati da questo valore). </li><li> Registrare la posizione. Questo valore verrà utilizzato per scrivere un protocollo di dosaggio in base a campioni dimensioni e ceppi desiderati. </li></ol> 7. Scrittura di un protocollo di dosaggio <ol><li> Il bioreattore è capace di applicare ceppo sia a compressione ea taglio, contemporaneamente o singolarmente. Tre parametri principali devono essere decisi: ceppo di tara, ampiezza di deformazione dinamica di compressione, e la frequenza di carico. </li><li> Un ceppo di tara viene applicato per prevenire decollo della platina dal campione. </li><li> Esempio ampiezza di deformazione dinamica e caricamento frequenza sono scelti. </li></ol> In questo studio si definisce tensione di pressione e di taglio come segue: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="3.26in" fo:src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1.jpg" /> Esempio biassiale protocollo di dosaggio Spessore del campione: 2,25 millimetri Tara Strain (compressione): 10% dello spessore del campione (0,225 mm) Dinamico ampiezza di deformazione (compressione): 10% (+ / - 5% dello spessore del campione) Frequenza (compressione): 1 Hz Dinamico ampiezza della deformazione (taglio): 25% dello spessore del campione (0,5625 millimetri): Sforzo di taglio è applicata al campione dal piano mobile orizzontalmente. Frequenza (Shear): 0,5 Hz Protocollo tipico di dosaggio è di 3 ore di carica al giorno. In questo esempio, il caricamento dinamico e di taglio è applicata simultaneamente piuttosto che in sequenza. Crediamo che questo modello migliore mimic dell&#39;ambiente caricamento complesso nel ginocchio umano. <ol start="4"><li> Una volta che un protocollo di dosaggio è stato selezionato, un programma di sequenza di spostamento di compressione deve essere scritto. </li><li> La sequenza di movimento è esattamente quello che sembra, una lista di posizioni che il motore passo-passo si sposterà in una accelerazione e la velocità massima specificata. </li><li> Calcolare le posizioni verticali auspicate in base dosaggio protocollo e il valore di calibrazione piastra (da parte 6). </li><li> Calcoli di esempio per Platen 1 sono riportate di seguito: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Differenza dal valore di calibrazione </td><td> Posizione verticale </td></tr><tr><td> Platen valore di taratura (raggiunge la base del bioreattore) </td><td> 0 millimetri </td><td> 29,7700 millimetri </td></tr><tr><td> Platen entra in contatto con il campione (2,25 millimetri campione) </td><td> 4,4140 millimetri </td><td> 25,3560 millimetri </td></tr><tr><td> Stpioggia (5% Spessore) </td><td> 4,3015 millimetri </td><td> 25,4705 millimetri </td></tr><tr><td> Strain (10% Spessore) </td><td> 4,1890 millimetri </td><td> 25,5810 millimetri </td></tr><tr><td> Strain (15% Spessore) </td><td> 4,0765 millimetri </td><td> 25,6955 millimetri </td></tr></tbody></table><ol start="8"><li> Una volta che le posizioni sono calcolati, sperimentare con i valori di accelerazione e velocità massima per ottenere la frequenza corretta. Il numero dei cicli deve essere scelto, di conseguenza (es. 10.800 cicli per 3 ore a 1 Hz). </li><li> Esempio Compressione dinamica Programma sequenza Move (10% tara compressione, ampiezza di deformazione dinamica 10%, 1 Hz) (Figura 5) </li><li> Dinamico programma sequenza di spostamento di taglio: Il numero di cicli deve essere scelto in base alla frequenza desiderata e la durata (ad esempio 5.400 cicli per 3 ore a 0,5 Hz). </li><li> Esempio dinamico a taglio Programma sequenza di spostamento (10% tara compressione, 0,5,625 mila millimetri (25% dello spessore) ampiezza della deformazione di taglio dinamico, 0.5Hz) (Figura 5). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo progettato un dispositivo di carico, che è in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale di tessuto costrutti ingegnerizzati fabbricato per il trapianto. Il dispositivo può essere utilizzato come un bioreattore per la coltura in vitro di biocompositi ingegnerizzati o come un dispositivo di prova per descrivere le caratteristiche meccaniche del tessuto nativo o dopo altri trattamenti precedenti. I soggetti dispositivi progettati costrutti di tessuto biassiale a carico meccanic...

