Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (NIH) a RCB, CA122985 e della prostata SPORE CA90386, e di JMP, NIH T32 AG000260 &quot;Drug Discovery Formazione in disturbi legati all&#39;età&quot;, e da Walter S. e Lucienne Driskill Graduate Program in Scienze Biologiche presso la Northwestern University. Vorremmo anche ringraziare il Fenotipizzazione Mouse e Istologia Laboratorio e Patologia Nucleo Struttura presso la Northwestern University.

Per tutte le procedure che coinvolgono gli animali, i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC) alla Northwestern University. Le tecniche chirurgiche e le condizioni per la cura degli animali sono state osservate dal personale veterinario e modificate per ridurre al minimo lo stress degli animali o la mortalità. I singoli istituti possono avere esigenze diverse ed è importante lavorare con IACUC e animale personale quando lo sviluppo e l&#39;esecuzione di questa tecnica chirurgica. 1. Preparazione di cellule per iniezione <ol><li> Questa operazione deve essere effettuata il più vicino possibile a interventi chirurgici di partenza. Trypsinize cellule di essere utilizzati per l&#39;esperimento, togliere dal piatto, e neutralizzare con i media. La linea cellulare PC3-M umana CaP stabilmente trasfettate con GFP è stato usato con successo per questi esperimenti, a causa delle condizioni di rapida crescita delle cellule PC3-M. GFP è stato aggiunto per ulteriori facilità di rilevamento delle metastasi polmonari nei campioni di tessuto polmonare e rapida determinazionecellule tumorali rispetto a cellule immunitarie in colture ottenute da sangue e midollo osseo per identificare le cellule tumorali circolanti. Se modificando uno specifico gene di interesse, poi creazione di linee cellulari stabili con questo gene alterazione viene eseguita per prima, seguita da trasfezione con GFP. Se GFP altererà la funzione di questo gene di interesse, GFP può essere omesso. Questo renderà rilevamento di metastasi polmonari più difficile, ma ancora raggiungibile. Inoltre, se si utilizza la tecnologia di imaging specifico utilizzando marcatori fluorescenti, come base luciferasi-IVIS, altre proteine ​​fluorescenti possono essere utilizzati al posto. </li><li> Centrifugare per 5 min a 225 x g. </li><li> Isolare 2,5 x 10 5 cellule e centrifugare per 5 min a 225 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 20 ml di soluzione fisiologica sterile. </li><li> Sospensione cellulare Aspirare in una siringa da 0,5 ml, con un permanente 28 ½ G ago (consigliato: Kendall monogetto, come altre marche hanno causato problemi), garantendo l&#39;aria entra al agoong con la sospensione. </li><li> Avvolgere la siringa in un foglio sterile e memorizzare sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. L&#39;impianto ortotopico di cellule umane di cancro alla prostata <ol><li> Sono utilizzati maschio di 6-8 settimane di età Balb / c athymic topi. Il mouse peso corporeo ideale per la chirurgia è 19-21 g, e topi dovrebbe essere consentito di crescere per almeno 18 g prima dell&#39;intervento chirurgico. Animali più piccoli sono tecnicamente più difficili da operare. Animali più grandi tendono a sperimentare cinetica più lenta della crescita tumorale e metastasi. Gli animali dovrebbero essere ospitati nella struttura animale almeno una settimana prima di un intervento chirurgico per ridurre al minimo lo stress degli animali. A seconda del disegno sperimentale, il trattamento farmacologico può iniziare una settimana prima dell&#39;intervento. </li><li> Iniettare dolore pre-operatorio di farmaci secondo le istruzioni di impianto degli animali. 0,1 mg / kg di peso corporeo Buprenex sottocutanea utilizzando un ago 30 G ½ attaccato ad una siringa da 1 ml è suggerito. </li><li> Posizionare gli animali nella camera di isoflurano e attendere che gli animali sono completamente unnesthetized. Nessun riflesso punta del tono muscolare dovrebbe essere presente a questo punto. Questo metodo è consigliato, ma se non disponibili, altri metodi di anestesia può essere utilizzato in base alle istruzioni del stabulario. </li><li> Spostare animale fuori dalla camera isoflurano in una cappa sterile procedura. Posizionare animale nell&#39;apparecchio cono, e ri-assicurarsi che animale è a pieno anesthetization prima di procedere. </li><li> Disinfettare bassa regione addominale con uno scrub Betadine con batuffoli di cotone sterili, pulire con alcool pulire, e spruzzi finale con soluzione di Betadine. Lasciare asciugare. </li><li> Utilizzando un bisturi sterile o forbici chirurgiche sterili affilate, una bassa incisione addominale mediana di circa 3-4 mm è fatto. Sollevare delicatamente la vescica con pinze e identificare il lobo ventrale della prostata. Questi due lobi si trovano direttamente sotto la vescica. Alcuni topi avranno un piccolo strato di grasso che copre la prostata che può essere spostata delicatamente parte usando un tampone di cotone sterile. Minimizzandoe qualsiasi movimento di organi e muscolatura se possibile. </li><li> Iniettare soluzione di cellule di volume ul 20 nella ghiandola prostatica, minimizzando le perdite e assicurando una piccola bolla viene osservata. </li><li> Sostituire la vescica e chiudere lo strato di muscolo utilizzando 4,0 assorbibili sutura Vicryl monofilamento in un semplice schema interrotto. </li><li> Chiudere lo strato di pelle con sterili 9 millimetri graffette. </li><li> Rimuovere animali dall&#39;anestesia isoflurano e monitorare fino svegli e muoversi normalmente. Mettere in rilievo di riscaldamento durante il periodo di recupero. </li><li> Se vengono eseguiti diversi interventi chirurgici, tra ambulatori, pulire tutti gli strumenti con il 70% di etanolo, e sterilizzare utilizzando uno sterilizzatore perle di vetro. Lasciare strumenti per raffreddare completamente prima di animale successivo. Non riutilizzare suture, batuffoli di cotone o tamponi sterili. </li></ol> 3. Monitoraggio Animali <ol><li> Somministrare farmaci antidolorifici in base alle istruzioni del stabulario. 