Gli autori desiderano ringraziare il Lab Kucenas per preziosi discussioni e Quorum Technologies, Inc. per il superbo supporto tecnico. Il lavoro è stato sostenuto dal Fondo UVa per l&#39;eccellenza nella scienza e la tecnologia (FEST) (SK).

1. Preparazione e montaggio di embrioni di zebrafish per l&#39;ablazione e vivo Imaging <ol><li> Preparare uno stock di 0,8% basso punto di fusione agarosio in acqua uovo. Aliquota in 13X 100 millimetri tubi cultura usa e getta e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Croce zebrafish adulto contenenti transgeni integrati stabilmente per etichettare fluorescenti i neuroni motori e tipi di cellule gliali di interesse. Raccogliere embrioni di zebrafish in acqua uovo e mettere in 28,5 ° C incubatore per la corretta messa in scena più tardi 3. </li><li> A circa 24 ore dopo la fecondazione (HPF), rimuovere l&#39;acqua uovo e aggiungere 0,002% 1-fenil 2-tiourea (PTU) in acqua uovo. Embrioni Rientro in incubatrice. </li><li> Tra 24 e 96 HPF, embrioni devono essere sottoposti a screening per la presenza di transgeni desiderati su un fluorescente ambito dissezione. Mettere gli embrioni selezionati in acqua dolce PTU uovo e tornare alla incubatrice. </li><li> Quando le larve hanno raggiunto i 6 giorni dopo la fecondazione (DPF) (o l&#39;età desiderata), rimuoverli dalla incubatrice, Selezionare un paio di larve per il montaggio, e trasferirli in un piatto più piccolo. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua dal piatto e sostituire immediatamente con circa il 0,02% Tricane in acqua uovo PTU. Permettere alle larve di sedersi in anestesia circa 5 min. </li><li> Trasferire un&#39;aliquota del 0,8% a bassa fusione agarosio in un bicchiere con acqua di rubinetto e forno a microonde per 30 secondi, o fino a quando l&#39;agarosio si è sciolto. Lasciare che il bicchiere si raffreddi fino a quando l&#39;agarosio nel tubo cultura sente tiepido al tatto (non bollente). </li><li> Selezionare una larva anestetizzato e trasferirlo da 35 mm piatto fondo singolo o multi-bene vetro. Rimuovere l&#39;acqua che si è trasferito con la larva, quindi coprire immediatamente la larva con abbastanza caldo agarosio per riempire la porzione di fondo di vetro del piatto, ma non creare una grande cupola. </li><li> Come l&#39;agarosio indurisce, utilizzare un ago da dissezione per posizionare la larva sul lato in basso del piatto, quindi inclinare la larva solo leggermente sul dorso. E &#39;imperativo per lesioni e successive di imaging, chela larva essere montato contatto con la lastra sul fondo del piatto. Utilizzare l&#39;ago di dissezione per mantenere la larva in questa posizione fino a quando l&#39;agarosio si è solidificato e la larva è immobilizzato. </li><li> Una volta che l&#39;agarosio è completamente indurito, pipettare lentamente acqua Tricane abbastanza (questo può essere la stessa Tricane utilizzato per anestesia) nella capsula per coprire completamente l&#39;agarosio e larva. </li></ol> 2. Calibrazione laser e test <ol><li> Accendere tutte le strumentazioni microscopio confocale, adeguati laser a diodi per emozionanti transgeni zebrafish, e l&#39;azoto pompato laser a colorante. Assicurarsi che il fascio di &quot;vuoto&quot; splitter è a posto, il laser attenuatore è completamente aperta, e la cella di colorante 435 nm cumarina è a posto. Sul computer, aprire il software di imaging. </li><li> Spostare un obiettivo ad immersione in acqua 1.2NA 63x in posizione e applicare una piccola goccia di mezzo di immersione per gli obiettivi di acqua sulla oggettiva. Un obiettivo 63x consentirà una buona precisione ablazione laser, e acqua immersion consente una maggiore distanza di lavoro, che è necessaria quando si lavora con 6-7 dpf zebrafish larve. </li><li> Ottenere un vetrino con un lato specchiato utilizzare per la calibrazione del laser. Posizionare la diapositiva, lato specchio verso il basso, sul palco microscopio. </li><li> Usando l&#39;oculare sotto illuminazione campo chiaro, trovare e concentrarsi su un graffio o etch nello specchio. La luce brightfield sarà splendente verso il basso sulla lastra di vetro, ma passa solo attraverso l&#39;obiettivo in luoghi dove lo specchio è stato graffiate o incise via, causando lo specchio per guardare nero attraverso l&#39;oculare, e le incisioni a guardare come macchie o linee di luce. </li><li> Visualizza e fuoco le incisioni sullo schermo del computer utilizzando un software di imaging. Aprire la finestra che controlla la calibrazione laser e impostazioni di alimentazione. Impostare il numero di impulsi da &quot;1&quot; e la piastra di attenuazione di trasmissione &quot;3&quot;%. Il numero di impulsi rappresenta il numero di volte che il laser si azionerà all&#39;interno di ciascuna regione di interesse (ROI) e la trasmissione% rappresenta la potenza del laser. Assicurarsi che l&#39;impostazione di calibrazione corretto sia selezionato per l&#39;obiettivo ad immersione dell&#39;acqua 1.2NA 63x. </li><li> Selezionate lo strumento Ellisse dalla barra degli strumenti principale, e clicca l&#39;immagine sullo schermo del computer per creare un unico ROI circolare. Fate questo altre 3 volte fino a quando ci sono 4 ROI circolare distanziati in modo casuale sopra l&#39;immagine. </li><li> Alcuni sistemi possono includere una funzione di sicurezza che non permetterà il laser al fuoco se il percorso della