Abbiamo progettato un bioreattore di carico che è in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale ad un tessuto biocompositi costruiti fabbricati per il trapianto. Questo dispositivo è progettato principalmente come bioreattore per sostituzioni ingegnerizzati per cartilagine articolare, ma potrebbe essere utilizzato anche per altri tessuti portanti nel corpo umano. La nostra motivazione in questo disegno bioreattore nasce da Drachman e Sokoloff 1, che ha fatto l&#39;osservazione seminale di formazione anomala di cartilagine articolare in embrioni di pollo paralizzati a causa di assenza di movimento. Analogamente, l&#39;esercizio fisico è essenziale per lo sviluppo di muscolo normale e ossa. In linea con questo concetto, molti gruppi di ricerca hanno studiato come le diverse modalità di stimoli fisici durante la coltivazione in vitro modula le proprietà biochimiche e meccaniche della cellula-biomateriale biocompositi ed espianti di tessuto 2-7. Il concetto di ingegneria tissutale funzionalecoinvolge l&#39;uso in vitro di stimoli meccanici per migliorare le proprietà funzionali dei tessuti, cioè le proprietà meccaniche che consentono il tessuto per resistere alla sollecitazione previsto in vivo e forzerebbe 8,9. Numerosi studi riportano l&#39;uso carico meccanico in termini di taglio e compressione per stimolare costrutti cartilaginei ingegnerizzati per giunti articolari. Mauck et al. 10 suggeriscono che sola carico meccanico può indurre condrogenesi di cellule staminali mesenchimali anche in assenza di fattori di crescita che sono considerati vitali. Applicazione del carico meccanico intermittente come compressione oa taglio durante la coltura tissutale è stato dimostrato per modulare cartilagine e formazione ossea, tuttavia la dosimetria ottimale di caricamento varia con cellule e proprietà del tessuto 11. La funzione più importante della cartilagine articolare è la capacità di sopportare forze di compressione e di taglio entroil giunto, quindi deve avere alta compressione e moduli di taglio. La mancanza di resistenza meccanica funzionale e ultrastruttura fisiologico nella cartilagine ingegnerizzata ha provocato la rottura di neo-cartilagine in vivo e il fallimento delle strategie di sostituzione della cartilagine delle articolazioni. Sebbene compressione e taglio sono stati comunemente dimostrato di modulare e migliorare la resistenza meccanica del biocompositi cartilagine articolare, un approccio combinazione è rara 6,12-15. Wartella e Wayne 16 progettato un bioreattore che applicata tensione e compressione per la produzione di sostituti della cartilagine meniscale. Waldman et al. 15 progettato un dispositivo per applicare compressione e taglio di condrociti coltivati ​​in un substrato poroso calcio polifosfato. Bian et al. 17 hanno dimostrato proprietà meccaniche corrispondenti cartilagine nativa con la coltivazione in vitro dei condrociti canini adulti in gel e applicazione di biassiale mechmeccanicaa carico (compressione deformante carico e scorrevole contatto carico). Il carico biassiale bioreattore meccanico è stato originariamente progettato da Danielle Chu nel nostro laboratorio con l&#39;obiettivo generale di indurre adattamenti morfologici in tessuto cartilagineo ingegnerizzato costruisce con conseguente più alti moduli di compressione e di taglio rispetto a quelli attualmente disponibili 18. Crediamo che questa ricerca aumenterà in modo significativo la nostra comprensione più ampia di come mechanotransduction può essere modulata per ingegnere tessuti clinicamente rilevanti.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM, High glucose, pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 39346-81-1 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ITS+ Premix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354352</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen Strep Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>041-95780</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-2218</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonessential Amino Acid Solution 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7145</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5607</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2915</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human Transforming Growth Factor &beta;1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 31 Load Cell (1000 g)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AL311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Single Channel Display</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>SC500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LNR50SE/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Two Channel Stepper Motor Controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSC102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DRV014</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adjustable Kinematic Locator (4)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KL02</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Right Angle Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vertical Mounting Bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LNR50P2/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Solid Aluminum Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB3030/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates </td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1653312 and #1653310 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Biopsy Punch, 5 mm</td>
			<td>Miltex, Inc.</td>
			<td>33-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16 mm hollow punch</td>
			<td>Neiko Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>86735k19</td>
			<td>Custom-machined</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