4 ore post-chirurgia somministrazione di una dose di meloxicam sottocutanea a 1 mg / kg di peso corporeo ucantare un ago da 30 G ½ attaccato ad una siringa da 1 ml è suggerito, seguita da una dose aggiuntiva ogni 12-24 ore per il prossimo 48 hr. </li><li> Staples possono essere rimossi da animali 7-10 giorni post-operatorie dopo la ferita è guarita. </li><li> Controllo del peso degli animali, il consumo di cibo, e palpare i topi per i tumori due volte a settimana fino al termine dell&#39;esperimento. Aumentare la frequenza fino a ogni altro giorno quando i tumori diventano visibili per verificare animali sotto notevole massa tumorale o costrizione. Morte prematura da questo modello è dovuto alla grande massa tumorale primaria, come tumori primari possono bloccare il flusso urinario, quindi eventuali animali con una perdita superiore al 15% del peso corporeo o un tumore primario raggiungendo un diametro di 1,5 cm dovrebbe essere necroscopia immediatamente prevenire l&#39;ostruzione delle vie urinarie e la morte degli animali. </li><li> Controllo per necessità di ulteriore arricchimento dell&#39;ambiente animale. Lo stress della chirurgia aumenta lotte degli animali. L&#39;aggiunta di due rifugi plastica per gabbia invece di uno e comportamento aggiuntivoAl arricchimento può ridurre questi incidenti. Discutere con le opzioni del personale veterinario disponibili presso la struttura gli animali sono ospitati a. Data la mancanza di ciglia su questo ceppo di topi, capanne e arricchimento fatto di carta non sono raccomandati in quanto possono irritare gli occhi. </li></ol> 4. Procedure necroscopici <ol><li> Dopo 4-6 settimane, i tumori sono del tutto evidenti e gli animali cominciano a perdere peso a causa di una maggiore massa tumorale. I tumori in genere può palpazione e / o sono visivamente evidenti. Necroscopico deve essere eseguita a questo punto. Eseguire un&#39;iniezione intraperitoneale di Nembutal a 260 mg / kg di peso corporeo utilizzando un ago calibro 30 ½ attaccato ad una siringa da 1 ml, e permettono gli animali di diventare completamente incosciente, senza riflessi punta o il tono muscolare presente. </li><li> Una volta che l&#39;animale è anestetizzato, usando forbici chirurgiche sterili o un bisturi, tagliare orizzontalmente attraverso il torso dell&#39;animale direttamente sotto la gabbia toracica, poi verticalmente per l&#39;ascella lungo il lato dell&#39;animale, Esporre il cuore. Eseguire una puntura cardiaca terminale usando un ago 30 G ½ attaccato ad una siringa da 1 ml lavata con 4% di citrato di sodio in DPBS per prevenire la coagulazione, ottenendo come molto sangue possibile dall&#39;animale. </li><li> Rimuovere i polmoni dall&#39;animale tagliando la trachea con le forbici chirurgiche o un bisturi e collocare immediatamente in una cassetta di coltura tissutale e in 10% formalina. </li><li> Rimuovere il tumore prostatico primario dall&#39;animale tagliando singolarmente eventuali vasi sanguigni collegati al tumore e non accertando organi aggiuntivi come vasi deferenti o vescicole seminali sono allegati. </li><li> Registrare il peso e le dimensioni del tumore. Misurare il peso del tumore in grammi su scala di laboratorio. Utilizzando pinze, misurare la lunghezza del diametro maggiore del tumore in centimetri, e il corrispondente asse perpendicolare. Moltiplicare questi valori per ottenere le dimensioni del tumore. A seconda dell&#39;utilizzo previsto, immediatamente scattare congelare in azoto liquido, e / o posto inad una cassetta tessuto in formalina al 10%. </li><li> Esporre le articolazioni dell&#39;anca e del ginocchio con le forbici chirurgiche o un bisturi, e articolazioni delle gambe disconnessione, facendo attenzione a mantenere intatto il femore. Rimuovere i femori dall&#39;animale e riporre in soluzione salina sterile. </li><li> Ottenere tutti gli altri organi o materiali di interesse, e smaltire animali secondo le istruzioni del vostro Istituto. In particolare, linfonodi regionali tendono ad avere metastasi, tendono ad essere ampliata se li nutrire, e possono essere raccolte. Tuttavia, occorre prestare attenzione in quanto questo può essere influenzata da cambiamenti della pressione idrostatica causati dalla procedura chirurgica. </li></ol> 5. Lavorazione e Immunostaining di tessuto polmonare Campioni <ol><li> Entro 24-48 ore di mettere il tessuto in formalina al 10% in PBS, incorporare i polmoni in paraffina. </li><li> Sezione polmoni a 45 sezioni micron passo, tenendo 2-3 adiacenti 4 micron sezioni di tessuto polmonare. </li><li> Se sono stati utilizzati cellule GFP-positive (consigliato), eseguire immunostainingper GFP. In caso contrario, eseguire ematossilina standard ed eosina (H &amp; E) colorazione. </li></ol> NOTA: Il kit Dako Envision + in combinazione con l&#39;anticorpo GFP da Invitrogen è stato utilizzato con successo in base alle istruzioni del produttore, ma questo può essere modificato per qualsiasi procedura immunoistochimica. <ol start="4"><li> Punteggio metastasi in cieco. Se GFP-positive, le cellule tumorali si macchia marrone oltre ad avere nuclei caratteristici grandi. Quando prima metastasi segnare, consultare un patologo per assicurare il corretto punteggio, e usare H &amp; E macchiato tessuto polmonare per confermare la presenza di cellule tumorali, e non infiltrante cellule immunitarie. </li></ol> 6. Identificazione delle cellule tumorali circolanti da sangue e midollo osseo <ol><li> Aggiungere tutto il sangue raccolto dal necroscopia in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Centrifugare 5 min a 800 x