luce per gli oculari è aperto. Se questo è il caso, chiudere manualmente il percorso ottico verso gli oculari in questo momento. </li><li> Sparare il laser. Questo creerà 4 piccole incisioni spot, uno all&#39;interno di ogni ROI circolare. Se il laser non si accende, controllare per essere sicuri che il laser sia acceso e collegato correttamente, e che il percorso della luce per gli oculari è chiuso. Se si aziona il laser, ma senza incisione è visto, controllare per essere sicuri che il &quot;vuoto&quot; beam splitter è a posto. Se tutto è a posto, aumentare la potenza del laser e &quot;FRAP&quot; fino a quando il acqueforti are visibile. Se un&#39;impostazione maggiore di 10 potenza del laser è necessaria per incidere il vetro, questo può indicare la cartuccia plasma laser deve essere sostituita. </li><li> Se le macchie incise appaiono centrati all&#39;interno della ROI selezionata, non è necessaria alcuna calibrazione (procedere a 2.12). Se le macchie non sono centrate, l&#39;impostazione di calibrazione deve essere aggiornato. </li><li> Per calibrare, fare clic sull&#39;aggiornamento l&#39;impostazione di calibrazione. Il laser scatta e l&#39;immagine apparirà contenente un singolo punto acidato. Se il punto non appare, annullare la calibrazione, aumentare la potenza del laser, e riavviare la calibrazione. </li><li> Fare clic al centro della macchia. Il laser sparare di nuovo, e apparirà un altro punto. Fare clic su quel punto, e ripetere questo processo fino a quando la calibrazione è completa e 9 punti di apparire in modo griglia. Ripetere i passaggi 2,6-2,9 per verificare che la calibrazione è stata eseguita correttamente. </li><li> Rimuovere il vetrino dal palco microscopio e pulire l&#39;obiettivo. Aprire il percorso ottico verso il OCULars, e sostituire il &quot;vuoto&quot; divisore di fascio con il &quot;100% ILL&quot; divisore di fascio. </li></ol> 3. Resezione del nervo Utilizzando ablazione laser e time-lapse imaging confocale di comportamenti delle cellule gliali <ol><li> Rimuovere il palco utilizzato per contenere il vetrino e sostituire con un palcoscenico adatto per lo svolgimento di 35 millimetri di vetro piatti di fondo. Continuare a utilizzare l&#39;obiettivo ad immersione dell&#39;acqua 1.2NA 63x. </li><li> Applicare una piccola goccia d&#39;acqua mezzo di immersione con l&#39;obiettivo, e posizionare il piatto con larva montato sul palco. Stabilizzare il piatto con clip. </li><li> Usando l&#39;oculare e l&#39;illuminazione widefield, si concentrano la larva e localizzare i nervi motori. Scansione i nervi hemisegments 10-20 e selezionare un nervo motore per la resezione. </li><li> Portare un live-view del nervo sullo schermo del computer utilizzando un software di imaging. Selezionare Z-aerei e di acquisire una immagine degli assoni e cellule gliali del nervo illeso. </li><li> Preparare le impostazioni di time-lapse imaging nel software di imaging di catturareZ-proiezioni di tutti i tipi cellulari in intervalli di 5-30 min, a seconda dell&#39;esperimento. E &#39;meglio per creare tutte le impostazioni necessarie per il time-lapse prima di eseguire l&#39;ablazione, per cui non vi è alcun ritardo nella partenza del time-lapse una volta che il danno è completo. </li><li> Togliere il &quot;100% ILL&quot; divisore di fascio e sostituire con il &quot;vuoto&quot;. Chiudere il percorso della luce per gli oculari. </li><li> Tornare al live-view del nervo. Utilizzare il canale fluorescente appropriato per visualizzare gli assoni che sarà attraversata. </li><li> Utilizzando lo strumento ellisse, creare una ROI ellittica sottile nella zona da asportare, quindi creare ROIs piccola all&#39;interno della regione selezionata. </li><li> Nella finestra che controlla le impostazioni laser, impostare il numero di impulsi da &quot;2&quot; e la piastra di attenuazione di trasmissione &quot;18&quot;%. Sparare il laser all&#39;interno della ROI selezionata. Se resti fluorescenza all&#39;interno del ROI, aumentare la potenza del laser, attendere circa 10 secondi, e sparare di nuovo il laser. Fate questo fino a raggiungere una posizione che provoca FLUORESCENTEce a scomparire all&#39;interno della ROI. </li><li> Attendere 10 secondi o più e controllare l&#39;area ablated ancora per fluorescenza. Attenzione che un ROI può apparire inizialmente ablated, quando in realtà è fotodecolorate. Se ritorna fluorescenza, aumentare la potenza del laser e sparare di nuovo il laser. Ripetere questa operazione fino fluorescenza scompare all&#39;interno del ROI e non restituisce entro 10 sec. E &#39;meglio cominciare con un laser di potenza minore e aumentare la potenza necessaria. La potenza del laser necessaria può variare a seconda dei sistemi individuali di microscopia, l&#39;età di colorante cumarina, montaggio del campione, l&#39;età delle larve, e lo spessore del tessuto. Una volta che è stata stabilita una potenza laser ideale, questa impostazione di alimentazione può essere riutilizzato nelle successive nervi lo stesso esperimento. </li><li> Una volta che l&#39;ablazione è completato, inizierà time-lapse imaging. </li><li> Quando il time-lapse è completo, utilizzare il software di imaging per compilare i dati e creare il colore composito Z-proiezioni per ogni punto di tempo. Creare un filmato QuickTime per analizzare il comportamentodi assoni e cellule gliali simultaneamente. </li></ol>

