Questo lavoro è stato supportato da una Wellcome Trust Clinical PhD fellowship (ECAT).

1. Fabbricazione di Patterns parilene su SiO 2: Flusso di processo (vedi figura 1) <ol><li> Disegno desiderato configurazione parylene-C utilizzando un pacchetto software editor di layout, in grado di leggere / scrivere CIF (Caltech forma intermedia) o file GDS-II (Database Graphic System-II). CIF e GDS-II sono formati di file standard di settore per la disposizione del materiale illustrativo circuito integrato. </li><li> Maschera photo Commissione produzione di un impianto di microelettronica appropriate, o fare in casa se esistono strutture. </li><li> Ossidare un wafer di silicio in un forno orizzontale atmosferica (H 2 1.88 SLM e O 2 1.25 SLM) a 950 ° C per 40 minuti per produrre un 200 nm SiO 2 strati (spessore terminare con una piccola macchia spettroscopica riflettometro). </li><li> Prime wafer ossidato con un promotore di adesione silano. Ora depositare parylene-C a 22 ° C ad una velocità di 1.298 nm / mg di dimero utilizzando un sistema di deposizione sotto vuoto creato appositamente per depositare parylene. A 100Rivestimento parylene-C spessore nm è stato usato per tutti gli esempi riportati di seguito. </li><li> Prossimo deposito esametildisilazano (HMDS) promotore di adesione sul wafer parylene rivestite di un sistema idoneo rivestimento foto-resist. </li><li> Ora ruotare il wafer a 4.000 rpm per 30 sec, nell&#39;applicazione positivo foto-resist (risultante in uno spessore teorico di 1 micron), utilizzando lo stesso sistema di rivestimento photoresist come sopra. </li><li> Morbido cuocere il wafer per 60 sec a 90 ° C. </li><li> Inserire sia il wafer e fotomaschera preconfezionati in un allineatore maschera. </li><li> Esporre il wafer photoresist rivestite con una rappresentazione negativa UV della configurazione parylene-C desideri. </li><li> Cuocere wafer esposto per 60 sec a 110 ° C. </li><li> Rimuovere tutti esposti photo-resist dal wafer sviluppando in una soluzione di sviluppo adeguato. </li><li> Etch fuori dal parilene non protetto. Utilizzare un sistema etch plasma di ossigeno (ad una pressione della camera 50 mTorr, 49 sccm O 2, 100 W di potenza RF a 13,56 MHz, euna velocità di incisione di 100 nm / min) per rivelare sottostante SiO 2. </li><li> Tagliare il wafer utilizzando un appropriato sega di suddivisione in piastrine (velocità del mandrino 30.000 rpm, velocità di avanzamento 7 millimetri / sec). </li><li> Sciacquare chips in H 2 O deionizzata e asciugare con azoto. </li><li> Il negozio di chip (a tempo indeterminato) in scatole di polvere libera fino al momento. </li></ol> 2. Chip di pulizia e attivazione: Protocollo <ol><li> Rimuovere photoresist residuo da trucioli mediante lavaggio in acetone per 10 sec. </li><li> Sciacquare con acqua deionizzata distillata H 2 O 3x. </li><li> Portare acido Piranha fresco (un rapporto di 05:03 di 30% di perossido di idrogeno e 98% di acido solforico). ATTENZIONE: Preparare acido piranha con grande cura. È un ossidante estremamente potente, è fortemente acido, e mescolando perossido di idrogeno con acido solforico è una reazione esotermica. Eseguire questa fase in una cappa di acido. Lasciare due minuti per passare dopo la miscelazione l&#39;acido piranha ma utilizzano meno di 20 min. </li><li> Patatine pulite e etch per immersione in piL&#39;acido ranha per 10 min. </li><li> Sciacquare chip 3x in H 2 O deionizzata e trasferire ad un piatto di coltura sterile. </li><li> Ora attivare chip per patterning cellulare. Ad esempio, aggiungere due chip per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e poi aggiungere 2 ml di siero fetale bovino in modo da immergere completamente tutti i chip. Eseguire questa, e tutte le fasi successive di coltura cellulare, in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale a flusso laminare. </li><li> Incubare chip nel siero per 3-12 ore a 37 ° C. NOTA: I passaggi 2,4-2,7 devono essere eseguiti in sequenza e senza ritardi tra i passaggi. Se l&#39;attivazione del siero viene ritardata da ≥ 24 ore dopo il piranha-trattamento, patterning cellulare è compromessa a causa della ridotta repulsione cellulare da SiO 2 regioni. Soluzioni di attivazione alternativa contenenti proteine ​​di adesione cellulare specifici possono essere utilizzati al posto di siero fetale bovino. Tali soluzioni alterano le caratteristiche di adesione cellulare dei due substrati contrastanti (cfr. risultati rappresentativi per un esempio). </li&gt; </ol> 3. Placcatura Linee Cellulari On-chip: Protocollo <ol><li> Rimuovere il chip dalla loro soluzione di attivazione e lavare una volta per 10 secondi in soluzione salina bilanciata di Hank. </li><li> Posizionare circuito integrato in una cultura ben e piastra tipo di cellula scelto come sospensioni in terreni di crescita usuale. Ottimale densità di placcatura cella dipende sia dal tipo di cellula e disegno geometrico di parylene-C on-chip. Una densità di 5 x 10 4 cellule / ml è un punto di partenza ragionevole. </li><li> Imaging è su misura per la motivazione di fondo per patterning cellulare, ma il comportamento cellulare diretta può essere facilmente valutata utilizzando un microscopio da dissezione e una fotocamera digitale con una lente relay adatto. </li></ol>

