Marie Curie Outgoing International Fellowship (dell&#39;Unione europea FP/2007-2013 convenzioni di sovvenzione # 221834 e 254780), JD McDonnell Foundation, NSF sovvenzione SBE 0542013, National Institutes of Health di Grant NS034994, Istituto Nazionale di Salute Mentale di Grant MH5467 e la Howard Hughes Medical Institute (Janelia Farm Research Campus di sovvenzione).

1. Costruzione del Microdrive Tutte le unità sono realizzati gli stessi elementi di base: una parte mobile, che porta l&#39;elettrodo e una parte fissa, che viene ancorato al cranio. Un microdrive ideale permette liscia, ma abbastanza lunga corsa degli elettrodi in più a piccoli passi, è abbastanza robusto per evitare il movimento accidentale del dell&#39;elettrodo, facile da manipolare da parte dello sperimentatore, senza interferire con il comportamento dell&#39;animale, di piccole dimensioni e leggero nel peso. Come risultato di questi requisiti concorrenti, diversa bagno unità applicazioni diverse. Solo 4 le parti sono necessari per costruire la nostra unità di base: un appartamento vite a testa in ottone, un dado di corrispondenza, un ponte di plastica preparato da una singola intestazione di riga e due pin personalizzato taglio tavole di bronzo. <ol><li> Break a 3-pin pezzi dall&#39;intestazione </li><li> Estrarre delicatamente il perno centrale. </li><li> Allargare il foro di perforazione attraverso di essa con una dimensione di punta # 55. </li><li> Tagliare una parolaletto utilizzando il 00-90 rubinetto. </li><li> Tagliate due pezzi fuori della lastra di ottone. </li><li> File i bordi delle piastre con un Dremmel. </li><li> Praticare un foro nel mezzo di entrambi i pezzi con una dimensione di punta # 65. </li><li> Montare i pezzi di trasmissione in modo che le tavole di bronzo sono toccare i perni. Per fare questo, inserire la vite di ottone attraverso, successivamente, la targhetta d&#39;ottone, il foro filettato dei pin, la targhetta d&#39;ottone secondo e il dado. Stringere la vite delicatamente in modo che il gruppo diventa stabile. </li><li> Saldare il perno di estremità le tavole di bronzo. </li><li> File l&#39;estremità sporgente della vite. </li><li> Saldare il dado alla vite. Fare attenzione a non saldare il dado per la targhetta d&#39;ottone. </li><li> Verificare il movimento del disco: girare la vite in senso orario per sollevare il ponte in plastica. </li></ol> 2. Preparazione della sonda di silicio Prima di fissare la sonda all&#39;unità, aggiungere isolamento supplementare per la zona di incollaggio della sonda per evitare cerebrospinal liquido (CSF) o umidità di produrre corto circuiti: <ol><li> Pesare e miscelare i componenti in elastomero Sylgard in un rapporto di 10:1. </li><li> Usando un applicatore cotone affilata, applicare il Sylgard all&#39;estremità superiore della sonda. </li><li> Lasciare asciugare in un forno preriscaldato a 60 ° C per 2 ore. </li></ol> Per garantire che i siti di registrazione sono privi di residui, le punte devono essere puliti: <ol start="4"><li> Preparare una diluizione del 4% di detergente Contrad. </li><li> Sia la sonda immergere il detersivo a 63 ° C per almeno 2 ore. </li><li> Sciacquare il detersivo off immergendo la sonda più volte in acqua distillata. </li></ol> Prima di fissare la sonda per l&#39;unità, l&#39;impedenza di ogni sito registrazione deve essere controllato: <ol start="7"><li> Immergere la sonda nella soluzione salina allo 0,9%, e collegarlo a una impedenza-meter. Se i siti di registrazione troppi hanno impedenza corretta, ripetere i passaggi da 2,4-2,6 o di considerare l&#39;utilizzo di una sonda diversa.Qui usiamo un modulo di impedenza condizionata da Federico Haer, Co. (FHC), combinato con un selettore di canale in casa. In alternativa, uno niPOD da NeuroNexus, Inc. o NanoZ da Neuralynx, Inc. permette il monitoraggio dell&#39;impedenza di tutti i canali sonda simultaneamente. </li></ol> 3. Apposizione la sonda al microdrive <ol><li> Utilizzando una lama di rasoio, tagliato scanalature multiple nel ponte per creare una superficie