Finanziamenti per lo sviluppo della pipetta di estrazione è stata fornita in parte da una ricerca interna e Grant lo sviluppo assegnato a DRP.

1. Esempio di Lysis <ol><li> I campioni dovrebbero essere in forma liquida. Se il campione è solido, ad esempio per il cibo o su uno sgabello, il campione dovrebbe essere sospeso in un mezzo liquido come l&#39;acqua o tampone fosfato (PBS). </li><li> Miscelare 500 microlitri del campione con 500 microlitri di 6M guanidina tiocianato (pH 6,5) in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Premere il bulbo di una pipetta di estrazione, espellendo l&#39;aria ambiente. </li><li> Tirare l&#39;intero 1 mL di campione nella pipetta di estrazione, il materiale assorbente, consentendo la lampadina di espandersi lentamente. </li><li> Capovolgere lo strumento di estrazione in modo tale che le perline assorbenti e scarico del campione nel bulbo. </li><li> Macinare le perline sorbente con il campione nel bulbo facendo attenzione a non espellere il campione dalla pipetta estrazione. </li></ol> 2. Acido nucleico di estrazione (figura 1, pannello A) <ol><li> Invertire la pipetta di estrazione (apertura verso il basso) ed espellere il campione nel tubo originale 1,5 mL. </li> &lt;li&gt; l&#39;intera Tirare 1 mL di campione nella pipetta di estrazione, passando sopra il sorbente, ad una velocità moderata, prestando attenzione a mantenere l&#39;assorbente nel collo della pipetta estrazione. </li><li> Espellere l&#39;intero campione nella provetta 1,5 ml premendo il bulbo. </li><li> Ripetere i punti 2.2 e 2.3, passando per il campione nel corso degli assorbenti quattro volte per un totale di 5 passaggi. </li><li> Dopo il quinto passaggio sopra l&#39;assorbente, espellere l&#39;intera 1 ml di campione in 4 ml di tampone di estrazione delle proteine ​​(in una provetta da 15 ml), chiudere il tubo, e mettere da parte per un uso successivo. </li><li> Lavare gli acidi nucleici isolati passando 1 mL di etanolo al 95% negli assorbenti tre volte, restituendo il etanolo al tubo originale sopra il passaggio finale. </li><li> Ripetere il passaggio 2,6 utilizzando un secondo 1 mL, lavaggio con etanolo al 95%. </li><li> Premere e rilasciare la lampadina per 5 minuti, passare aria ambiente per tutta la pipetta di estrazione per asciugare gli acidi nucleici / letto assorbente. Pulire l&#39;etanolo residuo dalla punta della pipetta di estrazione ucantare una Kimwipe. </li><li> Recuperare gli acidi nucleici passando 250 pl di 10 mM Tris (pH 6,8) negli assorbenti cinque volte. Il tampone Tris può essere sostituita da qualsiasi altra soluzione appropriata acquoso come PBS. La soluzione risultante contiene gli acidi nucleici estratti. </li></ol> 3. Protein Extraction (Figura 1, Panel B) <ol><li> Mescolare il campione e l&#39;estrazione del tubo tampone proteica a partire dal punto 2,5 per inversione e passare circa due o tre millilitri di questo campione 5 mL oltre l&#39;assorbente di una pipetta nuova estrazione. </li><li> Espellere l&#39;intero campione nello stesso tubo conico 15mL prestando attenzione a mantenere l&#39;assorbente nel collo della pipetta estrazione. </li><li> Ripetere i punti 3.1 e 3.2, passando per il campione nel corso degli assorbenti 15 volte. </li><li> Lavare il sorbente e la proteina legata passando 1 mL di etanolo al 95% sopra il letto sorbente tre volte, espellendo l&#39;etanolo in esso il tubo originale. </li><li> Ripetere il passaggio 3,4 utilizzando un secondo 1 mL, lavaggio con etanolo al 95%. </li><html><li> Premere e rilasciare la lampadina per 5 minuti, passare aria ambiente per tutta la pipetta di estrazione per asciugare la proteina / letto sorbente. Pulire etanolo residuo dalla punta della pipetta estrazione utilizzando un Kimwipe. </li><li> Recuperare la proteina passando 250 microlitri di PBS nel corso degli assorbenti cinque volte. Il tampone PBS può essere sostituita da qualsiasi altra soluzione appropriata acquoso come 10 mM Tris (pH 6,8). La soluzione risultante contiene il contenuto proteico del campione. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="Figura 1A" /> Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. contenuto &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5.