g. </li><li> Rimuovere il plasma e aggiungere 1 ml di ACK Lysis Buffer (154,95 mM cloruro di ammonio, 9.99 mM di potassio Bicarbonate, 0,0995 mM EDTA,). Lasciare che il sangue per riposare a temperatura ambiente 3-5 min. </li><li> Centrifugare 5 min a 800 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di coltura cellulare supporti contenenti antibiotici. Aggiungere cellule in un pallone T75 contenente 9 ml di coltura delle cellule. </li><li> Cellule di coltura a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 per 10 giorni, controllando la presenza di CTC ogni 2-3 giorni. </li><li> Per midollo osseo, rimuovere tutto il tessuto muscolare da femori utilizzando un paio di forbici, una lama di rasoio, o bisturi. Rimuovere le estremità delle ossa, più vicino alle estremità più possibile. </li><li> Utilizzando un ago 23 G ¾, estrarre delicatamente il midollo osseo dal femore in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. </li><li> Aggiungi a 1 ml di terreni di coltura cellulare e pipettare delicatamente bene per amalgamare. </li><li> Aggiungere cellule in un pallone T75 contenente 9 ml di coltura delle cellule. </li></ol> 7. Caratterizzazione molecolare dei tumori <ol><li> Per reazione a catena della polimerasi (PCR)s, campioni di tumore che erano scatto congelati in azoto liquido sono prima polverizzati in ghiaccio secco e poi omogeneizzate utilizzando un omogeneizzatore tessuto per 3-5 min con 1 ml TRIzol. TRIzol estrazione è effettuata secondo le istruzioni del produttore. Purificare RNA utilizzando il kit di isolamento RNeasy RNA secondo le istruzioni del produttore. Esecuzione di sintesi del DNA e real time PCR quantitativa (qRT / PCR) utilizzando reagenti TaqMan secondo le istruzioni del produttore è consigliato, ma può essere modificato per qualsiasi metodo PCR attualmente impiegato. </li><li> Per i saggi di Western blot, omogeneizzare tessuti utilizzando un omogeneizzatore tessuto per 3-5 min con 1 ml di tampone di lisi: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na fosfato, 2,7 mM KCl), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, pirofosfato di sodio 2,5 mM, 1 mM β-glicerofosfato, con aggiunta di cocktail di inibitori delle proteasi, inibitori fosfato cocktail 2 e 3, fluoruro di sodio 10 mM e 1 mM sodio ortovanadato. La miscela lisato cellulare viene posto in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. </li><li> Centrifuge miscela lisato cellulare per 10 minuti a 13.000 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e posto in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml e centrifugato nuovamente per 10 minuti a 13.000 x g. Se detriti cellulari è ancora presente, una fase di centrifugazione aggiuntivo può essere eseguita. </li><li> Rimuovere il surnatante ed eseguire un Western blot secondo normali condizioni di laboratorio. </li></ol>

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	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics.">Global cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 61, 69-90 (2011).</li><li>Shappell, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+pathology+of+genetically+engineered+mice:+definitions+and+classification.+The+consensus+report+from+the+Bar+Harbor+meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancer+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Res. 64, 2270-2305 (2004).</li><li>Rangarajan, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion:+Comparative+biology+of+mouse+versus+human+cells:+modelling+human+cancer+in+mice.">Opinion: Comparative biology of mouse versus human cells: modelling human cancer in mice.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 952-959 (2003).</li><li>Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lobund-Wistar+rat+model+of+prostate+cancer+in+man.">Lobund-Wistar rat model of prostate cancer in man.</a> Prostate. 37, 1-4 (1998).</li><li>Gingrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen-independent+prostate+cancer+progression+in+the+TRAMP+model.">Androgen-independent prostate cancer progression in the TRAMP model.</a> Cancer Res. 57, 4687-4691 (1997).</li><li>Gingrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+prostate+cancer+in+a+transgenic+mouse.">Metastatic prostate cancer in a transgenic mouse.</a> Cancer Res. 56, 4096-4102 (1996).</li><li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+orthotopic+bone+metastasis+model+of+human+prostate+cancer.">A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer.</a> Cancer Res. 59, 781-786 (1999).</li><li>Wu, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+human+prostate+cancer+cell+xenografts+in+bone:+induction+of+osteoblastic+reaction+by+prostate-specific+antigen-producing+tumors+in+athymic+and+SCID/bg+mice+using+LNCaP+and+lineage-derived+metastatic+sublines.">Establishing human prostate cancer cell xenografts in bone: induction of osteoblastic reaction by prostate-specific antigen-producing tumors in athymic and SCID/bg mice using LNCaP and lineage-derived metastatic sublines.</a> Int. J. Cancer. 77, 887-894 (1998).</li><li>Dolman, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+human+prostate+carcinoma+metastases+in+severe+combined+immunodeficient+mice+by+interleukin+2+immunocytokine+therapy.">Suppression of human prostate carcinoma metastases in severe combined immunodeficient mice by interleukin 2 immunocytokine therapy.</a> Clin. Cancer Res. 4, 2551-2557 (1998).</li><li>Lakshman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+genistein+inhibits+metastasis+of+human+prostate+cancer+in+mice.">Dietary genistein inhibits metastasis of human prostate cancer in mice.</a> Cancer Res. 68, 2024-2032 (2008).</li><li>Messina, M. J., Persky, V., Setchell, K. D., Barnes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soy+intake+and+cancer+risk:+a+review+of+the+in+vitro+and+in+vivo+data.">Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data.