Questo lavoro è finanziato dal National Institutes of Health di Grant R01-EB 008836 e R01 HL083895 (sia per LEN). Si potrebbe ringraziare Daryl Smith, il Vetraio Università, per rendere il bioreattori per la nostra ricerca.

Autoclave Assemblare e autoclave i tubi per il sistema di flusso e dei componenti bioreattore (bioreattore stesso e il coperchio tappo in silicone), come indicato in Figura 1 e Figura 2. Tubo di alimentazione ha un connettore maschio da un lato e una fine aperta sull&#39;altro lato. Tre segmenti di tubo corto vengono inseriti attraverso un tappo in silicone per lo scambio di gas. 1. Cucire PGA Mesh <ol><li> Tagliare PGA mesh per 1,1 centimetri x ~ fogli da 8 cm (a seconda della dimensione bioreattore). </li><li> Tubi di silicone pulito (3 mm di diametro interno) con acqua distillata (dH20) e asciugare prima dell&#39;uso. </li><li> Usa Dexon 6,0 sutura a cucire PGA mesh attorno al tubo di silicone pulito a partire da tre nodi chirurgica seguita da singoli punti di sutura. </li></ol> 2. PGA Ponteggi Trattamento delle superfici <ol><li> Dip ponteggi PGA in NaOH 1M per 1-2min e registrare il tempo di trattamento e l&#39;uso stesso tempo per tutti i ponteggi PGA. </li><li> Sciacquare ponteggi PGA nei bagni dH2O per 2 minuti 3 volte. </li><li> Pat PGA ponteggi a secco con Kimwipes tra ogni tuffo nella dH O 2 bagni. </li><li> Secco PGA ponteggi sotto il cofano di coltura tissutale asciugare all&#39;aria per 15 minuti con il ventilatore. </li></ol> 3. Braccia Dacron da cucire <ol><li> Usa Prolene sutura 4,0 a cucire piccoli pezzi di polsini Dacron (1 cm) su ogni estremità della rete PGA con una sovrapposizione di 2-3mm. Nota: non stare attento a forare tubi di silicone (Figura 3). </li><li> Utilizzare la sutura stessa a cucire tre punti verso la fine senza polsini Dacron. Assicurarsi di lasciare abbastanza suture alle estremità libera di sutura Prolene per la fase 5.1 (Figura 3). </li></ol> 4. Assemblea dei bioreattori (giorno prima dell&#39;inizio della cultura bioreattore) <ol><li> Immergere maglia cucita e tubi in silicone, strumenti chirurgici, e un filo sottile in un bagno di etanolo al 70% per 20-30 minuti. </li><li> Aprire i sacchetti autoclave contenente il bioreattore e immergerlo in bagno etanolo al 70% per almeno 30 minuti prima del montaggio. Assicurarsi di lavare il bioreattore a fondo con l&#39;etanolo. L&#39;esposizione di tutti i componenti bioreattore al 70% di etanolo è un passo oltre la sterilizzazione. Questa operazione rimuove anche endotossina, che non viene rimosso in autoclave ed è nociva per le cellule vascolari. </li><li> Tirare tubo in silicone con bracci laterali con filo sottile di tirare fino in fondo. </li><li> Prendete bioreattore da bagno etanolo (tenere in rete sommersa in etanolo). Fissare il patibolo PGA all&#39;interno del bioreattore serrando polsini Dacron sopra le labbra bicchiere svasato stringendo e legando le suture Prolene (Figura 3). </li><li> Collegare un lato di armi bianche bioreattore ai connettori tramite tubo in silicone. </li><li> Tirare dall&#39;altra parte di tubo in silicone con tensione sufficiente e inserire i restanti due connettori in tubo in silicone. Mantenere il tubo in silicone strettamente quando si inseriscono i connettori! </li><li> Bioreattore reinserire in bagno a filo con etanolo e l&#39;etanolo tirando delicatamente connettori fuori dei bracci laterali. </li><li> Capovolgere bioreattore più e consentono un ammollo per 10 minuti. </li><li> Bioreattore flip lato destro in alto e prendere per altri 10 minuti. </li><li> Scaricare tutto l&#39;etanolo. </li><li> Creato tre grandi piatti di Petri (10 cm) in serie e bioreattori posto nel piatto centrale a tenere l&#39;etanolo in eccesso gocciolava dalle estremità dei tubi. </li><li> Flush bioreattori e PGA rete con acqua di coltura con una pipetta da 5 ml o 10 ml. Anche a livello della cultura dell&#39;acqua presente nei tessuti in tubo in silicone. </li><li> Accuratamente tutta l&#39;acqua di scarico in eccesso in piastre Petri su entrambi i lati del bioreattore. </li><li> Bioreattore asciugare durante la notte in cappa con ventilatore acceso e spento UV. </li><li> Note aggiuntive: assicurarsi ancoretta sterile è in bioreattore. Fare attenzione a non &quot;hover&quot; sopra il bioreattore da questo punto in avanti, per evitare