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Gli utensili e chimiche, i protocolli descritti in questa relazione rappresentano il primo esempio noto di un senza elettricità, multi-macromolecola sistema di estrazione che può essere utilizzato in campo-based, point-of-care applicazioni. Entrambi i tipi macromolecola può essere applicato a un numero di valle dispositivi diagnostici o analitica. Ad esempio, gli acidi nucleici isolati sono di qualità PCR (Figura 2 e 3), mentre la componente proteica del campione è immunoreattiva (Figura 4). L&#39;utilizzo di questo sistema di estrazione in aree limitate austere o una risorsa del mondo, potrebbe ridurre drasticamente il peso delle malattie sulle popolazioni che vi abitano. Questo sistema di estrazione potrebbe anche aiutare a programmi di sorveglianza delle malattie in tutto il mondo, fornendo un metodo efficace ma rapido e conveniente per l&#39;elaborazione del campione in luoghi austeri o remoto. Un aspetto importante del metodo di estrazione di cui sopra è chepuò essere modificato dall&#39;utente. Ad esempio, nei casi in cui la dimensione del campione è superiore o inferiore rispetto a quello iniziale (passo 500 μLs 1,2), l&#39;utente può regolare il volume dei reagenti conseguenza. Cioè, il rapporto volumetrico dei reagenti al campione deve rimanere costante mentre i volumi assoluti può essere alterato. Inoltre, le regolazioni del numero di passaggi sulla assorbente può anche essere effettuata a discrezione dell&#39;utente. Ad esempio, se un volume di campione più grande è, passare il campione sui tempi sorbente più di passi elencati (2,4 e 3,3) aumenterà la probabilità del tipo macromolecola (acido nucleico o proteina) contattare il sorbente. L&#39;aumento passaggi dovrebbero aumentare l&#39;efficienza acquisire fino a saturazione sorbente è raggiunto. Abbiamo trovato che l&#39;utensile di estrazione e chimici associati hanno alcune limitazioni, la più importante delle quali è che la chimica di estrazione delle proteine ​​è inefficiente per il recupero di altamente glicosilataproteine. Nel caso in cui la diagnostica valle bersaglio una proteina glicosilata, questo sistema non può essere ideale per l&#39;identificazione. Inoltre, i limiti superiore e inferiore di efficienza di estrazione sia per acidi nucleici o proteine ​​sono ancora determinate, e ottimizzazione è in corso per massimizzare l&#39;efficienza di recupero. L&#39;ulteriore sviluppo dello strumento sarà superare queste lacune nelle conoscenze attuali.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tiocianato di guanidina </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> etanolo </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-propanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109.827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

Patogeni tradizionali ed emergenti quali l&#39;enteroemorragica Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, o prioni a base di malattie sono di notevole preoccupazione per i governi, le industrie e gli operatori sanitari in tutto il mondo. Ad esempio, EHECs, combinati con Shigella, sono responsabili della morte di circa 325.000 bambini ogni anno e sono particolarmente diffusa nel mondo in via di sviluppo in cui l&#39;identificazione di laboratorio-based, comune negli Stati Uniti, non è disponibile 1. Lo sviluppo e la distribuzione di basso costo, sul campo, point-of-care alcuni strumenti per facilitare la rapida identificazione e / o la diagnosi di agenti patogeni o marker di malattia potrebbe alterare profondamente la progressione della malattia e la prognosi del paziente. Abbiamo sviluppato uno strumento per isolare gli acidi nucleici e proteine ​​da un campione di estrazione in fase solida (SPE) senza elettricità o associati attrezzature di laboratorio 2. Le macromolecole isolato