</a> Nutr. Cancer. 21, 113-131 (1080).</li><li>Adlercreutz, H., Markkanen, H., Watanabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+concentrations+of+phyto-oestrogens+in+Japanese+men.">Plasma concentrations of phyto-oestrogens in Japanese men.</a> Lancet. 342, 1209-1210 (1993).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEK4+function,+genistein+treatment,+and+invasion+of+human+prostate+cancer+cells.">MEK4 function, genistein treatment, and invasion of human prostate cancer cells.</a> J. Natl. Cancer Inst. 101, 1141-1155 (2009).</li><li>Lakshman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+suppresses+human+prostate+cancer+metastasis.">Endoglin suppresses human prostate cancer metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 28, 39-53 (2011).</li><li>Craft, C. S., Romero, D., Vary, C. P., Bergan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+inhibits+prostate+cancer+motility+via+activation+of+the+ALK2-Smad1+pathway.">Endoglin inhibits prostate cancer motility via activation of the ALK2-Smad1 pathway.</a> Oncogene. 26, 7240-7250 (2007).</li><li>Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescent+imaging+of+mammary+tumors+using+IVIS+spectrum.">In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum.</a> J. Vis. Exp. , e1210 (2009).</li><li>Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+therapeutic+treatments+in+an+orthotopic+mouse+model+of+ovarian+cancer.">In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer.</a> J. Vis. Exp. , e2125 (2010).</li><li>Buijs, J. T., vander Pluijm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteotropic+cancers:+from+primary+tumor+to+bone.">Osteotropic cancers: from primary tumor to bone.</a> Cancer Lett. 273, 177-193 (2009).</li><li>Rubin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+("warm")+autopsy+study+for+procurement+of+metastatic+prostate+cancer.">Rapid ("warm") autopsy study for procurement of metastatic prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 6, 1038-1045 (2000).</li><li>Singh, A. S., Figg, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+prostate+cancer+metastasis+to+bone.">In vivo models of prostate cancer metastasis to bone.</a> J. Urol. 174, 820-826 (2005).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In questo lavoro forniamo un modello murino romanzo di metastasi PCa umano. In questo modello, l&#39;APC linee cellulari PC3-M umana è ortotopicamente impiantato direttamente nella prostata di Balb / c topi atimici e tumori permesso di sviluppare per 4-6 settimane. Nella sezione risultati rappresentativi, mostriamo esempi di dati che possono essere raccolti, tra cui il peso del mouse e consumo di cibo, dimensioni del tumore e peso, caratteristiche molecolari del tumore, e la formazione di metastasi distinto al polmone. Inoltre, una grande varietà di uscite supplementari può essere studiata a seconda dei particolari interessi di ricerca. Un esempio è la presenza di CTC al sangue e del midollo osseo. Come CTC sono un evento relativamente raro (si osserva CTC in circa il 5-20% degli animali di controllo), non siamo stati sorpresi che nessuno dei cinque topi in questi esperimenti sviluppato CTC. Il nostro laboratorio ha usato questo modello per determinare i cambiamenti di adesione cellulare misurando la morfologia cellulare nuclearetessuto prostatico 10. Abbiamo anche utilizzato questo modello per valutare lo stato della proliferazione tumorale e apoptosi primario utilizzando Ki67 e TUNEL colorazione del tumore alla prostata 14. Oltre alla grande varietà di uscite dati ottenibili, questo modello può essere utilizzato per determinare gli effetti dei due cambiamenti nell&#39;espressione di proteine ​​e piccole molecole terapeutiche. Rispetto a molti modelli spontanei e indotti di metastasi CaP umano, c&#39;è un tempo di ritorno superiore di soli 4-6 settimane. Altri modelli con un elevato tempo di risposta, come la vena della coda o modelli ad iniezione intercardiache, hanno delle limitazioni di alcun tumore primario, quindi non ricapitolando pienamente la clinica a cascata metastatica. Nel nostro modello, le cellule tumorali devono sfuggire il sito primario di origine, entrare e sopravvivere il sistema circolatorio, e impiantare in un sito secondario. Questo fornisce ulteriori passaggi in cui un intervento terapeutico o cambiamento nell&#39;espressione di proteine ​​potrebbero fornire un effetto. Addizionalmente, la presenza del tumore primario dovrebbe consentire una facile applicazione di questo modello di nuove tecnologie di imaging come base luciferasi-IVIS 16-17. Nonostante la grande varietà di vantaggi di questo modello, ci sono anche diversi limiti da considerare. Un numero crescente di studi dimostrano l&#39;importanza del sistema immunitario nel microambiente tumorale e lo sviluppo di metastasi 18. In questo modello, grazie all&#39;utilizzo di un roditore atimici, la capacità di valutare gli effetti del sistema immunitario non è possibile. Una seconda limitazione è la mancanza di reattività androgeni in cellule PC3-M. Dopo la diagnosi iniziale dei PCA, spesso i pazienti saranno sottoposti a terapia androgenica come trattamento di prima linea. Tuttavia, i pazienti diventeranno inizieranno androgeno-resistenti e tumori a crescere di nuovo. Come le cellule PC3-M manca il recettore degli androgeni, questo modello misura solamente gli effetti del trattamento farmacologico o la modulazione di proteine ​​in post-androgeni c resistenteancer. Anche se questa è una limitazione, androgeno-sensibile PCA è attualmente ben gestibile e ha una varietà di opzioni di trattamento efficace, e quindi cancro androgeno-resistenti è diventato più prominente studiato. Questo modello anche