ruvida. </li><li> Appose la sonda per il ponte del drive. Questa procedura è fatto meglio sotto un microscopio operativo, tenendo l&#39;azionamento con un morsetto e regolando la sonda da un micromanipolatore modo che i gambi sono perfettamente parallelo con la vite di azionamento. Questo assicura che durante l&#39;avanzamento, il movimento della sonda gambi nel tessuto cerebrale senza &#39;tagliare&#39; attraverso di essa. La profondità esatta delle punte delle sonde rispetto alla base dell&#39;unità dovrebbe essere determinata in questa fase, prendendo in considerazione la profondità della struttura bersaglio dalla superficie dellocranio. </li><li> La sonda viene poi fissato al ponte con cemento impugnatura. </li><li> Opzionale: per visualizzare la traccia sonda nel cervello, soluzione DII (1-2% diluito in etanolo) può essere applicato alla parte posteriore della sonda in questa fase. </li></ol> 4. Preparazione del cranio Prima dell&#39;intervento, gli elettrodi di riferimento e di terra, e le parti della testina in gabbia di Faraday sono preparati: <ol><li> Tagliate due pezzi 2 &quot;-lunghi di filo di rame, e saldare una estremità di ogni filo di rame isolato per circa 1 mm. </li><li> Utilizzando un ago, raschiare la testa di uno, 00-90 1/8 &quot;vite in acciaio inossidabile e saldare un pezzo di filo di rame ad esso. Saldatura tali viti in acciaio inossidabile a terra elettrodi richiede un flusso adeguato (per esempio, N-3 Tutte le finalità La flusso da-Co) e alte temperature punta di saldatura. accuratamente evitare saldatura di fluire nella scanalatura della vite. verrà utilizzato come elettrodo di massa. Ripetere con un&#39;altra vite e filo di rame per prepararel&#39;elettrodo di riferimento. </li><li> Tagliare pezzi trapeziodal dalla maglia di rame. Questi pezzi da assemblare per proteggere il headstage. </li></ol> Gli strumenti chirurgici e la preparazione sono gli stessi utilizzati in molti interventi di piccoli animali. L&#39;intero intervento viene fatto in anestesia profonda isoflurano, utilizzando condizioni asettiche, secondo le linee guida approvate NIH. Si prega di notare che il (finto) Chirurgia mostrato in questo video è solo a scopo dimostrativo. Per scopi di visibilità appropriati e riprese, diverse fasi preparatorie, le precauzioni e le procedure chirurgiche postoperatorie non vengono mostrati / visibile o discusso. Prima dell&#39;intervento, tutti i componenti e le forniture devono essere sterilizzati, a seguito di procedure appropriate (vedi Linee guida per la chirurgia di sopravvivenza roditori; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). Durante l&#39;intervento chirurgico, un campo sterile sul cranio è preparato e isolato da teli sterili. Al termine della chirurgia, un antibiotici ad ampio spettro è unpplied a livello locale e una lunga durata d&#39;azione analgesico è somministrato per via intramuscolare (ad esempio, buprenorfina, [Buprenex] 0.05 mg / kg). Inoltre, antidolorifico (ad esempio, ibuprofene) è fornita in acqua potabile a circa 60 mg/kg/24 ore per 5 giorni. Per le corrette procedure chirurgiche e anestesia, consultare fonti appropriate 12. <ol start="4"><li> Installare l&#39;animale l&#39;apparato stereotassico, barba e pulire il cuoio capelluto 13. </li><li> Tagliare la pelle lungo la linea mediana e mettere da parte il cuoio capelluto. Rimuovere il periostio, pulire ed asciugare il cranio. </li><li> Misurare la posizione e la distanza tra il bregma e lambda, e determinare le coordinate x e y del sito di impianto della sonda di conseguenza utilizzando un atlante stereotassico 14. Segna il sito raschiando una croce sul cranio con un bisturi. </li><li> Forare il cranio con un rotondo punta testa (dimensioni ¼) e le viti di supporto di unità (in acciaio inox, 000-120, 1/16 &quot;) a metà strada nell&#39;osso, su piastre ossee diversi sulla sommità di unand sul lato del cranio. Le viti forniranno tasselli in modo sicuro bond il copricapo al cranio. </li><li> Praticare dei fori al di sopra del cervelletto e inserire il suolo e