Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio presso l&#39;Università della British Columbia (a BV) e borse di Cystic Fibrosis Canada e Canadian Institutes of Health Research (a DPS). Ringraziamo Jacqueline Chung per la preparazione iniziale dei protocolli.

1. Crescita Cultura (Giorni 1 +2) <ol><li> Coltivare una coltura starter: 3 ml di Luria Bertani (LB) brodo in una provetta alto a scatto 15 ml, a 37 ° C durante la notte rotatori. Diluire la crescita durante la notte per un OD 600 di 0,6. Aggiungere 1 ml di questa diluizione a 100 ml di brodo LB in una beuta da 250 ml. Incubare a 37 ° C con agitazione a 250 rpm per 16 ore in fase stazionaria (SP), per meglio approssimativa, in coltura batch, in condizioni di infezione e di assicurare che i fattori di virulenza batterici sotto il controllo del segnale di fase stazionaria fattori quali RPOs e quorum sensing, sono espressi. In alternativa, i batteri coltivati ​​in SP presto o fase-mid o late-logaritmica possono essere utilizzate per ottenere informazioni sulla fase di adattamento dei batteri. </li><li> Dopo 16 hr misurare il diametro esterno 600 e garantire la coltura ha raggiunto SP rispetto ad una curva di crescita precedentemente costruito in condizioni identiche. </li></ol> 2. Estrazione Protein (3 ° giorno) <ol><li&gt; Raffreddare tutti i media e le soluzioni in anticipo in frigorifero durante la notte. Tutte le procedure devono essere eseguite con tubi in un secchiello del ghiaccio. Pre-raffreddamento microcentrifuga e una Beckman Coulter High Performance centrifuga (o equivalente) a 4 ° C e il rotore interno (= rotore JA-20, centrifuga = J2-HS). </li><li> Preparare fresco 0.1 M phenylmethanesulfonyl fluoruro di soluzione (PMSF, 174,19 g / mol) in acetone sciogliendo 0,0174 g di PMSF (PMSF &#39;ATTENZIONE&#39; è tossico e corrosivo, utilizzare visiere e guanti) in 1 ml di acetone (acetone &#39;ATTENZIONE&#39; è tossici e infiammabili, usare visiere e guanti). </li><li> Costituire una soluzione PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml di 0,1 M PMSF, 0,1 ml di 0,5 M EDTA, e 9,8 ml di PBS. Controllare il diametro esterno della cultura 16 ore è di circa dove dovrebbe essere in SP. </li><li> Prendere 35 ml di coltura batterica e trasferimento di un tubo da centrifuga e centrifugare Oakridge cultura a 4.500 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante in un contenitore di rifiuti eaggiungere 35 ml di raffreddamento PBS e risospendere il pellet. Centrifugare nuovamente a 4.500 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 ml di PBS freddo. Trasferimento a sterile 2 ml Eppendorf e centrifugare 1 min in alto nella microcentrifuga a 14.000 xg a 4 ° C. Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione PBS / EDTA / PMSF, risospendere il pellet e trasferirli in una provetta 2 ml vite tappo (con o-ring) contenente ~ microsfere di vetro da 0,5 ml (presterilized). Aggiungere il pellet risospeso alla provetta contenente perle di vetro e perline li bash a 4 ° C per 1 min in camera fredda. Fate questo 3x, mettendo il campione in ghiaccio dopo ogni bash. </li><li> Centrifugare a 14000 g per 1 min in microcentrifuga. Rimuovere il surnatante e metterlo in una sterile provetta di polistirene da 5 ml. </li><li> Per aumentare il rendimento aggiungere 1 ml di PBS / EDTA soluzione / PMSF a tubo stesso contenga ancora perle di vetro. Bead bash il tubo a 4 ° C per 1 min. Fate questo 2x mettere il campione sul ghiaccio after bash. Centrifugare a 14000 g per un minuto in centrifuga e rimuovere il supernatante e voglio surnatante dal punto 2.8. Utilizzare una siringa da 1 ml e un filtro 0.20 micron surnatante dal tubo polistirolo in un tubo sterile 2 ml Eppendorf. </li><li> A questo punto i campioni devono essere analizzati per la quantità di proteine, utilizzando il kit di estrazione delle proteine ​​Pierce MicroBCA e aliquote di 200 mg devono essere congelati a -80 ° C fino al momento. </li></ol> 3. Preparazione del campione (Giorno 4) <ol><li> Preparare 