contaminazioni. Tagliare un sacco di strisce parafilm e ammollo in una piccola vasca etanolo al 70% (grandi Petri funziona bene). </li></ol> 5. Giorno 1: installazione Bioreattore <ol><li> Inserire una piastra di Petri sterile oltre all&#39;apertura di ogni bioreattore per proteggere l&#39;interno PGA patibolo da sostanze contaminanti. </li><li> Assemblare sistema a flusso di bioreattore come indicato in Figura 4 e parafilm tutti i giunti di collegamento. <ol><li> Pulire i connettori prima con cotone imbevuto di alcol. </li><li> Fissare porta di iniezione a terzi, braccio inutilizzati di bioreattore. </li><li> Rimuovere il tubo di tricheco e legare fine blu della diluizione salina impostato come vicino al raccordo a Y possibile. Tirare fascetta in atto per garantire l&#39;assenza di trasferimento di liquidi a questa parte del tubo </li><li> Rimuovere borsa IV, e allegare tubi tricheco (rosso) di gran lunga fine di borsa IV. Assicurarsi di pulire porta di inserimento con batuffolo imbevuto di alcool prima. </li><li> Attaccare tricheco da un lato del sistema di flusso (tramite tubo estremità bianca). </li><li> Inserire 3-way rubinetto nel sistema di flusso. </li><li> Rimuovere trasduttore di pressione e la connessione a tre vie rubinetto. </li><li> Collegare altra estremità del trasduttore di pressione per l&#39;apertura centrale nella borsa. </li></ol></li><li> Collegareil bioreattore al sistema che attraverso lo Y-giunzione. Utilizzare una siringa da 60 ml per aggiungere 350ml di 1 Fungizone% (5 ml Fungizone mescolare con 495ml di PBS) per borsa IV. </li><li> Spremere borsa IV per sciacquare il sistema che scorre regolando la rubinetti arresto per consentire il flusso di PBS. Nota: controllare all&#39;interno bioreattore per assicurare che non si perde. </li><li> Risospendere 8 x10 6 SMC (circa un confluenti T75) in 1.25ml di medie e di semi su ogni scafffold PGA. Assicurarsi sospensione cellulare è stata uniformemente sgocciolava sul reticolo Dacron giunzione PGA così come sul lato inferiore del PGA mesh. </li><li> Pulire bordo del bioreattore con batuffolo imbevuto d&#39;alcol attraverso la rotazione del bioreattore lateralmente evitare bilico. </li><li> Coperchio tappo in silicone di montaggio (Figura 2) <ol><li> Peel borsa autoclave indietro attentamente, facendo attenzione a non esporre fondo del coperchio. </li><li> Fissare porta di iniezione a tubo di alimentazione al connettore maschio. </li><li> Allega PTFE 0,20 micron filtri a ciascuna delle tre porte d&#39;aria. </li><li> Fare attenzione a non esporre / toccare il fondo del coperchio durante questo processo. </li><li> Parafilm la porta di iniezione. </li></ol></li><li> Inserire il coperchio tappo in silicone in bioreattore in vetro e assicurarsi che il tubo di alimentazione all&#39;interno del bioreattore non tocca la ponteggi PGA seminato. Parafilm tutto il coperchio. </li><li> Luogo bioreattore con il sistema di flusso all&#39;interno dell&#39;incubatore (su un lato) e ruotare il bioreattore ogni 5 minuti per 25-30 minuti. </li><li> Riempire la camera bioreattore con 400 ml del nostro 4-10 terreni di coltura, come descritto nella (Tabella 1). Questo terreno di coltura è &quot;ottimizzato&quot; per le arterie suina ingegnerizzati. </li></ol> 6. Giorno 6-7: Accensione della pompa, e prima alimentazione <ol><li> Crescono i ponteggi seminato staticamente senza pulsatile di pompaggio attraverso il tubo in silicone per 6-7 giorni. Non c&#39;è bisogno di cambiare mezzo o la supplementazione di vitamina C durante questo periodo. </li><li> Assicurarsi che non vi siano perdite di PBS o attorcigliamento del tubo di flusso del sistema prima di attivare la pompa. </li><li> Accendere la pompa del sistema di flusso e assicurarsi di regolare le impostazioni della pompa in modo che la pressione si legge circa 270/-30mmHg. </li><li> Pressioni registrare ogni giorno in tutta la cultura e mantenere la pressione a 270/-30mmHg. Trasduttore di pressione può essere collegato a un computer per leggere e monitorare la pressione. </li></ol> Alimentazione prima <ol start="5"><li> Montare iniezione indiretta e PTFE filtro sulla alimentazione coperchi sia per il cambiamento medio e medio deposal scopi rifiuti. </li><li> Posizionare il tubo di alimentazione saldamente sulla pompa e inserirne l&#39;estremità all&#39;alimentazione porta del