elettrodi di riferimento preparate in fase 4.2. Per registrare potenziali di campo locale (LFP), la scelta del sito di riferimento è critica. Questo sito è stato scelto perché LFP cerebellare è il più piccolo di tutte le regioni corticali e degli artefatti muscolari sono minimi in questa posizione mediana. </li><li> Applicare dentina attivatore (Metabond kit) utilizzando un pennello piccolo su tutta la superficie del cranio. Sciacquare con soluzione salina allo 0,9%. </li><li> Applicare il cemento dentale (Metabond kit; seguire le istruzioni del produttore per la miscelazione), sul cranio, coprendo con cura le viti di ancoraggio e la terra e gli elettrodi di riferimento, ma lasciando il sito di impianto della sonda chiaro. </li><li> Fissare i quattro lembi di maglia di rame (preparato nella fase 4.3) al cranio. Per questo, cementare la base ristretta di ciascuna di esse alle anteriori, i lati sinistro, destro e posteriore del cranio. Thrame e non dovrebbe mai essere in contatto diretto con l&#39;osso, ma sempre separati da uno strato di cemento. </li></ol> 5. Preparazione della superficie del cervello <ol><li> Usando un po &#39;la testa rotonda trapano, praticare intorno al sito di impianto in più fasi, mentre spesso l&#39;osso irrigazione con soluzione fisiologica. </li><li> Rimuovere con attenzione il lembo osseo e irrigare la superficie del cervello. </li><li> Per inserire un multiplo-codolo sonda, una striscia di grande dura viene rimosso. Due strumenti sono necessari per rimuovere la dura madre: un bisturi e un gancio preparato da un ago di insetto (in alternativa, un microelettrodo tungsteno standard). Piegare la punta dell&#39;ago spingendo contro una superficie dura (ad esempio vetrino da microscopio vetro), e collegarlo a una maniglia (qui, un pezzo di legno, Q-tip, in alternativa, un porta-aghi microdissecting). </li><li> Sollevare la dura con il gancio, e tagliare con un bisturi. Particolare cura viene posta per evitare di danneggiare la pia, le navi e la superficie della neocorteccia. Emorragia di piccole dimensioni può essere risoltodall&#39;irrigazione soluzione salina. Se il sanguinamento maggiore si verifica o la neocorteccia è compromessa in alcun modo, si dovrebbe considerare che chiude la chirurgia e la preparazione di un altro animale. </li></ol> 6. Impianto la sonda In questa fase, la densità e l&#39;orientamento di navi superficie corticale sono attentamente valutati. Coordinate Stereotassica deve essere regolata, perché la sonda deve penetrare nel cervello in una zona libera da imbarcazioni più grandi. Per l&#39;impianto, il gruppo di azionamento può essere tenuto con un coccodrillo attaccato al titolare stereotassica. Visibilità senza interruzioni della superficie del cervello e le punte della sonda sono fondamentali per la penetrazione di successo. <ol><li> Lentamente abbassare la sonda fino a circa 1 mm al di sopra del target di riferimento, mentre costantemente irrigando la craniotomia con soluzione fisiologica. Per la registrazione neocorticale, le punte della sonda calata nella corteccia circa 0,5 mm e sollevato di nuovo vicino alla superficie. </li&gt; <li> Sigillare la craniotomia applicando una miscela fusa calda di olio di paraffina e cera attraverso un ago (10-20g di cera in 10 ml di olio di paraffina, riscaldata a 65 ° C). Prima dell&#39;applicazione, raffreddare la miscela a 30 ° C e verificare la densità. Dovrebbe essere abbastanza morbido per permettere un facile spostamento della sonda). Per facilitare la copertura completa, la miscela può essere fuso in situ avvicinando la cera indurito con la punta di un micro-cauterizer. </li><li> Fissare la parte inferiore dell&#39;unità al cranio con il cemento la presa, facendo attenzione a lasciare il dado libero di girare. È di estrema importanza per evitare accidentali &quot;bump&quot; dell&#39;unità in questa fase, la sonda altrimenti danneggiare la corteccia. Dopo che l&#39;unità è fissato al cranio, movimento regolare della sonda deve essere verificata. </li><li> Cementare parte del connettore