25 ml di soluzione madre di reidratazione (8 M urea, 2% CHAPS, 2% IPG Buffer, 0.002% blu di bromofenolo) e conservare in 2,5 ml di aliquote a -20 ° C. Aggiungere 7 mg ditiotreitolo (DTT, 154,2 g / mol) appena prima di usare un 2,5 ml aliquota di reidratazione soluzione stock. </li><li> Processo scongelato campioni dal punto 2.10 con un 2-D Clean up kit con la risospensione finale in 450 ml di reidratazione soluzione madre preparata al punto 3.1. </li></ol> 4. PrimoDimensione Isoelectric Focusing (IEF) (Giorno 4) Tutti i passaggi in questa sezione utilizzano il sistema IEF Ettan IGPhor. <ol><li> Impostare le prime strisce IPG dimensione: premibandella pulite con soluzione detergente striscia e poi lavare con acqua Milli-Q, lasciare a testa in giù ad asciugare. Assegnare ad ogni campione un numero di supporto della striscia di gel. </li><li> Caricare il campione dalla fase di reidratazione nella seconda zona più ampia dal polo (-). Utilizzare pinze pulite per tirare strisce di gel di imballaggi. Estrarre strato protettivo da strisce di gel. Linea strisce lato ruvido verso il basso in un lento, movimento di scorrimento per ottenere le strisce umide lungo il percorso da (-) fine (+) fine. </li><li> Mettere carta assorbente inumidito con acqua sterilizzata in cima elettrodo e sotto le strisce di gel per evitare burnout. Sciacquare pinzette in-tra un round con acqua purificata ed etanolo. Rimuovere tutte le bolle, sovrapporre uno strato sottile di olio minerale per evitare interventi a secco. Allineare le premibandella gel sulla macchina. </li><li> Esegui 12 ore a 20 ° C per rehydrazione, 1 ora a 200 V, 1 ora a 500 V, 1 ora a 1000 V, 0,5 ore a 4000 V, 12 hr a 8000 V, 24 hr stretta a 300 V e può essere estratta in questo momento. </li><li> Dopo IEF è finito, si consiglia di eseguire la seconda dimensione elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide, a meno che la striscia IPG sono stati congelati a -80 ° C in Saran Wrap ricoperto di olio minerale per le analisi future. In alternativa, per evitare punto striature dovuto accesso DTT è possibile includere una seconda fase equilibramento della IPG strisce prima della seconda dimensione di un buffer che contiene iodoacetamide. </li></ol> 5. Seconda dimensione SDS-poliacrilammide gel elettroforesi (Giorno 5) Tutti i passaggi in questa sezione si utilizza l&#39;apparecchiatura di elettroforesi Ettan DALTsix. <ol><li> Per montare l&#39;apparecchio gel caster, pulire accuratamente tutti i componenti e di garantire che il gel caster sia a livello e l&#39;associazione gomma grigia è lubrificato con gel di silicone. Mettere il rub nerober tappo triangolare sul fondo. Poi, alternativamente posizionare il separatore e le lastre di vetro con la piastra inferiore di vetro sul davanti. Assicurarsi che i separatori sono sul retro e la parte anteriore. Riempire lo spazio rimanente con le cariche (circa 5 fogli) in modo che la parte superiore è piatta. Inserire il frontalino avanti con la punta rossa all&#39;esterno. Utilizzare i morsetti per stringere ogni lato e stringere le viti inferiori. </li><li> Preparazione del gel: Aggiungere 297,3 ml di Duracryl, (&#39;ATTENZIONE&#39; Duracryl è uso tossico visiere e guanti), 147 ml di Tampone Tris 1,5 M pH 8,8 e 143,3 ml di acqua Milli-Q in un pallone con la punta del vuoto contenente un ancoretta. Mettere il coperchio sulla parte superiore e soluzione di miscela a velocità moderata con il vuoto per 20 min. Il vuoto viene utilizzato per de-gas la soluzione. Effettuare una fresca 10% di soluzione di ammonio persolfato (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g di APS a 2 ml di acqua Milli-Q. </li><li> Aggiunta la miscela gel al caster gel: Quando il vuoto è fatto aggiungere 6 ml di 10% sodio dodecil solfato (SDS, 228,38 g / mol)al lato del pallone per evitare di mettere più bolle nella soluzione. Aggiungi APS, mescolare, aggiungere 0,25 ml di N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiammina (TEMED, 116.20 g / mol) (&#39; ATTENZIONE &#39;TEMED è uso infiammabile visiere e guanti) e mescolare. </li><li> Versare il composto in gel gel caster attraverso un imbuto inserito sul retro dell&#39;apparecchio. Versare fino a un centimetro sotto la corta piatto. Aggiungere 1,5 ml di butanolo saturo d&#39;acqua all&#39;inizio del gel e dell&#39;involucro superiore con pellicola trasparente per evitare la disidratazione. Attendere 1 ora per garantire la piena polimerizzazione. </li><li> Controllo del gel: Quando il gel è fatto (controllare il pallone), smontare il caster gel da un lavandino. Verificare l&#39;integrità del gel, mentre il risciacquo delle lastre di vetro con acqua calda, non permettono all&#39;acqua di entrare nel piatto. Versare il butanolo e risciacquare la parte superiore del gel due volte con acqua per sbarazzarsi di butanolo. Riempire nuovamente la parte superiore con acqua e lasciate riposare se il gel non vengono utilizzati subito. </li><li> Preparare le strisce: Preparare la soluzione tampone di equilibratura dalfreezer (6 M Urea, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% SDS, 0.002% blu di bromofenolo). Questo può essere preprepared e memorizzati in 10 ml aliquote a -20 ° C. Sciogliere 0,1 g di DTT per un 10 ml di soluzione tampone di equilibratura. Un tubo può essere usato per due strisce IPG. Posizionare i gel del viso striscia giù sul buffer e lasciate riposare per 30 min. Ricordate che finale è che. </li><li> Preparare l&#39;unità di elettroforesi (apparecchi di separazione 2-D): Aggiungere 4,5 l di 1x tampone di elettroforesi (25 mM Tris Base [121,1 g / mol], 192 mM glicina [288,38 g / mol], e 0,1% w / v SDS [288,38 g / mol]) per il serbatoio di servizio. Questo tampone può essere usato fino a 3x. Accendere l&#39;unità elettroforesi su. Controllare il livello dell&#39;acqua nella macchina di raffreddamento ad acqua e riempire con acqua se è bassa. Accendere il dispositivo, premere mode per controllare la temperatura designato, che dovrebbe essere di 10 ° C. </li><li> Fare 1 L di tampone di corsa 2x e 1 L di 1x tampone di corsa e conservarli a 4 ° C. Make-agarosio tenuta Soluzione: Peso 0.25 g di agarosE e sciogliere in 50 ml di 1x tampone di corsa. Pulse per 15 secondi ciascuna. </li><li> Impostazione dell&#39;unità di elettroforesi: Utilizzare le pinzette per stipulare ogni striscia e rimuovere il tampone in eccesso su entrambi i lati con il tovagliolo di carta pulito. NON toccare le strisce. Versare l&#39;acqua sulla superficie del gel e la linea all&#39;inizio gel con 1x tampone di corsa. Utilizzare pinzette pulite e posizionare le strisce sulla parte superiore della piastra lunga, con il lato rivolto verso di gel. Aggiungere 1x tampone ai pozzetti di una buona lubrificazione. Strisce di scorrimento più in basso utilizzando strisce di plastica. Rimuovere tutte le bolle tra la striscia e il gel. </li><li> Aggiungere la soluzione-agarosio tenuta all&#39;inizio della striscia per sigillarla. Ripetere per il resto delle strisce. Posizionare le lastre di vetro contenenti gel in gel culla e inferiore nel serbatoio gel. Assicurarsi che il livello 1x tampone nella camera esterna è sulla riga inferiore designato prima di mettere la camera superiore su. </li><li> Posizionare il telaio per camera di transito superiore sopra le lastre di vetro e assicurarsi che sia tutto il way verso il basso premendo la parte inferiore verso il basso. Utilizzare un imbuto e aggiungere il tampone di corsa 2x nella camera superiore fino alla linea centrale. Utilizzare un imbuto e aggiungere tampone di corsa 1x alla camera esterna fino a raggiungere la linea superiore. Mettere il coperchio sulla parte superiore e accendere l&#39;unità elettroforesi e l&#39;alimentatore. </li><li> Eseguire una notte a 52 V, 96 mA, 5 W. Verificare se la corrente sta cercando di bolle sul filo d&#39;argento vicino alla cima. Eseguire il gel fino a quando la linea principale è a 1 cm dal fondo. </li><li> Le proteine ​​possono anche essere analizzati utilizzando attrezzature e