può essere usato per diagnosisis sia in un laboratorio o in avanti utilizzando campo-basati point-of-care piattaforme. È importante sottolineare che questo metodo prevede il confronto diretto di acidi nucleici e proteine ​​di dati provenienti da un non-split del campione, offre una conferma di fiducia mediante analisi genomica e proteomica. Lo strumento di isolamento utilizza lo standard industriale per fase solida isolamento degli acidi nucleici, la tecnologia BOOM, che isola gli acidi nucleici da una soluzione salina caotropico, solitamente guanidina isotiocianato, attraverso il legame al particelle a base di silice o filtri 3. CUBRC proprietaria chimica in fase solida di estrazione viene usato per purificare proteine ​​da soluzioni saline caotropici, in questo caso, da rifiuti o flusso attraverso successivo isolamento di acido nucleico 4. Con imballaggio ben caratterizzato chimiche in una piccola piattaforma, poco costoso e semplice, abbiamo generato un sistema portatile per l&#39;estrazione dell&#39;acido nucleico e proteina che può essere eseguito in uno variety di condizioni. Gli acidi nucleici isolati sono stabili e possono essere trasportati in una posizione in cui l&#39;alimentazione è disponibile per l&#39;amplificazione PCR, mentre il contenuto proteico può essere immediatamente analizzati mediante mano o altri saggi basati immunologica. La rapida identificazione di marcatori di malattia nel settore potrebbe alterare sensibilmente i risultati del paziente dirigendo il corretto svolgimento del trattamento in una fase iniziale della progressione della malattia. Lo strumento e il metodo descritto sono adatti per l&#39;uso con qualsiasi agente infettivo e offrire all&#39;utente la ridondanza di multi-macromolecola analisi di tipo contemporaneamente riducendo l&#39;onere logistico.

Isolamento degli acidi nucleici: isolati acidi nucleici sono PCR amplificabile ed esenti da contaminazione proteine. Esempio 1: Gli acidi nucleici recuperati sono adatti per l&#39;uso in applicazioni basate su PCR. Ad esempio, la Figura 2 mostra l&#39;amplificazione di geni di tossina Shiga associati enteroemorragica E. coli O157: H7 ceppo EDL-933 (ATCC # 35150) da un acido nucleico / proteina procedimento di estrazione con la pipetta di estrazione. I geni della tossina Shiga STX stx 1 e 2 sono disponibili sul temperato lambda-like batteriofago e difettoso batteriofago in questo e altri enteroemorragica E. coli sotto il controllo del promotore P R 5 6 7 8. L&#39;attivazione della risposta SOS in E. coli porta a profago induzione e / o produzione di tossina 9. Abbiamo utilizzato una versione modificata del saggio PCR multiplato da Feng et al. 11 per identificare l&#39;stx 1 e STX 2 geni in cultura e campioni delle acque reflue a spillo. Corsie A e B nella figura 2 mostrano i risultati di una amplificazione PCR di un campione di coltura non trasformato (corsia A) e un campione cultura elaborato (corsia B). Questi risultati sono praticamente identici significato vi è alcuna perdita di fedeltà negli acidi nucleici isolati o trasformati. Abbiamo poi amplificato a spillo acque reflue non trattate (corsia D) o isolati gli acidi nucleici da liquami a spillo corsie (E &amp; F). Questi dati indicano che gli acidi nucleici isolati comportato maggiore rispetto amplificazione degli acidi nucleici non-isolato da campioni spiked liquami. Abbiamo quindi concludere che sia inibitori della PCR naturalmente presenti nelle acque di scarico sono stati rimossi dopo isolamento o che gli acidi nucleici sono stati concentrati su di isolamento. Una combinazione di queste due ipotesi è anche possibile. Spettroscopia ultravioletta è stato accanto usato per dimostrare che gli acidi nucleici isolati erano relativamente liberi of proteina contaminante. Figura 3 mostra gli spettri UV di due E. coli O157: H7 estrazioni acido