<ol>
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Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Immersione di chip in acido piranha non serve solo a rimuovere qualsiasi materiale organico residuo, ma anche attacca le superfici di substrato. Questa è la chiave per consentire l&#39;attivazione efficace con siero fetale bovino. In caso contrario, impedisce cellula-patterning e profondamente altera il comportamento delle cellule on-chip. Non vi è alcun obbligo di sterilizzare i chip dopo la pulizia con acido piranha. Infatti sterilizzazione mediante raggi UV ha dimostrato di minare patterning cellulare in modo dose-dipendente 13. Bisogna fare attenzione a lavare tutto photoresist residuo dopo il processo fotolitografico. Persistenza fotosensibile può agire come strato cito-adesivo indesiderato che sostituisce patterning dettata da parylene-C/SiO 2 geometria. L&#39;acetone è efficace quando si utilizza il processo fotolitografico descritto sopra e con i reagenti specificati. Tuttavia, altri tipi di photoresist possono richiedere un solvente diverso. Per valutare l&#39;impatto e il successo della different fasi di fabbricazione, l&#39;angolo di contatto dei due substrati contrastanti possono essere misurati. figura 2 illustra le alterazioni che si verificano durante il processo di attivazione chip. È probabile, tuttavia, che adesivo specifico e componenti proteiche repulsive nel siero definitiva abilitare il chip parilene-modellata per esercitare le rispettive caratteristiche cito-adesive o cito-repellente. Tutti i risultati rappresentativi utilizzati chips con uno spessore parylene di 100 nm, se abbiamo modellato con successo utilizzando sia più spessi e sottili strati parilene. È importante sottolineare che questa tecnica di incisione fotolitografica permette un maggiore controllo tridimensionale della configurazione parylene quello illustrato qui. Ad esempio, utilizzando una combinazione di fotomaschere, è possibile creare aree parylene di spessore misto. Questo apre la strada alla creazione di colture cellulari con definito topografia tridimensionale, andando oltre la semplice dettare le regioni di adesione cellulare / repulSion, potenzialmente offre un mezzo per integrare canali microfluidica nel costrutto. Come mostrato, tuttavia, questa piattaforma patterning non è universalmente efficace di tutti i tipi di cellule. Diverse linee cellulari, con i loro vari profili molecola di adesione cellulare, ovviamente si comportano diversamente quando coltivate su questa piattaforma. Non abbiamo ancora identificato i componenti chiave nel siero, né i recettori delle cellule membrana gratuiti, che sono alla base di questa piattaforma cellula-patterning. In questo modo in futuro promette di ampliare la sua utilità e specificità. Ad esempio, una linea cellulare di &#39;non-patterning&#39; potrebbe essere geneticamente modificato per esprimere la molecola di adesione necessaria e quindi promuovere patterning.