reagenti provenienti da altre aziende quali Biorad o Hoefer, secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 6. Argento colorazione dei gel Gel Visualization (Day 5-6) <ol><li> Preparare una soluzione di correzione 1 (800 ml di etanolo, 200 ml di acido acetico, e 1000 ml di acqua Milli-Q in cappa in un secchio di plastica). Soluzione è buona per 6 gel. Girare tutte le macchine fuori e prendere l&#39;intera sezione centrale dell&#39;unità di elettroforesi e pull nel lavandino. Anche mettere lo stand bianco nel lavandino. Estrarre il vassoio superiore contenente il tampone 2x esecuzione. </li><li> Smontare l&#39;apparecchio e rimuovere il gel dalle lastre di vetro nella soluzione di correzione 1. I gel possono essere identificati tagliando angoli quando vengono rimossi dalle lastre di vetro, il numero di angoli tagliati corrispondente all&#39;ordine gel nel caster. </li><li> Posizionare il contenitore con la soluzione correzione e il gel su un agitatore per almeno 1 ora a notte a 4 ° C. </li><li> Trasferire i gel per fissare Soluzione 2 (20 ml di 50% glutaraldeide, 600 ml di etanolo, 5 g di Tetrathionate potassio (302,46 g / mol), 136 g di acetato di sodio (82,03 g / mol), e acqua Milli-Q per 2.000 ml) e posto su una sedia a dondolo per 1 ora. </li><li> Lavare i gel 4x per 15 minuti ciascuno in acqua Milli-Q. </li><li> Macchiare i gel in soluzione di nitrato d&#39;argento (4 g di nitrato d&#39;argento (169.87 g / mol), 500 ml di formaldeide, e acqua Milli-Q a 2.000 ml) per 30 minuti o fino a 48 ore. </li><li> Lavare gel per 1min in acqua Milli-Q. </li><li> Trasferimento di soluzione di sviluppo (60 g di carbonato di sodio (105.99 g / mol), 300 ml di formaldeide, 15 mg di sodio tiosolfato (158.11 g / mol), e acqua Milli-Q a 2.000 ml) per 5-30 min fino alla gel è macchiato. </li><li> Mettere i gel in soluzione bloccante (100 g di Tris-Base (121.14 g / mol), 40 ml di acido acetico e acqua Milli-Q a 2.000 ml) per 10 min. </li><li> Per lo stoccaggio, trasferire i gel di glicerina Solution (40 ml di glicerolo o 400 ml se la conservazione a lungo termine è desiderata, e 1.600 ml di acqua Milli-Q) per 10 min e poi asciugarli con essiccatore gel. </li><li> I gel possono essere visualizzati dopo colorazione utilizzando sistemi di imaging come uno scanner / densitometro, fotografato utilizzando transilluminatore luce o gel imager. Software di analisi delle immagini, come PDQuest 2-D di analisi da BIORAD può quindi essere utilizzato per ottenere informazioni quantitative e qualitative da proteine ​​in un campione. </li></ol> 7. Gel d&#39;argento colorazione per l&#39;analisi Spettrometria di Massa </p&gt; <ol><li> Fissare i gel in 50% metanolo e acido acetico 5% per 1 ora. </li><li> Lavare in metanolo al 50% per almeno 10 minuti per tutta la notte. </li><li> Lavare 3x in acqua distillata per 10 min. </li><li> Sensibilizzare con tiosolfato di sodio 0,02% (158.11 g / mol) 2x per 15 min. </li><li> Lavare 3x in REFRIGERATE 3x acqua distillata per 10 min. </li><li> Immergere gel in soluzione di nitrato d&#39;argento refrigerati 1% (169.87 g / mol) per almeno 20 minuti a 1 ora a 4 ° C </li><li> Lavare 2x per 1 minuto con acqua distillata. Cambia vassoio / secchio. </li><li> Sviluppare in 0,04% di formaldeide nel 2% di carbonato di sodio anidro (105.99 g / mol) e scartare quando diventa giallo abbastanza veloce; avere tre lotti ed essere pronti a cambiare ogni 5 min. </li><li> Lavare in 5% di acido acetico quindi memorizzare in 1% acido acetico. </li><li> Sciacquare 1,5 ml provette Eppendorf (per tenere get spot cut-outs) con etanolo grado USP e asciugare prima dell&#39;uso. </li><li> Pinze pulite, lame di rasoio e superfici con il 100% di metanolo. </li><li> Spruzzare guanti e superfici con etanolo. </li><li> Macchie accise in una cappa a flusso o un&#39;area aria pulita. Spot possono essere asportati anche utilizzando una fresa posto automatizzato. </li><li> Metterli in provette Eppendorf e nave su ghiaccio o mantenere in frigorifero. </li></ol>