specificamente utilizza un ceppo inbred di topi, che riduce al minimo il mouse alla variabilità del mouse. Tuttavia, questo sforzo può essere particolarmente sensibile a particolari proteine ​​o piccole molecole, così la cura deve essere presa quando estrapolazione di questi dati alla clinica. Anche se questo modello fornisce una misura efficace di efficacia del farmaco in un tempo di risposta rapido di 4-6 settimane, questo non può prendere in considerazione gli effetti della droga somministrazione a lungo termine. Dopo l&#39;esposizione prolungata a molti trattamenti attualmente disponibili, i pazienti possono tornare con tumori farmaco-resistenti molti anni di post-trattamento. La rapida inversione di questa tecnica non consente efficace modellazione della capacità di un tumore di diventare resistenti ad un trattamento. Tuttavia, con modulazione di questa experiment, le cellule tumorali della prostata umana trattamento-resistenti possono essere impiantati, e l&#39;efficacia di una terapia di seconda generazione nel prevenire la crescita del tumore e la metastasi PCa possono essere modellati. Inoltre, se un gruppo cercava di studiare i cambiamenti molecolari in un tumore primario nel tempo, un modello a più lungo termine come il modello TRAMP sarà probabilmente più efficace per quegli studi. Un altro limite di questo modello è la diffusione di metastasi distinto solo ai linfonodi e polmoni degli animali. Entrambi questi siti sono siti frequenti e clinicamente rilevanti di metastasi, come dimostrato da calde studi autoptici umani 19. Tuttavia, clinicamente metastasi ossee costituisce una caratteristica importante di CaP umano e, quindi, i modelli riassumono questo sono di interesse. Sfortunatamente, questi sono difficili da ricapitolare in un modello di topo, con pochi modelli mostrano metastasi ossea senza vena caudale, iniezione intercardial, o impianto diretto inall&#39;osso 20. Pertanto, se il targeting per l&#39;osso è di fondamentale importanza sperimentale, un altro modello potrebbe essere più efficace. Tuttavia, questo modello non fornisce una certa misura di traffico all&#39;osso in forma di midollo osseo cellule tumorali circolanti. Nonostante questi limiti, questa tecnica è un potente modello di PCa umano. La possibilità di misurare gli effetti sia sul tumore primario, così come la formazione di metastasi in un tempo di risposta breve offre una vasta gamma di applicazioni. In questo modello, le cellule devono sfuggire l&#39;organo primario, entrare e sopravvivere nel sangue, e l&#39;impianto in un sito secondario, ricapitolando il processo negli esseri umani. La misurazione supplementare caratteristiche molecolari del tumore primario, cambia in morfologia cellulare, e la presenza di cellule tumorali circolanti fornisce un&#39;ampia soffio di informazioni da un modello. Questa procedura può essere utilizzato sia nel contesto della scoperta della droga nonché per studiare variazioni di biologia tumorale.

Il cancro della prostata (PCA) è il tumore più comunemente diagnosticato negli uomini e la seconda causa di morte per cancro negli Stati Uniti 1. La morte per PCa non è dovuto alla formazione del tumore primario, ma piuttosto la formazione di metastasi. Pertanto, la prevenzione di metastasi nei pazienti è di grande importanza. Modelli murini di PCa offrono una varietà di opzioni per scoprire informazioni biologiche critiche su questa malattia. Una varietà di modelli murini di PCa esiste, ognuno con vantaggi intrinseci e limitazioni. Mentre la frequenza dei PCA nell&#39;uomo è elevata, naturale PCA è estremamente raro nei topi 2, nonostante uguale suscettibilità dei topi globale al cancro 3. Un&#39;eccezione roditore è lo sviluppo di PCa nei ratti Lobund Wistar, che può raggiungere tassi di PCa del 90% in 12 mesi di età mediante induzione di methylnitrosourea e testosterone 4. Per questo motivo, indotta sistemi modello, come il TRAMP(Adenocarcinoma transgenico della prostata mouse) modello sono comunemente usati. Il modello TRAMP può indurre l&#39;espressione del transgene in particolare nella prostata, e subisce la normale progressione del CaP, da iperplasia di neoplasia prostatica intraepiteliale (PIN) a linfatica e metastasi polmonari 5-6. Questi modelli forniscono i vantaggi di essere in grado di misurare l&#39;intera gamma di progressione del tumore, nonché contenere un sistema immunitario intatto. Tuttavia, gli eventi molecolari alla base dello sviluppo PCa possono differire tra i topi e gli esseri umani, e le correlazioni tra i topi e gli studi clinici sull&#39;uomo hanno dimostrato variabilità. Inoltre, entrambi questi modelli sono in termini di tempo, ad esempio il modello TRAMP richiede circa 28 settimane al fine di sviluppare metastasi. Nello studio metastasi, è usato frequentemente un ventricolo modello iniezione coda vena o di sinistra. Questo modello beneficia di tempi di risposta rapido, e può inoltre misurare la presenza di metastas osseeè utilizzando linee e le condizioni di cellule specifiche. Yang et al. Hanno riferito che l&#39;iniezione sottocutanea di cellule PC3 GFP-positive può causare ampiamente diffuse metastasi ossee 7, e la vena della coda e le iniezioni intercardiache hanno generato anche lo sviluppo di metastasi ossea 8-9. I principali limiti di questi modelli sono legati alla mancanza di un tumore primario che risiede all&#39;interno della prostata stessa. Inoltre, per i modelli legato alla iniezione delle cellule tumorali in circolo, questa bypassa tutta la prima metà della cascata metastatica. Si esclude così l&#39;esame di misure iniziali, tra cui l&#39;invasione attraverso l&#39;organo primario, che sono biologicamente misure cruciali della trasformazione metastatico. Molti regolatori di trasformazione metastatico influenzano direttamente l&#39;invasione delle