La comprensione dei meccanismi che determinano l&#39;adesione cellulare e patterning su materiali sintetici è importante per applicazioni come ingegneria dei tessuti, la scoperta di farmaci, e la fabbricazione di biosensori 1-3. Molte tecniche sono disponibili e in continua evoluzione, ogni approfittando dei fattori biologici, chimici e fisici che influenzano una miriade di adesione cellulare. Qui, descriviamo una tecnica di cell-patterning che utilizza i processi, inizialmente sviluppati per scopi di fabbricazione microelettroniche. Come tale, la piattaforma è ben posizionato per consentire l&#39;integrazione a valle delle tecnologie microelettroniche, come MEA, nella piattaforma patterning. L&#39;interfaccia tra una membrana cellulare ed un materiale adiacente è bidirezionale e complesso. In vivo, proteine ​​della matrice extracellulare forniscono la struttura e la forza e l&#39;impatto sul comportamento cellulare tramite interazione con recettori di adesione cellulare. Analogamente le cellule in vitro interagire con substrati sintetici via strati assorbite delle proteine ​​4, mentre le influenze fisico-chimiche anche modulano l&#39;adesione. Per esempio, una superficie polimerica può essere reso più &quot;bagnabile&quot; (idrofilo) da ioni o irradiazione di luce ultravioletta, o incisione mediante trattamento con acido o idrossido 5. Modalità stabilite per patterning cellulare approfittare di questi e di altri mediatori di adesione cellulare. Gli esempi includono la stampa a getto d&#39;inchiostro 6, microcontact stampaggio 7, immobilizzazione fisica 8, 9 microfluidica, manipolazione in tempo reale 10 e selettiva patterning assemblaggio molecolare (SMAP) 11. Ognuno ha vantaggi e limitazioni specifiche. Un fattore chiave nel nostro lavoro, tuttavia, è quello di integrare patterning cellulare con sistemi microelettromeccanici (MEMS). MEMS riferiscono a estremamente piccoli dispositivi meccanici azionati elettricamente. Questo si sovrappone con la scala nanometrica equivalente, nanoelectromechSistemi anical. Questo concetto è diventato pratica solo quando le strategie di semiconduttori hanno consentito di fabbricazione che si terrà alla microscala. Tecniche di microfabbricazione sviluppate originariamente per elettronica dei semiconduttori sono state inavvertitamente trovato utile per altri usi quali elettrofisiologia cellulare, per esempio. Un obiettivo a valle fondamentale è quello di combinare tali tecnologie microelettroniche con un processo di patterning cellulare ad alta fedeltà (formando un dispositivo bioMEMS). Diverse tecniche cell-patterning esistenti e comunque affidabili e pratici sono incompatibili con questa idea. Ad esempio, l&#39;allineamento preciso delle eventuali microelettronica o biosensori embedded è fondamentale per la loro efficacia, ma è estremamente difficile da realizzare utilizzando una tecnica come timbratura a microcontatto. Per aggirare questo problema, stiamo lavorando su una piattaforma patterning basata su 2 SiO che utilizza fotolitograficamente stampato parilene-C. Fotolitografia comporta il trasferimento delle caratteristiche geometriche dauna maschera di un substrato mediante illuminazione UV. Una maschera è stata progettata con un adeguato programma di progettazione assistita da computer. Su una lastra di vetro, un sottile strato di cromo non trasparente rappresenta il disegno geometrico desiderato (risoluzione caratteristica di 1-2 mm è possibile). Il substrato deve essere modellato è rivestita con un sottile strato di photoresist (un polimero UV-sensitive). Il polimero rivestito viene poi allineato e portato in stretto contatto con la maschera. Una fonte UV viene applicato in modo tale che le aree non protette sono irradiati e quindi diventa solubile ed estraibile nella successiva fase di sviluppo, lasciando una rappresentazione parylene-C del modello di maschera dietro. Questo processo ha avuto origine durante lo sviluppo di dispositivi a semiconduttore. Come tale, wafer di silicio sono frequentemente utilizzati come substrato. Deposizione fotolitografica di parylene-C su SiO 2 è quindi un processo semplice e affidabile che si svolge abitualmente in strutture camera bianca microelettronici. Mentre parylene hadiverse caratteristiche desiderabili bioingegneria (chimicamente inerte, non bio-degradabile), un fattore limitante l&#39;uso diretto patterning cellulare è la sua adesività delle cellule innato poveri, attribuito in parte alla sua estrema idrofobicità. Tuttavia, parylene-C è stato usato in precedenza indirettamente per patterning cellulare, per esempio come modello cellulare pelabile 12,13. Questo approccio è limitata dalla scarsa risoluzione e richiede più passaggi. Il processo qui descritto invece utilizza un passo etch acido, seguito da incubazione del siero, per garantire che le regioni parylene-C diventano cellula-adesivo, attraverso una combinazione di riduzione idrofobicità e siero proteina legante. Il risultato finale è una costruzione composta da due substrati diversi, che, dopo l&#39;attivazione biologica, manifestano rispettive caratteristiche cito-adesivo o cito-repellente e quindi rappresenta una piattaforma picchiettare cella efficace. È importante sottolineare che non vi è alcuna necessità di introdurre ag biologicagenitori nella struttura camera bianca come i substrati fantasia possono essere conservati a tempo indefinito prima dell&#39;uso (dopo di che vengono attivati ​​con siero fetale bovino o un&#39;altra soluzione di attivazione). Questa piattaforma parylene-C/SiO 2 patterning è quindi un buon candidato per una coalizione con i componenti MEMS, i processi di fabbricazione così strettamente rispecchiano quelli utilizzati per la fabbricazione microelettronica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