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	<li>Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+cenocepacia+in+cystic+fibrosis:+epidemiology+and+molecular+mechanisms+of+virulence.">Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).</li><li>Suarez-Moreno, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Environmental+and+Potentially+Beneficial+Plant-Associated+Burkholderia.">Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia.</a> Microb. Ecol. , (2011).</li><li>Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melioidosis:+insights+into+the+pathogenicity+of+Burkholderia+pseudomallei.">Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).</li><li>White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melioidosis.">Melioidosis.</a> Lancet. 361, 1715-1722 (2003).</li><li>Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifarious,+multireplicon+Burkholderia+cepacia+complex.">The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).</li><li>Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Burkholderia+cepacia+complex+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis.</a> Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).</li><li>Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+susceptibility+of+Pseudomonas+pseudomallei.+Emergence+of+resistance+in+vitro+and+during+treatment.">The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment.</a> J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).</li><li>Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibility+of+65+isolates+of+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+mallei+to+35+antimicrobial+agents.">Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).</li><li>Govan, J. R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transmission+of+Pseudomonas+cepacia+by+social+contact+in+cystic+fibrosis.">Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis.</a> Lancet. 342, 15-19 (1993).</li><li>Thongboonkerd, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proteome+in+Burkholderia+pseudomallei+rpoE+operon+knockout+mutant:+insights+into+mechanisms+of+rpoE+operon+in+stress+tolerance,+survival,+and+virulence.">Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence.</a> J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).</li><li>Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analysis+of+B.+cenocepacia+using+two-dimensional+liquid+separations+coupled+with+mass+spectrometry.">Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry.</a> Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).</li><li>Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+profiles+and+the+potential+markers+between+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.+Mol.">Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol.</a> Cell Probes. 21, 81-91 (2007).</li><li>Harding, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+surface+proteins+of+Burkholderia+pseudomallei.">The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei.</a> Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).</li><li>Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+(2-D+DIGE)+reveals+molecular+strategies+employed+by+Burkholderia+cenocepacia+to+adapt+to+the+airways+of+cystic+fibrosis+patients+under+antimicrobial+therapy.">Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy.</a> Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).</li><li>Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Mucoidy+in+Virulence+of+Bacteria+from+the+Burkholderia+cepacia+Complex:+A+Systematic+Proteomic+and+Transcriptomic+Analysis.">The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis.</a> J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).</li><li>Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+proteome+of+Burkholderia+cenocepacia+H111:+setting+up+a+2-DE+reference+map.">Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map.</a> Proteomics. 6, 207-216 (2006).</li><li>Weiss, W., Gorg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+solublization+buffers+for+two-dimensional+electrophoresis.">Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).</li><li>von der Haar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+for+quantitative+proteomics+of+yeasts.">Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts.</a> PLoS One. 2, e1078 (2007).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+low-abundance+proteins+using+multidimensional+chromatography+and+isotope-coded+affinity+tags.">Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags.</a> J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Velapati&#241;o, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+proteins+from+Burkholderia+pseudomallei+isolated+during+primary+and+relapsing+melioidosis.">Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis.</a> Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).</li><li>Chung, J. W., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host.">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li><li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents.">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li><li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches.">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques.">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li><li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling.">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Procedimento per la preparazione di proteine ​​è stato descritto che può estrarre la maggior parte delle proteine ​​Burkholderia con buona riproducibilità. Ciò è dimostrato ottenendo lo stesso profilo proteico da due preparazioni indipendenti eseguiti in giorni diversi utilizzando la stessa coltura batterica cresciuta in LB o YEM brodo come mostrato nella Figura 1. Estrazione era efficiente per i batteri coltivati ​​in terreni liquidi, ma non abbiamo testato questo metodo per i...