bioreattore e l&#39;altra estremità al coperchio di alimentazione. Assicurarsi di pulire le porte di iniezione con salviette etanolo. </li><li> Utilizza un processore dual-direzionale pompa Masterflex per pompare fuori 200 ml di mezzo. Quindi utilizzare un nuovo tubo di alimentazione alla pompa 200 ml di terreno fresco di nuovo nel bioreattore. Iniziano sempre con una velocità molto lenta, soprattutto quando si pompano ritorno medio del bioreattore. </li><li> Cambiamenti a medio e acido ascorbico 2x/sett supplemento. Per aggiungere acido ascorbico, utilizzare una siringa 30ml per eliminare 25ml di media e riporla nel cappuccio di tessuto. Sciogliere 25 mg di acido ascorbico in 5 ml di PBS e filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron. In primo luogo iniettare l&#39;acido ascorbico sterile nel tubo di alimentazione e aggiungere nuovamente il medium 25ml presi in precedenza. La ricetta di media è riportata nella Tabella 1. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. I tubi e connettori per l&#39;assemblaggio del sistema di flusso è mostrato sopra. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Il tappo in silicone montaggio coperchio è mostrato sopra. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Schemi di montaggio bioreattore sono indicati sopra. All&#39;interno del polsini Dacron bioreattore sono fissati sulle braccia di vetro con i nodi di sutura blu. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Sistema a flusso collegato a tubi e bioreattore è mostrato sopra. L/S18 tubi sarà pompata da una pompa Masterflex e quindi guida il flusso. Il trasduttore di pressione misura la pressione prima di entrare nel bioreattore a flusso superiore. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Immagine di raccolta nave progettata. Vasi Progettato apparirà opaco e raggiungere uno spessore di circa 250μm dopo 8 settimane di cultura in condizioni pulsatile. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Ematossilina ed eosina macchiato sezioni trasversali dei vasi ingegnerizzati. A e B sono di 8 settimane non-pulsato e pulsata navi, rispettivamente.C e D sono vasi non-pulsato e ad impulsi di 4 settimane, rispettivamente. L indica il lato del lume dei vasi. La barra di scala è 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Masson tricromica macchie per il collagene (blu) per le sezioni trasversali dei vasi ingegnerizzati. A e B sono 8 settimane di imbarcazioni non a impulsi e ad impulsi, rispettivamente. C e D sono vasi non-pulsato e ad impulsi di 4 settimane, rispettivamente. Si noti che le 4 settimane di nave pulsata mostra più collagene rispetto al suo non-pulsato controparte. Frecce bianche indicano ancora frammenti PGA nei vasi. La barra di scala è 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. Colorazione immunochimica dei marcatori SMC nei bovini arterie artificiali. Muscolo liscio α-actina, calponina-1, e liscia la catena pesante della miosina muscolare (SMMHC) sono primi, intermedio e in ritardo marcatori SMC contrattile, rispettivamente. Entro la fine di 12 settimane di cultura, le cellule della parete dei vasi esprimere SM α-actina e moderate quantità di Calponin-1 e SMMHC. La barra di scala è 20μm. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> DMEM (DME / bassa modificato) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (siero fetale bovino) inattivato con il calore </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1,0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> Vitamina C (sciolto in PBS o DMEM) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Proline / Glycine / Alanina 25 mg/25 mg/10 mg (sciolta in 5 ml di PBS) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1.5 mcg (sciolto in1 ml di PBS) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Penicillina G a 10.000 unità / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> PDGF-BB (derivato dalle piastrine fattore di crescita-BB) a 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> bFGF (fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti) a 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Componenti di media &quot;4-10&quot; sono riportati nella tabella sopra riportata. Con l&#39;eccezione di PDGF-BB e bFGF, tutti gli altri componenti devono essere filtrate attraverso un filtro 0.2μm prima dell&#39;uso.