della sonda al cranio. </li></ol> 7. Costruire la testata on-gabbia di Faraday <ol><li> Tirare verso l&#39;alto e montare le alette di rame mesh in un cilindro di protezione della sonda e DRIve. Il cilindro serve anche come uno scudo elettrico dal rumore ambientale e gli artefatti onda lenta prodotte dai baffi cariche nel comportamento degli animali. </li><li> Regolare l&#39;altezza cilindro tagliando il materiale in eccesso in modo che la rete di rame è a livello con la parte superiore del connettore della sonda. </li><li> Saldare i fili di riferimento e viti di terra agli appositi contatti del connettore. Anche per saldare adiacenti lembi di maglia di rame insieme per garantire la loro continuità elettrica, e saldare il filo di terra alla maglia di rame. </li><li> Applicare uno strato di cemento presa sulla maglia in rame per rinforzarlo e per evitare qualsiasi contatto diretto tra il metallo e la pelle dell&#39;animale. Facoltativamente, applicare uno strato di resina epossidica per rafforzare ulteriormente il copricapo. </li><li> Testare il movimento della vite di azionamento. </li><li> Coprire la sommità della cuffia con un pezzo tagliato da un guanto di gomma. </li></ol> 8. Registrazione nella animali liberi di muoversi <ol><li> Dopo approprimangiato post-operatorio, collegare l&#39;animale al sistema di registrazione con un headstage ad alta impedenza e un peso leggero, ultraflessibile multi-strand cavo. Bilanciare il peso della cuffia. </li><li> Verificare la qualità della registrazione ogni giorno nel homecage. La posizione dei siti di registrazione viene giudicato da modelli unitari sia cottura e la forma dei potenziali di campo locali. Abbassare la sonda gradualmente ruotando la vite di piccoli incrementi (tipicamente 1/8 1/4 di giro al giorno, ossia 35-70 micrometri) fino alla struttura obiettivo viene raggiunto. </li></ol> 9. Risultati rappresentativi Segnali elettrofisiologici (potenziale del campo locale e unità di attività) variano a seconda della struttura e registrato il comportamento corrente dell&#39;animale. La figura 1 mostra alcuni esempi di 32 canali CA1 dell&#39;ippocampo registrazioni mentre il ratto sta esplorando un campo aperto. Si noti la prominente 8 Hz (banda theta) oscillazione del potenziale del campo locale durante l&#39;esplorazione con superimposed spiking su gambi e siti (esempi di picchi indicati dalla freccia). Per analizzare l&#39;attività neuronale unità, i picchi vengono individuati e ordinati in singole unità che utilizzano cluster analysis della loro forme d&#39;onda 15-16. <img src="/files/ftp_upload/3568/3568fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Registrazioni CA1 dell&#39;ippocampo nei ratti comportamento utilizzando un 4 gambi x 8 siti sonda silicio. Le registrazioni sono a banda larga e campionato a 20 000 Hz, che permette di studiare sia le oscillazioni potenziali locali di campo (ad es band &quot;theta&quot; 8 ritmo Hz) e l&#39;attività neuronale spiking. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3568/3568table1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3568/3568table1.jpg" alt="Tabella 1" /></a> Tabella 1. Alternative alla reagenti e delle attrezzature utilizzate.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo film illustra la procedura di impianto di sonde di silicio per cronici su larga scala le registrazioni nel ratto comportarsi. Passaggi critici per garantire registrazioni di qualità di attività neuronale nascono dalla fragilità sia biologico (tessuto cerebrale) e tecnica (silicio sonda) dei materiali. Particolare attenzione dovrebbe essere presa durante la manipolazione della sonda per evitare il contatto di denti da remoto con qualsiasi superficie &quot;dura&quot; (per esempio, i gambi si rompono se uno di lo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Silicon sonda Buzsaki32, 4 stinchi x 8 siti. Packaging: cavo flessibile in poliammide </td><td> Materiale </td><td> NeuroNexus </td><td> Sonda: buzsaki32 Packaging: HC32 </td><td> Registrazione della sonda </td></tr><tr><td> Vite di ottone rotonda, 00-90 x 1/2 Viti circolare di ottone </td><td> Materiale </td><td> JIMorris </td><td> R0090B500 </td><td> Unità parte </td></tr><tr><td> Dado Ottone Hex, 00-90 </td><td> Materiale </td><td> JIMorris </td><td> N0090B </td><td> Unità parte </td></tr><tr><td> Brass Strip C260, ASTM-B36 Spessore: 0.025 &quot;, Lunghezza: 12&quot;, Larghezza: 1/2 &quot; </td><td> Materiale </td><td> Parti piccole </td><td> B000FMYU72 </td><td> Unità parte </td></tr><tr><td> Connector Header, passo da 2 mm, male, singola riga, straigt, 36 posizioni </td><td> Materiale </td><td> Digikey </td><td> 2163S-36-ND </td><td> Unità parte </td></tr><tr><td> 2-parte Sylgard silicone elastomero </td><td> Materiale </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> SYLG184 </td><td> Per extra-isolare la sonda </td></tr><tr><td> Decon CONTRAD 70 Detergente Liquido </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> 04-355 Decon Laboratories No.: 1002 </td><td> Per pulire i siti di registrazione </td></tr><tr><td> Modulo di condizionamento Impedenza </td><td> Attrezzatura </td><td> FHC Inc. </td><td> 55-70-0 </td><td> Impedenza metro </td></tr><tr><td> niPOD - 32 canali </td><td> Attrezzatura </td><td> NeuroNexus </td><td> niPOD -32 </td><td> Impedenza metro </td></tr><tr><td> Grip Industrial Grade Cement </td><td> Materiale </td><td> Caulk Dentsply </td><td> 675571 (polvere) 675572 (solvente) </td><td> Grip cemento </td></tr><tr><td> 1,1 &#39;-diottadecil-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato (&#39;DII&#39;; DiIC18 (3)) </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> Per colorare la traccia sonda nel cervello </td></tr><tr><td> Macchina a vite in acciaio inox, testa Binding, Drive intaglio, # 00-90, 1/8 &quot; </td><td> Materiale </td><td> Parti piccole </td><td> MX-0090-02B </td><td> Terra e viti di riferimento </td></tr><tr><td> Magnet filo, 20G, rivestimento in nylon-poliuretano, MW80 </td><td> Materiale </td><td> Parti piccole </td><td> B000IJYRP2 </td><td> Terra e filo di riferimento </td></tr><tr><td> Macchina a vite in acciaio inox, responsabile Binding intaglio Drive, # 000-120, 1/16 &quot; </td><td> Materiale </td><td> Parti piccole </td><td> MX-000120-01B </td><td> Viti di ancoraggio </td></tr><tr><td> N-3 All Liquid Flux scopo </td><td> Reagente </td><td> La-Co (Markal) </td><td> 23512 </td><td> Permette di saldare acciaio inossidabile </td></tr><tr><td> Microgrid Precision Expanded Rame </td><td> Materiale </td><td> Dexmet </td><td> 3 CU6-050 FA </td><td> Rete in rame per il testa a gabbia di Faraday </td></tr><tr><td> C &amp; B-METABOND veloce! Cemento System - Dentin Activator </td><td> Materiale </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> C &amp; B-METABOND veloce! Cemento System - cemento dentale </td><td> Materiale </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> Sharp punto l&#39;ago di tungsteno e supporto </td><td> Strumento </td><td> Strumenti chirurgici Roboz </td><td> RS e RS-6064-6061 </td><td> Per rendere il gancio per sollevare la durata </td></tr><tr><td> Carbide Bur HP 1/4 </td><td> Strumento </td><td> Henry Schein </td><td> 9990013 </td><td></td></tr><tr><td> Paraffina (granuli) </td><td> Materiale </td><td> Fisher Scientific </td><td> P31-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mineral Oil, Light (NF / FCC) </td><td> Materiale </td><td> Fisher Scientific </td><td> O121-1 </td><td></td></tr><tr><td> GC ELECTRONICS 10-114 2-Part adesivo epossidico </td><td> Materiale </td><td> Newark </td><td> 00Z416 </td><td></td></tr><tr><td> Tipo 1 LITZ 21 AWG 40/36 Red singolo Poliuretano-Nylon (MW80-C) A 0,041 &quot;+ / -0,002&quot; OD </td><td> Materiale </td><td> New England Wire Technologies Corporation </td><td> N28-36E-400-2 </td><td> Per rendere il cavo tra l&#39;headstage e l&#39;amplificatore </td></tr><tr><td> 32 canali Very Large Scale Integration headstage, 20x guadagno </td><td> Attrezzatura </td><td> Plexon </td><td> HST/32V-G20 </td><td> Headstage </td></tr></tbody></table>