Il Burkholderia genere comprende più di 62 specie, microrganismi Gram-negativi isolati da una vasta gamma di nicchie, ed è diviso in due gruppi principali 1,2. Il primo cluster comprende umana, animale e gli organismi phytotrophic, e la maggior parte degli studi si sono concentrati sulle specie patogene di questo gruppo a causa della loro importanza clinica. I membri più patogeni sono B. pseudomallei e B. mallei (che provoca rispettivamente melioidosi e morva) 3,4 e patogeni opportunisti (le 17 specie definite del complesso Burkholderia cepacia, BCC) 5, che causano la malattia della fibrosi cistica (CF) e malattia granulomatosa cronica (CGD) 1. Il secondo gruppo, con più di 30 specie patogene, comprende batteri associati con le piante o con l&#39;ambiente, e sono considerati potenzialmente benefico per l&#39;host 2. Numerose complicazioni emergono frinfezione batterica om con i membri patogeni del genere Burkholderia, come la trasmissione del patogeno tra pazienti, diffusione della malattia e fallimento del trattamento a causa della resistenza intrinseca o acquisita agli antibiotici rendendo difficile sradicare nella maggior parte dei casi 6-9. Pertanto, ottenendo una migliore comprensione della base per l&#39;istituzione di infezione batterica è fondamentale per il trattamento di malattie causate da questi organismi. Al fine di ottenere una visione nello stabilimento di infezione, sono necessarie approfondite indagini sui componenti batterici associati alla patogenesi. Studi incentrati sull&#39;analisi proteomica di organismi Burkholderia utilizzando approcci di proteomica descritti proteine ​​che sono stati implicati nella patogenesi batterica così come i cambiamenti nel loro proteoma PROFILI 10-16. Metodi di estrazione di proteine ​​mediante sonicazione e cicli di gelo-scongelati in tampone di lisi contenente alta concentration di urea, tiourea in combinazione con detergente e anfoliti è stato applicato in Burkholderia studi di proteomica 10-13. Anche se l&#39;urea è molto efficace per denaturazione proteica, può stabilire un equilibrio in soluzione acquosa con isocianato di ammonio, che può reagire con gruppi ammino acidi, formando così artefatti (reazione carbamilazione) 17. Pertanto, si raccomanda di includere anfoliti portanti, che agiscono come spazzini cianato ed evitare temperature superiori a 37 ° C 17. Inoltre, per evitare qualsiasi interferenza chimica di tampone di lisi con proteine ​​quantificazione, lo stesso tampone di lisi può essere utilizzato per generare la curva standard in modo che i campioni e gli standard hanno lo stesso sfondo 10. Altre metodologie prevedono l&#39;utilizzo di tamponi alcalini e detergenti con calore periodi di incubazione 17,18, ma tali condizioni potrebbero inducono cambiamenti nel proteoma e alcuni detersivi non sono compatibili con proteomics domanda, salvo successive fasi di rimozione del detersivo sono inclusi 17,18. Dopo estrazione e quantificazione adeguata, espressione proteica globale di ogni singola proteina può essere studiata utilizzando approcci di proteomica come bidimensionale (2-D) elettroforesi su gel. Questa tecnica è stata descritta da O&#39;Farell 19 e consiste nella separazione delle proteine ​​in base al loro punto isoelettrico mediante focalizzazione isoelettrica nella prima dimensione, e poi in base al loro peso molecolare mediante elettroforesi su gel di acrilammide nella seconda dimensione. Grazie alla sua risoluzione e sensibilità, questa tecnica è un potente strumento per l&#39;analisi e la rilevazione di proteine ​​da fonti biologiche complesse 19,20. Questa tecnica di separazione è attualmente disponibile negli approcci proteina-centric, con il grande vantaggio di risolvere isoforme della proteina causate da modificazioni post-trascrizionali o proteolitici processing. Variazioni quantitativepuò essere rilevato confrontando l&#39;intensità del corrispondente punto dopo colorazione del gel 20. Tuttavia, questa tecnica non è adatta per l&#39;identificazione di molto grandi proteine, proteine ​​di membrana, proteine ​​estremamente semplice e acidi o idrofobi, ed è un po &#39;laborioso e richiede tempo tecnica 20. Nuovi approcci peptide-centric (basato su gel non) che sono più robusti e oggettivo diventano disponibili e possono essere utilizzati per il confronto quantitativo da differenziali metodi di etichettatura isotopo stabile come l&#39;etichettatura cisteina per affinità isotopo codificato tagging (ICAT) 21, e il gruppo amminico etichettatura da isotopo codifica per la quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ) 22. L&#39;uso di una singola tecnica proteomica potrebbe dare informazioni sufficienti, pertanto è necessario l&#39;utilizzo di due approcci di proteomica complementari per la maggior parte dei cambiamenti pienamente valutare in proteoma. Tuttavia, 2-D elettroforesi su gel è ampiamente utilizzato e può essere applicato routine per quantitativo espressione di diverse proteine ​​in organismi differenti. Qui si descrive una estrazione di proteine ​​whole-cell e 2-D le procedure di elettroforesi su gel per le specie di Burkholderia che sono stati adattati e ottimizzati da GE Healthcare 2-D elettroforesi Principi e metodi Handbook 80-6429-60AC 2004 ( <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ). L&#39;estrazione delle proteine ​​è stata effettuata utilizzando un battitore branello con perle di vetro in presenza di PBS contenente 5 mM di EDTA (etilendiammina tetraacetico) e 1 mM PMSF (fluoruro phenylmethylsulfonyl). Questa procedura permette la quantificazione delle proteine ​​con degradazione minima ed è modificabile per gli approcci di proteomica come precedentemente riportato 15,23,24. 2-D gel elettroforesi è stata effettuata usando 24 centimetri lungo immobilizzati pH 4-7 sfumate e proteine ​​sono state separate in base al loro punto isoelettrico. Poi proteine ​​sono state separate in base alla loro molecpeso colare da gel SDS-poliacrilammide. Inoltre, abbiamo descritto un metodo di colorazione argento per la visualizzazione di proteine ​​piatte e un metodo macchia d&#39;argento che è compatibile per analisi di spettrometria di massa. Insieme, queste procedure possono consentire l&#39;identificazione di proteine ​​importanti specie di Burkholderia che potrebbero essere coinvolti nella patogenesi.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7626</td>
 <td>Toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A18-1</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS Buffer</td>
 <td>Bioscience</td>
 <td>R028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP118-500 </td>
 <td>toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass beads (0.1 mm)</td>
 <td>BioSpec Products</td>
 <td>11079101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21009-342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroBCA protein extraction kit</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>23235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-681-375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-D Clean-Up kit</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6484-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15505-050</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>17-1314-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>856126</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>176002-46</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duracryl</td>
 <td>Proteomic Solutions</td>
 <td>80-0148</td>
 <td>Very toxic, carcinogen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP179-100</td>
 <td>Flammable, toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15524-010</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td>Acute toxicity, flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15510-027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>HC1100-1GL</td>
 <td>Flammable, toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A491-212</td>
 <td>Flammable, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutaraldehyde</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>G151-1</td>
 <td>Very toxic, corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium tetrathionate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2926</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium acetate</td>
 <td>EM Science</td>
 <td>7510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver nitrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>209139</td>
 <td>Corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>252549</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium thiosulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>EMD</td>
 <td>9230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>808831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>800688</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A412-4</td>
 <td>Flammable, toxic, health hazard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium carbonate anhydrous</td>
 <td>EMD</td>
 <td>SX0400-3</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral oil</td>
 <td>ACROS</td>
 <td>415080010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JA-20 ultracentrifuge rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>334831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini Beadbeater</td>
 <td>Biospec Products</td>
 <td>3110BX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6505-03</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6485-27</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species