cellule presto. Gli esordi nella cascata metastatica costituiscono siti di alta priorità per il targeting terapeutico, come una volta le cellule tumorali diffondere, variazione clonale espande notevolmente, aumentando in tal modo biologicodiversità e diminuendo al efficace il targeting terapeutico. Nel tentativo di rispondere a molte delle limitazioni di questi modelli, il nostro laboratorio ha sviluppato un modello ortotopico di CaP umano in cui la linea cellulare CaP PC3-M umana è direttamente impiantato nella prostata di Balb / c topi atimici. Dopo 4-6 settimane, le dimensioni del tumore, presenza di cellule tumorali circolanti (CTC), e metastasi ai polmoni e linfonodi possono essere quantificati. Abbiamo effettivamente utilizzato questo modello per valutare l&#39;efficacia di 4 &#39;,5,7-trihydroxyisoflavone (genisteina) per inibire le metastasi PCa umano 10. Il consumo alimentare di genisteina è stato collegato alla diminuzione della prostata metastasi del cancro e la morte 11-12, ma in precedenza nessuno studio aveva determinato se somministrazione di genisteina potrebbe alterare PCa metastasi negli animali o uomini. In questo studio abbiamo dimostrato che il trattamento con genisteina notevolmente ridotto il numero di metastasi polmonari. Inoltre, abbiamo determinato la genisteina alseriti nella attivazione e l&#39;espressione di alcuni importanti proteine ​​pro-metastatici del tumore primario, incluse chinasi focale aderenza (FAK), p38 mitogeno-activated protein chinasi (p38 MAPK), e shock termico proteina 27 (HSP27). Questi risultati corrispondevano osservazioni nella clinica. Utilizzo di sangue ottenuto da topi, siamo stati in grado di misurare con precisione le concentrazioni nel sangue di genisteina e osservato che questi siano simili ai livelli in esseri umani con il consumo alimentare regolare di genisteina. Inoltre, uno studio di fase II effettuato dal nostro gruppo determinato che in seguito al trattamento con genisteina, uomini diminuzioni incontrate nel tessuto prostatico espressione mRNA di geni associati con invasione e metastasi cellulare, specificamente metalloproteinasi della matrice di tipo 2 (MMP-2) 13. Abbiamo usato questo modello per valutare l&#39;effetto di alterata espressione genica sottoprodotto nel tumore primario PCA metastasi umano 14. Il suppr tumoreESSOR endoglin è un membro della superfamiglia TGF e sopprime invasione cellulare umana PCa in vitro mediante l&#39;alterazione delle Smad segnalazione 15. Abbiamo esteso questi studi per determinare l&#39;effetto di endoglin sulla metastasi PCa umano. Stabile knockdown endoglin, controllo vettoriale o endoglin su linee cellulari di espressione sono stati impiantati in topi. Cellule knockdown endoglin mostravano il maggior numero di metastasi polmonari, nonché CTC nel 38% dei topi. I topi impiantati con controllo vettoriale mostrato risposta medio, con meno metastasi polmonari per topo, e CTC in solo il 18% dei topi. Topi alta endoglin impiantati hanno mostrato quasi completa soppressione di metastasi polmonari, e completa soppressione della CTC. Questi sono solo due esempi della grande varietà di applicazioni di questa tecnica ha. Dalla scoperta della droga, ai cambiamenti di modellazione in biologia molecolare, questo modello offre un metodo ad alto rendimento di valutare gli effetti delle varie funzioni sulla crescita del tumore e la talpamodifiche lari, presenza di CTC, e la formazione di metastasi distinto nei nodi polmone e linfonodi.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>309659</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 G 3/4 Precison Glide Needle</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>305143</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30 G 1/2 Precision Glide Needle</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Wipes</td>
 <td>Triad</td>
 <td>10-3001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>427630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clips, 9mm</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15431-673</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Convertors Polyline Towel (Sterile)</td>
 <td>Cardinal Health</td>
 <td>3520</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>23-400-125</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curad Sterile Cotton Balls</td>
 <td>VWR</td>
 <td>500043-544</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4")</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95039-192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves</td>
 <td>Cardinal Health</td>
 <td>2D72PN70</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Germinator 500</td>
 <td>Cell Point Scientific</td>
 <td>SN 7030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle</td>
 <td>Tyco</td>
 <td>1180528012</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medium Heating Pad </td>
 <td>VWR</td>
 <td>100229-094</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2")</td>
 <td>VWR</td>
 <td>94000-000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metric/English Vernier Caliper</td>
 <td>VWR</td>
 <td>19155-057</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27"</td>
 <td>Ethicon</td>
 <td>Z304H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VetEquip Inhalation Anesthesia System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Contact Your Animal Facility for Availability</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VWR Premium Tissue Cassettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>18000-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2")</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Betadine Surgical Scrub</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Buprenex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Controlled Substance - Obtain from Animal Facility</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dako DAB + Chromagen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K3468</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dako Envision Kit Protein Block</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0909</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95042-908</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Mayer</td>
