Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema acoustofluidico in grado di fornire in modo efficiente biomolecole per una varietà di ricerche e applicazioni terapeutiche basate su cellule. Il vantaggio principale di questo sistema è che consente la consegna rapida di biomolecole alle cellule mantenendo la loro vitalità. È una tecnologia di piattaforma che consente di trasformare le cellule per una varietà di applicazioni terapeutiche cellulari, come il trattamento del cancro.
Inizia combinando 54 grammi di base PDMS e sei grammi di agente polimerizzante in una tazza. Mescolare vigorosamente e accuratamente con una spatola per almeno un minuto, quindi posizionare la tazza con la soluzione PDMS in un essiccatore per circa 30 minuti o fino a quando le bolle d'aria residua non vengono rimosse. Posizionare un wafer rivestito di fotoresist con i motivi rivolti verso l'alto in una piastra di Petri da 150 millimetri, quindi versare la soluzione PDMS sopra lo stampo.
Se necessario, posizionare la piastra di Petri all'interno di un essiccatore e applicare il vuoto fino a quando le bolle d'aria residuati scompaiono. Trasferire la piastra di Petri in un forno da laboratorio e cuocere per due ore a 60 gradi Celsius per curare il PDMS. Dopo la polimerizzazione, rimuovere con cura il PDMS dalla piastra di Petri tagliando intorno ai bordi del wafer con una lama di rasoio.
Ritagliare ogni singolo dispositivo utilizzando un coltello o una lama di rasoio, quindi forare i fori attraverso le porte di ingresso e uscita utilizzando un punzone di biopsia da 2,5 millimetri. Dopo aver trattato il dispositivo PDMS con plasma di ossigeno, posizionare immediatamente ogni dispositivo su uno scivolo al microscopio in vetro di calce soda pulita con canali rivolti verso la superficie del vetro. Lasciare che i dispositivi si unistano durante la notte a temperatura ambiente.
Applicare delicatamente il silicone sulla superficie del trasduttore piezo di un centimetro di diametro con uno spessore da uno a due millimetri, quindi allineare accuratamente il trasduttore con una spirale concentrica e premerlo delicatamente sul fondo dello scivolo del microscopio di vetro. Collegare un microcontroller a un computer utilizzando un cavo USB da A a B. Dovrebbero illuminarsi gli indicatori LED di alimentazione verde.
Utilizzare il software associato sul computer per caricare un programma che genera un segnale da otto megahertz. Saldare un filo calibro 22 da un pollice fino all'estremità di ogni filo sul trasduttore PZT. Quindi usalo per collegare il filo terminale negativo del trasduttore PZT a un pin GND.
Collegare il filo terminale positivo del trasduttore PZT al perno di uscita tramite il filo saldato. Tagliare sezioni da tre a sei pollici di tubi in plastica morbida in PVC tygon e spingere i tubi nelle porte di ingresso e uscita. Potrebbe essere necessario ruotare il tubo mentre si applica pressione fino a quando non si adatta all'apertura.
Opzionalmente, la colla può essere applicata alla giunzione per legare il PDMS e i tubi insieme. Facoltativamente, montare il dispositivo acoustofluidico e il microcontrollore in una custodia stampata in 3D. Assemblare il serbatoio microfluidico secondo le istruzioni del produttore.
Tagliare una sezione da tre a sei pollici di tubi di plastica morbida PVC di diametro interno da 1/16 pollici e spingerla sopra i tubi di diametro interno da 1/32 pollici dall'uscita del serbatoio microfluidico. Facoltativamente, avvolgere la giunzione con pellicola di paraffina per evitare perdite. Riempire una siringa da 60 millilitri con aria ambiente sul lato del serbatoio microfluidico.
Impostare la pompa della siringa su una velocità di 200 millilitri all'ora per spingere le soluzioni di agente di contrasto attraverso il dispositivo aoustofluidico a una portata volumetrica di 50 millilitri all'ora e raccogliere i campioni dall'uscita del dispositivo in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Preparare una soluzione fofolipidica in una fiala a scintillazione da 20 millilitri aggiungendo 25 milligrammi di DSPC, 11,6 milligrammi di DSEPC, 0,26 milligrammi di DSPG e 0,88 milligrammi di polietilene40 stearato. Aggiungere cloroformio fino a quando tutti i fosfolipidi non vengono sciolti.
Evaporare il cloroformio in un essiccatore per 48 ore per formare un film lipidico secco. Reidratare la schiuma con 10 millilitri di PBS sterile, quindi sonicare la soluzione lipidica per tre minuti al 40% di ampiezza per formare una soluzione micellare cationica. Dopo la sonicazione, la soluzione fofolipidica può essere conservata a due o sei gradi Celsius per un massimo di un mese.
Per preparare agenti di contrasto ad ultrasuoni, aggiungere 200 microlitri di soluzione micellare cationica in 600 microlitri di PBS sterile a una fiala di setto di vetro a due millilitri. Sigillare la fiala criticando il cappuccio. Utilizzare un ago calibro 20 da 1,5 pollici per riempire lo spazio della testa del flaconcino con gas decafluorobutano per 30 secondi.
Amalgamare il flaconcino per formare agenti di contrasto ad ultrasuoni riempiti di gas perfluorobutano. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di agente di contrasto ad ultrasuoni per un millilitro di soluzione cellulare. Quindi pompare immediatamente l'agente di contrasto combinato e la miscela cellulare attraverso il dispositivo austofluidico.
Questo protocollo produce un sistema acoustofluidico che può essere utilizzato per migliorare la consegna molecolare intracellulare in più linee cellulari. La consegna intracellulare di un composto fluorescente, la fluoresceina, alle cellule T umane primarie è stata migliorata con un trattamento acoustofluidico rispetto a un gruppo di controllo non trattato. L'intensità di fluorescenza delle cellule T è aumentata di cinque volte dopo il trattamento, indicando una maggiore erogazione di fluoresceina.
La vitalità cellulare è leggermente diminuita dopo un trattamento acoustofluidico, ma è rimasta al di sopra dell'80%Il trattamento acoustofluidico ha migliorato la consegna intracellulare di un composto conservante trealosio alle cellule del carcinoma polmonare A549 umano rispetto al solo flusso e alle cellule del gruppo di controllo non trattato. L'aggiunta delle microbolle cationiche alla soluzione cellulare è fondamentale. La somministrazione intracellulare di biomolecole sarà limitata senza microbolle cationiche in soluzione.
Questa piattaforma consente la somministrazione intracellulare di varie biomolecole, che possono alterare la funzione cellulare per scopi di ricerca o terapeutici. Dopo aver completato questa procedura, è possibile eseguire una caratterizzazione cellulare aggiuntiva per valutare l'impatto della fornitura di varie biomolecole.