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	<li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis.">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li><li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion.">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li><li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+arteries+grown+in+vitro.">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li><li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+porcine+arteries:+Effects+of+scaffold+modification.">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li><li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts.">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li><li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries.">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li><li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li><li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valent&#237;n, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors,+Intravital+Imaging,+and+Biomechanical+Modeling.">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li><li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -. c., Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li><li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs.">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+engineered+from+human+cells.">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li><li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La qualità delle navi ingegneria è in gran parte dettata dalla qualità della SMC utilizzati in coltura. Gli aspetti critici del fenotipo SMC comprendono morfologia contrattile, numero passaggio basso, e la capacità di proliferare all&#39;interno del bioreattore. Si raccomanda che il numero passaggio essere superiore a P3, al momento della semina di cellule sul patibolo polimero. Inoltre, è fondamentale per confermare che i sorgenti di SMC sono liberi micoplasma prima dell&#39;uso. Abbiamo osservato che il micoplasm...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / materiale </th><th> Fornitore </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> FBS (Fetal Bovine Serum) inattivato per calore </td><td> Hyclone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF-base </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td> Sigma </td><td> PENNA </td></tr><tr><td> Di rame (II) solfato </td><td> Sigma </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> Sigma </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-Alanina </td><td> Sigma </td><td> A7469-25G </td></tr><tr><td> L-prolina </td><td> Sigma </td><td> P5607-25G </td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A4544-25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td></tr><tr><td> Silicone Stopper </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex tubi L / S </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06508-16, 06508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex pompa </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> Dacron bracciale </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA feltro </td><td> Concordia </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1,5 metrico Surgipro II sutura </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0,7 sutura Dexon metrico </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE filtri </td><td> Whatman </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> Three Way rubinetto </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> Trasduttore di pressione </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IV borse </td><td> Baxter </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> Diluizione di Saline </td><td> Freccia </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> Tubi di silicone </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor

Molti sforzi sono stati dedicati a sviluppare e far progredire la metodologia per la rigenerazione funzionale di piccolo diametro bypass arterioso. In ambiente fisiologico, sia la stimolazione meccanica e chimica sono tenuti a mantenere il corretto sviluppo e la funzionalità dei vasi arteriosi 1,2. Sistemi di coltura bioreattore sviluppato dal nostro gruppo sono stati progettati per sostenere la rigenerazione all&#39;interno di una nave controllata con precisione chemio-meccanico ambiente imitando quella dei vasi nativi. La nostra assemblea bioreattori e procedure di manutenzione sono abbastanza semplici e altamente ripetibili 3,4. Cellule muscolari lisce (SMC) sono seminate su un acido poliglicolico tubolare (PGA) maglia che viene infilato nel tubo in silicone compatibile e colta nel bioreattore, con o senza stimolazione pulsatile per un massimo di 12 settimane. Ci sono quattro caratteristiche principali che contraddistinguono la nostra bioreattore da alcuni predecessori. 1) A differenza di altri sistemi di coltura che simulano soltanto la biochimica dei vasi sanguigni circostanti nativi, il nostro bioreattore crea anche un ambiente fisiologico pulsatile applicando ciclica deformazione radiale dei vasi nella cultura. 2) Più imbarcazioni progettate possono essere coltivate simultaneamente in diverse condizioni meccaniche all&#39;interno di un ambiente chimiche controllate. 3) Il bioreattore permette una mono strato di cellule endoteliali (CE) per essere facilmente rivestiti sul lato luminale dei vasi progettato l&#39;impianto per i modelli animali. 4) Il nostro bioreattore può anche recipienti di coltura progettata con dimensioni di diverso diametro varia da 1 mm a 3 mm, risparmiando lo sforzo di adattare ogni singolo bioreattore per adattarsi a una dimensione specifica diametro. I vasi progettati colta nel nostro bioreattore assomigliano vasi sanguigni nativo istologicamente in una certa misura. Cellule nelle pareti dei vasi esprimere maturo marcatori SMC contrattili come catena pesante della miosina del muscolo liscio (SMMHC) 3. Una notevole quantità di collagene si deposita all&#39;interno della matrice extracellulare, che è responsabile per la massima resistenza meccanica dei vasi progettati 5. Analisi biochimica indica anche che il contenuto di collagene dei vasi ingegnerizzati è paragonabile a quella delle arterie native 6. È importante sottolineare che il bioreattore pulsatile ha costantemente rigenerato navi che presentano proprietà meccaniche che permettono l&#39;impianto esperimenti di successo in modelli animali 3,7. Inoltre, questo bioreattore può essere ulteriormente modificato per consentire in tempo reale valutazione e monitoraggio del rimodellamento del collagene nel corso del tempo, non invasivo, usando una non lineare microscopia ottica (NLOM) 8. Per concludere, questo bioreattore dovrebbe servire come una piattaforma eccellente per studiare i meccanismi fondamentali che regolano la rigenerazione funzionale di protesi vascolari di piccolo diametro.

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di coltura bioreattore che imita lo stress pulsatile fisiologica del sistema cardiovascolare per rigenerare impiantabili protesi vascolari di piccolo diametro.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.9K Views.  Yale University. Il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di coltura bioreattore che imita lo stress pulsatile fisiologica del sistema cardiovascolare per rigenerare impiantabili protesi vascolari di piccolo diametro.

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Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l&#39;ingegneria tissutale

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Ricerca

Bioingegneria

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Il funzionamento di un bioreattore da banco

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Costruzione e caratterizzazione di un Fold bioreattore Novel Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Tecnica chirurgica per l&#39;impianto di ingegneria tessutale vascolari Innesti e successive<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Un bioreattore Novel per l&#39;alta densità di coltivazione diverse comunità microbiche

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.