			<td>MH580-2.5L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Meloxican</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtain from Animal Facility</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nembutal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Controlled Substance - Obtain from Animal Facility</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rneasy RNA Isolation Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtain from Animal Facility</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Taqman Reverse Transcription Reagents</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N8080234</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

an orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis

Il nostro laboratorio ha sviluppato un nuovo modello di impianto ortotopico di carcinoma della prostata umana (PCA). Come morte CaP non è dovuto al tumore primario, ma piuttosto la formazione di metastasi distinta, la possibilità di modellare efficacemente questa progressione pre-clinico è di alto valore. In questo modello, le cellule sono direttamente impiantati nel lobo ventrale della prostata in Balb / c topi atimici, e possano progredire per 4-6 settimane. Alla cessazione esperimento, diversi endpoint distinti possono essere misurati, come la dimensione e la caratterizzazione molecolare del tumore primario, la presenza e la quantificazione di cellule tumorali circolanti nel sangue e midollo osseo, e la formazione di metastasi polmonari. Oltre ad una varietà di endpoint, questo modello fornisce un quadro di una capacità delle cellule di invadere e sfuggire l&#39;organo primario, entrare e sopravvivere nel sistema circolatorio, e impianto e crescere in un sito secondario. Questo modello è stato utilizzato per misurare efficacemente metastaticorisposta a cambiamenti nell&#39;espressione proteica e alla risposta a piccole molecole terapeutiche, in un breve tempo complessivo.

Per questo esperimento, vi mostriamo un gruppo rappresentativo di topi ottenuti durante queste procedure chirurgiche. Cinque topi sono stati impiantati con le cellule PC3-M GFP-positive contenenti un vettore di controllo. I tumori sono stati permesso di crescere per sei settimane, e quindi più parametri sono stati valutati. Nelle figure 1A e 1B, mostriamo il cambiamento del peso corporeo e del consumo di cibo di topi, rispettivamente. C&#39;è un piccolo tuffo del peso corporeo e del consumo di cibo intorno alla data di intervento chirurgico a causa dell&#39;anestesia. Nel corso dell&#39;esperimento, il peso corporeo aumenta lentamente post-operatorio, e poi inizia a diminuire verso la fine dell&#39;esperimento come carico tumorale raggiunge un livello critico. Questo è compensato dal consumo di cibo in questi topi. Nelle figure 2A e 2B, sono mostrate le dimensioni del tumore rappresentativi ottenuti. Le dimensioni del tumore individuali variano, ma in media si raggiungono i tumori di circa 1 grammo, convarianza normale tra 0,5-1,5 g, e una dimensione di tumore di 1 cm 2, con un normale varianza di 0,5-1,5 cm 2. Anche se la dimensione dei tumori varia, queste non correlano con il numero di metastasi risultante, mostrato sia in questo documento e le nostre opere precedentemente pubblicati 10. Tuttavia, da questo modello, si può determinare l&#39;effetto del trattamento farmacologico o cambiamenti molecolari sul peso e le dimensioni del tumore. Una considerazione importante in questo modello è quando l&#39;endpoint appropriato per l&#39;esperimento. Nelle figure 2C e 2D, mostriamo variazioni di peso del tumore e le dimensioni del tumore in una determinata linea cellulare PC3-M stabilmente trasfettate con GFP e un vettore di controllo a 4 settimane ea 6 settimane. Nelle ultime due settimane, il peso medio del tumore è aumentato 2.7 volte, e le dimensioni del tumore 1.9 volte. Questo mostra l&#39;aggiunta di 1-2 settimane supplementari sul esperimento può influenzare notevolmente i risultati. Come una moltitudine di fattori può alterare la crescita dei tumori, compresil&#39;età e le dimensioni dei topi, numero di passaggi delle cellule, ecc non raccomandare la chiusura esperimenti fino tumori visibili sono osservati nella maggior parte dei topi. Nelle figure 3A-3C, il numero di metastasi è quantificato tre modi diversi. Nella Figura 3A, il numero totale di cellule umane prostatico GFP-positive sono rappresentati. Nella Figura 3B, viene visualizzato il numero di loci cellulare, o luoghi in cui sono presenti depositi metastatici. Infine, in Figura 3C, come definito da un gruppo chiaramente vincolato di cellule mostrando 5 o più celle prostatico umano GFP-positive, viene visualizzato il numero di metastasi distinto. Quadri rappresentativi di tali diverse condizioni sono mostrate nelle Figure 4A-4D. In Figura 4A, una singola cella a 40x grandezza è evidenziato con una freccia. Notare la colorazione marrone e grandi nuclei distinti. Una sezione del polmone adiacente colorati con colorazione H &amp; Eè mostrato in Figura 4B, confermando che senza GFP, il rilevamento delle cellule tumorali è ancora facilmente realizzabile. Questa foto è scattata a 40x grandezza e la cellula viene evidenziato con una freccia. Nella Figura 4C, diversi loci di varia numero di cellule a 10x magnitudine vengono visualizzati e ogni locus evidenziato con una freccia. . Infine, nella Figura 4D, mostra il deposito metastatico di 10 celle. Come questi metodi influenzano il dato viene mostrato dalle differenze mouse 1 e 3 del mouse. Mouse 1 ha un minor numero di cellule totali nel polmone, con una media di 21,5 cellule per sezione polmone, rispetto al mouse 3 che ha una media di 700 cellule per sezione polmone. Tuttavia, mouse 3 ha meno loci, o luoghi in cui sono presenti più mouse 1 cellule. 