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi più critiche di questo disegno sperimentale sono: 1) correttamente larve montaggio per lesioni e successive imaging in vivo e 2) calibrare il laser e selezionando le impostazioni di alimentazione corrette per poter creare una transezione del nervo pulita che provoca danni extra-tessuto minimal . Per contribuire a garantire un assotomia successo per l&#39;imaging in vivo e successiva analisi, montare larve multiplo in entrambi i singoli piatti con fondo di vetro o in un piatto fondo di vetro co...

Zebrafish sono stati ampiamente utilizzati per studiare sviluppo del sistema nervoso a causa della loro trasparenza ottica e facilità di transgenesi, che, se accoppiato, permettere spettacolare imaging comportamenti delle cellule dinamiche in un embrione vivente. Inoltre, poiché zebrafish e mammiferi condividono quasi tutti i geni necessari per la formazione del sistema nervoso, informazione cellulare e molecolare raccolte in questo organismo modello è direttamente riferibile ad altre specie di vertebrati. Anche se incredibilmente potente per gli studi sullo sviluppo neurale, il pesce zebra ed i suoi attributi unici hanno il potenziale per chiarire anche i meccanismi che mantengono e ricostruire il sistema nervoso dopo l&#39;infortunio. Zebrafish larve di mantenere la loro traslucenza in stadio avanzato larvali e la pigmentazione può essere efficacemente bloccato sia con l&#39;uso di inibitori farmacologici della produzione di melanina o mutanti genetici che mancano di cellule del pigmento. Così, con questo organismo modello per studiare lesioni e Rigeneranteione negli animali più vecchi è possibile e offre l&#39;opportunità unica di studiare direttamente i meccanismi cellulari e molecolari che ricostruire il sistema nervoso. In questo manoscritto, si descrive come ferire in modo efficiente e riproducibile nervi delle PNS di larve di zebrafish. Questo paradigma lesioni si presta a studiare non solo degenerazione, ma anche le risposte di cellule gliali periferico e cellule immunitarie nonché le interazioni tra queste popolazioni durante la rigenerazione. SNP è una rete complessa di nervi motori e sensori che è necessario per passare informazioni tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la cute, organi e muscoli del corpo, permettendo un organismo di interagire con l&#39;ambiente e sopravvivere. Lungo questi nervi, glia periferica, comprese le cellule mielinizzanti e non mielinizzanti Schwann e glia perineurale, così come tessuto connettivo, racchiudono gli assoni e infine formare il nervo maturo. Infortunio di questi nervi avvia un processo di Known come walleriana degenerazione 10. Questo meccanismo di frammentazione assonale, reclutamento immunitario, la clearance detriti e la rigenerazione è molto stereotipata e geneticamente regolato 1. Studi precedenti in sistemi di mammifero hanno descritto i ruoli delle cellule di Schwann durante degenerazione del nervo e rigenerazione 1, 2, 6, 8. In questi studi di tessuto fisso o coltura cellulare, cellule di Schwann reclutati non solo macrofagi al sito di lesione per aiutare nella liquidazione detriti, ma anche aiutati in mielina stessi fagocitosi. Anche se questi studi sono stati incredibilmente informativo, non abbiamo mai visualizzate risposte gliali a danno degli assoni periferici in vivo, in tempo reale, e non altri studi hanno indagato il rapporto tra le diverse classi di cellule gliali periferico durante questi eventi. Recentemente, molti laboratori hanno indagato degenerazione Walleriana utilizzando zebrafish e lesioni assone laser-mediata simile a quello che abbiamo descritto qui <sup&gt; 4, 5, 7, 9. In alcuni di questi studi, gli assoni sensoriali superficiali sono stati axotomized in giovani larve con un costruito su misura, a due fotoni microscopio confocale 4, 5, 9. In un altro studio, che è molto simile al nostro, assoni più profondi all&#39;interno del nervo motore ventrale sono stati tagliati di 5 giorni vecchio larve utilizzando un sistema di ablazione laser disponibili in commercio 7. In entrambi questi nelle configurazioni, l&#39;attenzione si è concentrata sulla degenerazione Walleriana ed entrambi gli assoni e cellule immunitarie sono stati ripresi. Per approfondire questi studi, si descrive ferendo assoni motori in larve anziani con più maturi, nervi mieliniche e analisi della risposta di tutti glia nervo periferico associata durante la degenerazione e rigenerazione. Per fare questo, abbiamo transetto nervi motori a 6 e 7 giorni dopo la fecondazione (DPF) larve e visualizzare le risposte delle singole popolazioni gliali e indagare le interazioni tra queste popolazioni lungo gli assoni danneggiati. Utilizzando doppie e triple TRALinee nsgenic che etichetta glia periferico, comprese le cellule di Schwann e glia perineurale, così come un marcatore per assoni, si usa un sistema di ablazione laser disponibile in commercio costituito da un azoto-pompato dye laser (lunghezza d&#39;onda 435 nm) collegata ad un sistema confocale disco rotante per creare assoni transections. Questo set-up sperimentale ci permette di visualizzare in diretta, zebrafish larvale, ferire specifici tratti di assoni motori periferici e di immagine al rallentatore le risposte delle popolazioni gliali distinte al danno assonale e la loro relazione l&#39;uno all&#39;altro. Questo protocollo può essere ulteriormente adattato per creare lesioni nervose in zebrafish di età diverse, con diverse linee transgeniche o mutanti genetici per affrontare diverse questioni scientifiche.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