large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents

Una delle principali sfide nel campo delle neuroscienze è il collegamento comportamento per l&#39;attività collettiva di gruppi neurali. Comprensione delle relazioni input-output dei neuroni e dei circuiti richiede metodi con la selettività spaziale e risoluzione temporale adeguata per l&#39;analisi meccanicistica ensemble neurali del comportamento animale, la registrazione cioè di grandi campioni rappresentativo di isolati singoli neuroni. Ensemble monitoraggio dell&#39;attività neuronale è progredita notevolmente negli ultimi dieci anni negli animali piccoli e grandi-cervello, tra cui soggetti umani 1-11. Più siti di registrazione con i dispositivi basati su silicio sono particolarmente efficaci a causa della loro scalabilità, volume piccolo e disegno geometrico. Qui, descriviamo i metodi per la registrazione di molteplici singoli neuroni e le potenzialità in campo locale comportarsi roditori, utilizzando disponibili in commercio micro-lavorati sonde di silicio con misura componenti accessori. Ci sono due opzioni di base fo l&#39;interfaccia sonde di silicio per preamplificatori: circuiti stampati e cavi flessibili. Le aziende fornitrici della sonda ( <a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a> ; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a> ; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a> ) di solito fornire il servizio di legame e fornire sonde legati ai circuiti stampati o cavi flessibili. Qui viene descritto l&#39;impianto di un 4-gambo, 32-site sonda collegata al cavo flessibile poliimmide, e montato su un microdrive mobile. Ogni passo del preparato sonda, Microdrive costruzione e chirurgia è illustrata in modo che l&#39;utente finale può facilmente replicare il processo.

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Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Descriviamo i metodi per la registrazione su larga scala di più unità singole e potenziale del campo locale in roditori comportarsi con sonde di silicio. Unità di fabbricazione, l&#39;attaccamento sonda l&#39;unità e processi di impianto sonda sono illustrati in modo sufficientemente dettagliato per la replica facile.

Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

large-scale-recording-neurons-movable-silicon-probes-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

34.5K Views.  University of New Jersey. Descriviamo i metodi per la registrazione su larga scala di più unità singole e potenziale del campo locale in roditori comportarsi con sonde di silicio. Unità di fabbricazione, l'attaccamento sonda l'unità e processi di impianto sonda sono illustrati in modo sufficientemente dettagliato per la replica facile.

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Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Registrazione Ensembles neuronali su larga scala con sonde di silicio sotto Rat anestetizzati

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Ricerca

Neuroscienze

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Registrazione e analisi dei ritmi circadiani in Running-ruota Attività nei roditori

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

Registrazione Gamma banda oscillazioni Pedunculopontine Nucleo neuroni

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced electrodes for large-scale electrophysiological recording of neuronal activity, but the procedures for their chronic implantation are still underdeveloped. The activity of hippocampal place cells is known to correlate with an animal&#39;s position in the environment, but the underlying mechanisms are still unclear. To investigate place cells, here we describe a set of techniques which range from the fabrication of devices for chronic silicon probe implants to the monitoring of place field activity in a cue-enriched treadmill apparatus. A micro-drive and a hat are built by fitting and fastening together 3D-printed plastic parts. A silicon probe is mounted on the micro-drive, cleaned, and coated with dye. A first surgery is performed to fix the hat on the skull of a mouse. Small landmarks are fabricated and attached to the belt of a treadmill. The mouse is trained to run head-fixed on the treadmill. A second surgery is performed to implant the silicon probe in the hippocampus, following which broadband electrophysiological signals are recorded. Finally, the silicon probe is recovered and cleaned for reuse. The analysis of place cell activity in the treadmill reveals a diversity of place field mechanisms, outlining the benefit of the approach.

We describe the diverse steps to implant chronic silicon probes and to record place cells in mice that are running head-fixed on a cue-enriched treadmill apparatus.

Impianto di silicio cronica sonde e registrazione delle cellule ippocampali posto in un apparato di tapis roulant arricchito

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Costruzione di un Hyperdrive multi-tetrodo migliorata per la registrazione su larga scala neurale nel comportarsi ratti

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...