design of a biaxial mechanical loading bioreactor for tissue engineering

Abbiamo progettato un dispositivo di caricamento che è in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale ad un tessuto biocompositi costruiti fabbricati per il trapianto. Mentre il dispositivo funziona principalmente come un bioreattore che imita le sollecitazioni meccaniche native, è anche dotato di una cella di carico per fornire forza feedback o prove meccaniche dei costrutti. I soggetti di dispositivi progettati costrutti cartilagine biassiale carico meccanico con grande precisione di dose di carico (ampiezza e frequenza) ed è abbastanza compatto per adattarsi all&#39;interno di un tessuto culturale incubatore standard. Si carica campioni direttamente in una piastra di coltura tissutale, e molteplici dimensioni piatto sono compatibili con il sistema. Il dispositivo è stato progettato utilizzando componenti prodotti per applicazioni laser a guida di precisione. Carico biassiale è compiuta da due fasi ortogonali. Gli stadi hanno una gamma di corsa 50 mm e sono azionati in modo indipendente da stepper attuatori motore controllata daun passo-passo del driver a circuito chiuso del motore che dispone di funzionalità di micro-stepping, consentendo dimensioni passo inferiori a 50 nm. Un polisulfone caricamento platina è accoppiato alla piattaforma mobile biassiale. Movimenti delle fasi sono controllate da Thor-laboratori Advanced Positioning Technology (APT) software. Il driver motore passo-passo viene utilizzato con il software per regolare i parametri di carico di frequenza e ampiezza di taglio e compressione sia indipendente e simultaneo. Retroazione di posizionamento è fornita da encoder ottici lineari che hanno una ripetibilità bidirezionale di 0,1 micron e una risoluzione di 20 nm, traducendo ad una precisione di posizionamento inferiore a 3 micron sulla intero 50 mm di corsa. Questi encoder forniscono la necessaria retroazione di posizione per l&#39;elettronica di azionamento per garantire reali capacità nanopositioning. Per fornire la retroazione di forza per rilevare contattare e valutare le risposte di carico, una cella di carico miniatura precisione è posizionato tra la piastra di carico e la movinpiattaforma g. La cella di carico è elevata precisione di 0,15% al ​​0,25% del fondo scala.

Il dispositivo è stato testato utilizzando gel di agarosio seminato con 20 milioni di cellule / ml e condrociti coltivati ​​in presenza di monoassiale (compressione) o biassiale (compressione e taglio) carico meccanico. Condrociti suina primari sono stati isolati dalla cartilagine articolare di 2-4 mesi di età maiali. Diametro di 5 mm e 1,5 campioni mm di spessore sono stati coltivati ​​in 2 ml di definito terreno di coltura condrogenico (High glucosio DMEM, 1% ITS + premiscela, 100 U / ml penicillina, 100 ug ...

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Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Abbiamo progettato un nuovo bioreattore carico meccanico in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale per un biocomposite cartilagine prima del trapianto in un difetto della cartilagine articolare.

Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l&#39;ingegneria tissutale

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

design-biaxial-mechanical-loading-bioreactor-for-tissue

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Bioengineering

Unit 1

Analysis and Design of Beams for Bending

SCIENTISTS IN ACTION

14.2K Views.  The Warren Alpert Brown Medical School of Brown University and the Rhode Island Hospital. Abbiamo progettato un nuovo bioreattore carico meccanico in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale per un biocomposite cartilagine prima del trapianto in un difetto della cartilagine articolare.

Video: Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l&#39;ingegneria tissutale

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Il funzionamento di un bioreattore da banco

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Per la pelle Ingegneria dei Tessuti

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per l'espansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a conventional optical system with an integrating sphere. Measuring systems for the acquisition of the diffuse reflectance and total transmittance spectra are constructed with a broadband white light source, a light guide, an achromatic lens, an integrating sphere, a sample holder, an optical fiber probe, and a multi-channel spectrometer. An acrylic mold consisting of two rectangular acrylic pieces and a U-shaped acrylic piece is constructed to create an epidermal phantom and a dermal phantom with whole blood. The application of a sodium dithionite (Na2S2O4) solution to the dermal phantom enables the researcher to deoxygenate hemoglobin in red blood cells distributed in the dermal phantom. The inverse Monte Carlo simulation with the diffuse reflectance and total transmittance spectra measured by a spectrometer with an integrating sphere is performed to determine the absorption coefficient spectrum &#181;a(&#955;) and the reduced scattering coefficient spectrum &#181;s&#39;(&#955;) of each layer phantom. A two-layered phantom mimicking the diffuse reflectance of human skin tissue is also demonstrated by piling up the epidermal phantom on the dermal phantom.

Here, we demonstrate how agarose-based tissue-mimicking optical phantoms are made and how their optical properties are determined using a conventional optical system with an integrating sphere.

Agarosio-basata del tessuto che imita Phantoms ottico per spettroscopia di riflettanza diffusa

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Caratterizzazioni biassiale meccaniche delle valvole atrioventricolari cuore

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

Bioprinting 3D di astrociti corticali murini per l'ingegneria del tessuto neurale

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...