Il sistema nervoso è spesso descritto come componente hard-wired del corpo, anche se si tratta di un sistema di organi considerevolmente fluido che reagisce a stimoli esterni in maniera stereotipata coerente, pur mantenendo un&#39;incredibile flessibilità e plasticità. A differenza del sistema nervoso centrale (SNC), il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativa, ma abbiamo appena iniziato a comprendere i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando zebrafish come sistema modello, abbiamo l&#39;opportunità senza precedenti di studi rigenerativi coppia con l&#39;imaging in vivo e di manipolazione genetica. Nervi periferici sono composti di assoni circondati da strati di cellule gliali e tessuto connettivo. Gli assoni sono ensheathed da mielinizzanti o non mielinizzanti cellule di Schwann, che sono a loro volta avvolto in un fascicolo da una guaina cellulare chiamato il perinevrio. A seguito di un infortunio, nervi periferici adulti hanno la straordinaria capacità di remove danneggiato detriti assonale e obiettivi re-innervano. Per studiare i ruoli di tutti glia periferica in PNS rigenerazione, descriviamo qui un saggio transection assone che utilizza un laser a colorante disponibile in commercio azoto pompato a axotomize nervi motori in vivo zebrafish transgenico. Approfondiremo i metodi di accoppiare questi esperimenti di time-lapse imaging di nervi feriti e di controllo. Questo paradigma sperimentale può essere utilizzato non solo per valutare il ruolo che giocano glia in rigenerazione nervosa, ma può anche essere la piattaforma per chiarire i meccanismi molecolari che governano riparazione del sistema nervoso.

Il saggio descritto qui può essere utilizzato per valutare la risposta delle cellule gliali e altre popolazioni di cellule nervose associate al danno assonale in vivo. Filmato 1 mostra un esempio di una lesione del nervo creato con questo metodo e la risposta delle cellule gliali circostanti. Questo esperimento è stato eseguito in Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) zebrafish, in cui glia perineurale esprimono una membrana mirata EGFP e motore neuroni esprimono citosolico DsRed. I...

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l&#39;infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Views.  University of Virginia. Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

Video: Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico nel sistema nervoso centrale dei mammiferi

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Ricerca

Neuroscienze

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Time-lapse Live Imaging e quantificazione delle dinamiche del ramo dendritico veloce nello sviluppo di neuroni della Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...