3 del mouse ha relativamente pochi siti di metastasi, ma il numero di cellule per zona è molto elevata a 82 cellule per loci dovuto a diversi molto grandi metastasi numero cellulare. Al contrario, mouse 1 ha loci unica più, ma significativamente fcellule ewer per posizione a solo una media di due celle per ogni posizione. Questi parametri diversi possono far luce sulla cinetica delle cellule traffico al polmone e la loro capacità di cominciare a crescere e proliferare. Inoltre, nella figura 3D, mostriamo cambiamenti in totale cellule metastatiche al polmone nei topi sottoposti a necroscopia a quattro contro sei settimane. Come descritto nelle figure 2C e 2D, cambiamenti significativi si osservano nel peso e le dimensioni del tumore nelle ultime due settimane di un esperimento. Questo è ricapitolato in Figura 3D. I topi sottoposti a necroscopia a quattro settimane non hanno mostrato lo sviluppo metastatico, mentre i topi a 6 settimane hanno evidenziato cellule metastatiche in tutti i topi valutati. Ciò dimostra ulteriormente l&#39;importanza di garantire autopsie topi vengono eseguiti a un endpoint ritardo-fase per garantire sia verificato formazione di metastasi. Una misura aggiunto in questo modello è i cambiamenti molecolari che si verificano all&#39;interno della<html> tumore primario. Nelle figure 5A-5C mostriamo tre esempi qRT / PCR esperimenti misurazione di tre geni di interesse in progressione metastatica, metalloproteinasi della matrice di tipo 2 (MMP-2), tipo metalloproteinasi 9 (MMP-9), e calore shock protein 27 (HSP27) rispettivamente. Ogni gene di interesse misurata tramite qRT / PCR può essere rilevato utilizzando questa tecnica. Inoltre, i livelli di proteina può essere quantificata mediante procedure Western Blot. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig1.jpg" /> Figura 1. Peso corporeo osservato e consumo di cibo negli animali. AB) Peso corporeo in grammi, o il consumo medio di cibo per topo al giorno in grammi, viene registrato tutto l&#39;esperimento e mostrato in A) e B), rispettivamente. fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Dimensioni del tumore e peso del tumore nei gruppi di topi individuali e. AB) Tumor peso in grammi e dimensione in centimetri quadrati di cinque topi di controllo rappresentativi e la media dei cinque topi al termine di sei settimane sono presenti in A) e B) rispettivamente. CD) Un confronto tra peso del tumore in grammi e dimensioni del tumore in centimetri quadrati tra gruppi di topi sottoposti a necroscopia a quattro e sei settimane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50873/50873fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50873/50873fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig3.jpg" /> Figura 3. Diffusione metastatica nei singoli e gruppi di topi. AC) Sprea media metastaticod per sezione polmone per cinque topi individuali e la media dei cinque topi al termine di sei settimane rappresentati sia come numero totale di cellule (A), riprese di cellule metastatiche (B), o metastasi distinto come definito da 5 + in cellule un cluster ben definito (C). D) Un confronto tra il numero medio di cellule metastatiche per sezione polmone per mouse tra i topi sottoposti a necroscopia a quattro e sei settimane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50873/50873fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50873/50873fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig4.jpg" /> Figura 4. Immagini rappresentative della metastasi polmonari. A) Una cellula polmonare individuo GFP positive a 40X obiettivo è evidenziato con una freccia. B) Un polmone adiacentesezione dalla A), che mostra la stessa cella in colorazione H &amp; E. C) Una sezione del polmone a 10 volte più oggettivo con sette loci individuale contenente un numero variabile di cellule. D) Una metastasi distinti in 10X obiettivo contenente 10 cellule tumorali chiaramente definiti come un gruppo. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50873/50873fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig5.jpg" /> Figura 5. Analisi PCR di tre geni metastatici di interesse. QRT / PCR è stata eseguita su campioni tumorali singole raccolti da topi a sei settimane. Livelli relativi di mRNA trascrizione di MMP-2 (A), MMP-9 (B), e HSP27 (C) sono misurati, normalizzato a GAPDH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50873/50873fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Questo modello ortotopico di carcinoma della prostata umana consente per la quantificazione della dimensione del tumore, cellule tumorali circolanti, e la formazione di metastasi distinto al polmone. Come le cellule devono sfuggire l&#39;organo primario, immettere il flusso sanguigno, e impiantare in un sito secondario, questo modello riassume efficacemente lo scenario in esseri umani.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

an-orthotopic-murine-model-of-human-prostate-cancer-metastasis

Research

JoVE Journal

Medicine

34.8K Views.  Northwestern University.  Questo modello ortotopico di carcinoma della prostata umana consente per la quantificazione della dimensione del tumore, cellule tumorali circolanti, e la formazione di metastasi distinto al polmone. Come le cellule devono sfuggire l'organo primario, immettere il flusso sanguigno, e impiantare in un sito secondario, questo modello riassume efficacemente lo scenario in esseri umani. 