L&#39;indagine dei livelli di proteine ​​intracellulari di specie batteriche è importante per comprendere i meccanismi patogenetici delle malattie causate da questi organismi. Qui si descrive un procedimento per l&#39;estrazione di proteine ​​da specie Burkholderia basato su lisi meccanica utilizzando perle di vetro in presenza di acido etilendiamminotetraacetico e fluoruro phenylmethylsulfonyl in tampone fosfato salino. Questo metodo può essere utilizzato per diverse specie di Burkholderia, per diverse condizioni di crescita, ed è probabile adatto per l&#39;uso in studi di proteomica di altri batteri. Dopo l&#39;estrazione di proteine, una bidimensionale (2-D) elettroforesi su gel tecnica proteomica è descritta per studiare i cambiamenti globali nei proteoma di questi organismi. Questo metodo consiste nella separazione delle proteine ​​in base al loro punto isoelettrico mediante focalizzazione isoelettrica nella prima dimensione, seguita da separazione sulla base del peso molecolaremediante elettroforesi su gel di acrilammide nella seconda dimensione. Visualizzazione di proteine ​​separate avviene tramite colorazione argentica.

Analisi comparativa dei profili proteici estratti dalla stessa coltura batterica in due diverse occasioni ha mostrato modelli simili banding indicando estrazioni di proteine ​​successo. Proteine ​​di peso molecolare estratte andavano 10-150 kDa. Figura 1 mostra rappresentante Coomassie blu colorazione gel delle estrazioni proteina whole-cell da multivorans Burkholderia (membro della BCC) isolati clinici coltivati ​​in LB o lievito / Manitol (YEM) brodo e raccolte da fase stazionaria...