Piattaforme patterning cellulare supportano gli obiettivi generali di ricerca, come la costruzione di reti predefiniti in vitro neuronali e l&#39;esplorazione di alcuni aspetti centrali della fisiologia cellulare. Per combinare facilmente patterning cellulare con Multi-Electrode Array (MEA) e la base di silicio &#39;lab on a chip&#39; tecnologie, è necessario un protocollo compatibile microfabbricazione. Descriviamo un metodo che utilizza la deposizione del polimero parylene-C su SiO 2 wafer. Fotolitografia consente di patterning accurate e affidabili di parylene-C con risoluzione a livello di micron. Attivazione successiva immersione in siero fetale bovino (o un&#39;altra soluzione attivazione specifica) determina un substrato in cui le cellule coltivate aderiscono, o sono respinti rispettivamente, parylene o SiO 2 regioni. Questa tecnica ha permesso patterning di una vasta gamma di tipi di cellule (comprese le cellule primarie murine ippocampali, HEK 293 linea cellulare, teratocarcinoma neurone umano similelinea cellulare, le cellule granulari del cervelletto di topo primarie e cellule primarie umane di glioma-derivati ​​gambo-like). È interessante notare, tuttavia, la piattaforma non è universale, che riflette l&#39;importanza di molecole di adesione cellula-specifici. Questo processo di patterning cellulare è conveniente, affidabile e soprattutto può essere incorporato in microfabbricazione di serie (produzione di chip) protocolli, aprendo la strada per l&#39;integrazione della tecnologia microelettronica.