nucleico, isolamento con A e B isolamento, rispetto allo spettro normalizzato della coltura batterica, etichettato pre-isolamento. Gli spettri UV degli acidi nucleici isolati assomiglia spettri di pure acidi nucleici, avente un rapporto calcolato di assorbanza tra 260 nm e 280 nm avvicinano 1,8 10. Questi dati mostrano che vi è molto poco proteine ​​contaminanti nella frazione di acido nucleico recuperato usando la tecnica descritta. Isolamento delle proteine: proteine ​​recuperato dal acidi nucleici / proteine ​​esperimento di isolamento è immunoreattiva e elettroforeticamente identica alla proteina pura. Esempio 2: La frazione di proteina isolata è stata applicata alla E. RapidChek coli O157 strisce laterali di flusso saggio (SDIX, Inc.). I controlli mostrano una identificazione positiva in tutti i campioni ospitano E. coli<html> O157, con o senza induzione STX (figura 4, corsie B e C, rispettivamente). I dati in figura 4 mostrano anche risultati positivi per i campioni ospitano E. coli O157 che sono stati elaborati per acidi nucleici e proteine ​​poi con la pipetta di estrazione. Questi dati dimostrano che la proteina isolata da ogni campione è immunoreattiva innescando così una risposta positiva. Amplificazione PCR (come descritto nell&#39;Esempio 1) è stata effettuata sui campioni di proteine ​​per dimostrare che la frazione di proteina isolata era privo di contaminanti acidi nucleici. I risultati di questi esperimenti erano tutti negativi mediante elettroforesi su gel. Quindi, concludiamo che il contenuto proteico del campione è stata separata dalla contaminazione acidi nucleici. Questi risultati, preso in complesso con quelli descritti per la fase di isolamento nucleico mostra acido che gli acidi nucleici e proteine ​​contenuti sono isolati in fasi distinte di frazionamento. t &quot;&gt; Esempio 3:. La proteina isolata è adatto per elettroforesi 10 La Figura 5 illustra un coomassie macchiata gel di acrilammide 8% caricato con BSA (Figura 5, corsie A e C) e BSA isolato da 6M guanidina isotiocianato utilizzando l&#39;estrazione pipetta e associato protocollo. La mobilità elettroforetica della proteina isolata è identica a quella dei campioni di controllo. Abbiamo quindi concludere che il processo di estrazione non altera la struttura covalente della proteina isolata. <img alt="Figura 1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> Figura 1, Panel A: Rappresentazione di una tipica procedura di estrazione degli acidi nucleici Il campione viene mescolato con 6M guanidina tiocianato nella provetta campione e passato sopra l&#39;assorbente cinque volte.. Dopo l&#39;ultimo passaggio, il campione viene aggiunto al tampone di estrazione delle proteine. Gli acidi nucleici adsorbimento e legato vengono lavate due volte con etanolo. Il campione è poi libero in aria dRied e eluite dalla sorbente. <img alt="Figura 1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> Figura 1, pannello B: Rappresentazione di un tipico procedimento di estrazione delle proteine ​​Il campione miscelato con tampone isolamento delle proteine ​​dal passaggio 1, Figura 1, pannello A è passato sopra la sorbente di una pipetta seconda estrazione 15 volte.. Il resto della procedura è identico a quello del protocollo di estrazione degli acidi nucleici. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> Figura 2:. Immagine negativa di un macchiato etidio bromuro di gel di agarosio Un multiplex gene della tossina Shiga 1 e 2 esperimento di amplificazione è stata eseguita utilizzando campioni di cultura (corsie A e B) o dei campioni di liquami non trattati addizionati con E. coli O157: H7 (corsie D, E e F). I campioni sono stati aggiunti direttamente a un tubo di reazione di PCR (corsie A e D), oppure i campioni sono stati elaborati usando il proces isolamentos e gli acidi nucleici estratti sono stati aggiunti al tubo di reazione di PCR (campioni B, E e F). Il protocollo PCR è una modifica di quella descritta da Feng et al 11. La nostra modifica mirata solo quelli amplificata dalla stx 1 (fascia inferiore) e stx 2 (fascia superiore) coppie di primer, abbandono tutte le altre coppie di primer. Corsia C è la scala da BioRad 1Kb. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> Figura 3: risultati della spettroscopia UV E. coli O157: H7 acidi nucleici isolato con la pipetta di estrazione riportato isolati Gli acidi nucleici sono etichettati isolamento a e b isolamento.. Lo spettro UV del campione è stato anche testato prima dell&#39;estrazione dell&#39;acido nucleico ed è etichettato pre-isolamento. Gli spettri sono stati ottenuti utilizzando uno spettrofotometro Hitachi U3010 e pacchetto software associato. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt;. Figura 4: Foto a colori di strisce reattive RapidChek Il contenuto proteico dei campioni utilizzati in figura 2 è stato isolato con la pipetta di estrazione e testati per immuno-reattività con test a flusso laterale. Lanes AC sono i controlli non trasformati, che è, è stato aggiunto coltura cellulare per la striscia di test senza estrazione di acidi nucleici o di proteine. Corsia A è E. coli BL21 DE3 pLysS come controllo negativo, corsie B e C mostrano E. coli O157: H7 che era non trattata (B), o trattate con mitomicina C per 4 ore (C). Lanes D attraverso H mostrano i risultati di aggiunta della proteina estratta per le strisce di prova di flusso laterali. Lanes D ed E sono stati sondati utilizzando estratti proteici da E. coli BL21 DE3 pLysS o senza (D) o trattamento con mitomicina C (E) come controlli negativi. Lanes FH mostrano i risultati quando le proteine ​​estratte da E. coli O157: H7 è stato utilizzato. La proteina è stata estratta da non trattata (F), o da 2 ore (G) o 4 ore (H) mitomicina C colture trattate.Risultati positivi producono una doppia linea rossa. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> Figura 5:. Fotografia di uno colorato con Coomassie SDS-PAGE BSA è stato isolato dalla soluzione mediante la pipetta estrazione e protocolli descritti. Corsie A e C sono corsie di controllo di 250 ug / ml e 500 pg / ml, rispettivamente. Corsie B e D rappresentano BSA recuperato da soluzioni contenenti le stesse concentrazioni rispettivi controlli.

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Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Uno strumento e chimici sono descritti per isolare sequenzialmente acidi nucleici seguite da proteine ​​da un campione senza la necessità di energia elettrica. Lo strumento consiste in un assorbente tenersi entro una pipetta di trasferimento, mentre le caratteristiche chimiche di isolamento si basano su una solida fase di estrazione dei principi. Le macromolecole isolati possono essere analizzati mediante saggi immuno-based e basato su PCR.

Elettricità-Free, Nucleic Acid sequenziale e isolamento delle proteine

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Views.  CUBRC, Inc.. Uno strumento e chimici sono descritti per isolare sequenzialmente acidi nucleici seguite da proteine ​​da un campione senza la necessità di energia elettrica. Lo strumento consiste in un assorbente tenersi entro una pipetta di trasferimento, mentre le caratteristiche chimiche di isolamento si basano su una solida fase di estrazione dei principi. Le macromolecole isolati possono essere analizzati mediante saggi immuno-based e basato su PCR.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Analisi e costruzione di strutture acidi nucleici con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Specifici Sequenza Etichettatura degli acidi nucleici e proteine ​​con metiltransferasi e cofattore Analoghi

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...