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Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

I membri del genere Burkholderia sono patogeni di importanza clinica. Noi descriviamo un metodo per l&#39;estrazione delle proteine ​​totali batterica, utilizzando distruzione meccanica, e elettroforesi su gel 2-D per la successiva analisi proteomica.

Totale Estrazione di proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel Metodi per<em&gt; Burkholderia</em&gt; Specie

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

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Research

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Immunology and Infection

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

28.9K Views.  University of British Columbia.  I membri del genere Burkholderia sono patogeni di importanza clinica. Noi descriviamo un metodo per l'estrazione delle proteine ​​totali batterica, utilizzando distruzione meccanica, e elettroforesi su gel 2-D per la successiva analisi proteomica. 

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A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

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In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
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A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

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Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
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A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

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We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Due metodi di Formazione Heterokaryon per scoprire fattori di restrizione HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedure per l&#39;identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l&#39;apparato digerente di una specie aviaria

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infezione come modello per Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like receptor myeloid differentiation primary response gene 88 (TLR-MyD88) signaling pathway. IRF5 activation involves phosphorylation, dimerization, and subsequent translocation from the cytoplasm into the nucleus, which in turn induces the gene expression of various pro-inflammatory cytokines. A detection assay for IRF5 activation is essential to studying IRF5 functions and its relevant pathways. This article describes a robust assay to detect endogenous IRF5 activation in the CAL-1 human plasmacytoid dendritic cell (pDC) line. The protocol consists of a modified nondenaturing electrophoresis assay that can distinguish IRF5 in its monomer and dimer forms, thus providing an affordable and sensitive approach to analyze IRF5 activation.

A native Western blot method for analyzing endogenous interferon regulatory factor 5 dimerization in the CAL-1 plasmacytoid dendritic cell line is described. This protocol can be applied to other cell lines as well.

Nativa Polyacrilamide Gel Elettroforresis Immunoblot Analisi immunoblot di dimerazione Endogena IRF5

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...

Totale Estrazione di proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel Metodi per

Totale Estrazione di proteine e 2-D elettroforesi su gel Metodi per