Il processo di fotolitografia patterning SiO 2 con parylene-C è illustrato in Figura 1. Una volta preparata, l&#39;attivazione di chip nel siero fetale bovino consente una vasta gamma di tipi di cellule da ripetere in coltura. Il nostro gruppo ha modellato con successo le cellule primarie murine dell&#39;ippocampo 14-16, la linea HEK 293 cellule 17, il teratocarcinoma neurone umano tipo (HNT) linea cellulare 18, granuli cerebellari murine primarie e cellule primarie umane di glioma-derivati ​​gambo-like. Figura 3 illustra robusta patterning di cellule HEK 293 su un modello parylene costituito da nodi circolari con estensioni &quot;a croce&quot;. Attivazione Chip in questo esempio era con siero fetale bovino. Al contrario, la figura 4 illustra il potenziale per aumentare la piattaforma patterning utilizzando soluzioni di attivazione alternativa. Utilizzando una soluzione di albumina di siero bovino (3 mg / ml) e<html> fibronectina (1 mg / ml) in HBSS, il precedente patterning precetto è stata invertita. La Figura 5 illustra un tipo cellulare diverso (una linea di derivazione umana primaria staminali come cellula derivata da un glioma di alto grado). Qui, la geometria del comportamento cellulare impatti modello sottostante, con lo schema mostrato in Figura 4A promozione della crescita delle cellule processo lungo sottile parylene-C ascolti come illustrato nelle Figure 4B e 4C. Alcuni tipi di cellule non fanno del modello quando si utilizza il feto protocollo di attivazione siero bovino stabilito. Figura 6 illustra 3T3 L1 crescita a confluenza con nessuna differenza cito-ripugnante o cito-adesivo distinguibile tra le due regioni parylene-C e SiO. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema di flusso che illustra il processo per la fabbricazione di modelli parylene-C su SiO 2. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figura 2. Diagramma di flusso che illustra le variazioni di angolo di contatto per motivi geometrici parylene-C e SiO 2 domini durante le fasi di attivazione chip. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figura 3. Imaging dal vivo di cellule HEK 293 cellule coltivate su parylene-C/SiO 2 dopo tre giorni in vitro. Chips incubate per 3 ore in siero fetale bovino, dopo di che le cellule eranoplaccato in sospensione ad una concentrazione di 5 x 10 4 cellule / ml. Parylene-C favorisce l&#39;adesione delle cellule mentre nudo SiO 2, respinge le cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figura 4. Cellule vive di cellule HEK 293 coltivate su parylene-C/SiO 2 dopo tre giorni in vitro Chips attivate per 3 ore in diverse soluzioni di attivazione razionalizzata:. A: siero fetale bovino, B: vitronectina (1 mg / ml) in HBSS, C: Albumina di siero bovino (3 mg / ml) + vitronectina (1 mg / ml) in HBSS, D: sieroalbumina bovina (3 mg / ml) + fibronectina (156; g / ml) in HBSS. Cellule piastrate erano in sospensione ad una densità di 5 x 10 4 cellule / ml. Si noti come diverso trattamento del chip ha portato un&#39;inversione della precedente dogma patterning, con SiO 2 ora adesivo e parylene-C ripugnante. Parylene-C diametro nodo 250 micron, adattato da Hughes et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figura 5. Immagini immunofluorescenza di cellule primarie umane di glioma-derivati ​​gambo simile coltivate su vari modelli di parylene-C su SiO 2 A:. Schematicamente il disegno reticolare parylene mostrato in B e C </strong&gt; B:.. Fluorescenza microscopio di cellule fissate (dopo 4 giorni in vitro) tinto di proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) C:. Luce microfotografia di cellule vive sullo stesso chip di D: l&#39;immagine di fluorescenza che illustra le cellule GFAP-colorate su un parylene diversa E il design:.. immagine riflettanza del nodo e ha parlato di design parylene ripreso in D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figura 6. L&#39;imaging cellulare dal vivo di 3T3 L1 coltivate su parylene-C/SiO 2 dopo quattro giorni in vitro. Chips attivati ​​per 3 ore nel siero fetale bovino dopo wuali cellule sono state piastrate in sospensione (3 x 10 4 cellule / ml). In questo caso, la piattaforma non consente patterning, con le cellule diventando altrettanto confluenti su parylene-C e SiO 2 regioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Questo protocollo descrive un metodo compatibile microfabbricazione per patterning cellulare su SiO 2. Un disegno predefinito parylene-C è fotolitograficamente stampato su SiO 2 wafer. Dopo l&#39;incubazione con siero (o altra soluzione di attivazione) cellule aderiscono specificamente (e crescere secondo la conformità dei) sottostante parylene-C, pur essendo repulsione per SiO 2 regioni.

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

13.2K Views.  The University of Edinburgh.  Questo protocollo descrive un metodo compatibile microfabbricazione per patterning cellulare su SiO 2. Un disegno predefinito parylene-C è fotolitograficamente stampato su SiO 2 wafer. Dopo l'incubazione con siero (o altra soluzione di attivazione) cellule aderiscono specificamente (e crescere secondo la conformità dei) sottostante parylene-C, pur essendo repulsione per SiO 2 regioni. 

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Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plasma Surface Patterning litografia per la creazione di reti di cella

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Ricerca

Bioingegneria

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Valutazione della proliferazione dei cheratinociti su bi - e tri - dimensionale substrati di collagene di tipo I

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...