Questo lavoro è supportato dal NIH PBS (R21 AI095484). Ringraziamo core facility tetramer NHI per CD1d tetramero.

1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e reagenti <ol><li> Strumenti: Preparare i reagenti in condizioni sterili e utilizzare sotto una cappa a flusso laminare. </li><li> Preparare 1 L di terreno di coltura RPMI, aggiungere 5% di siero fetale bovino, 2,1 g di bicarbonato, 10 ml glutammato 100x, 10 mg di HEPES, 1 mg di piruvato di sodio e 10 ml di 100x penicillina / streptomicina. Nota: il terreno di coltura tissutale raccomandata, RPMI, è intercambiabile con DMEM. </li><li> Preparare soluzione al 5% di collagenasi &quot;D&quot; (5 ml di collagenasi &quot;D&quot; a 9 ml di terreno di coltura tissutale). </li><li> Preparare la soluzione di Percoll a tre diverse concentrazioni: 100%, 80% e 40%. I seguenti concentrazioni sono calcolati per 1 campione. Mantenere le soluzioni a temperatura ambiente. <ol><li> Soluzione Percoll: aggiungere 9 ml di diluito Percoll (da soluzione stock); aggiungere 1 ml di PBS 10x. </li><li> Soluzione Percoll: aggiungere 8 ml di Percoll 100%; aggiungere 2 ml di PBS 1x. </li><li> Soluzione Percoll:aggiungere 4 ml di Percoll 80%; aggiungere 4 ml di PBS 1x. </li></ol></li><li> Fare 1 L di cella fluorescenza-attivato (FACS) tampone; aggiungere 5 ml di 10% di BSA (0,1% BSA), sodio azide 1 ml 10% (0,1%), 2 agente ml EDTA, portare a 1000 ml con PBS 1x. </li></ol> 2. Preparazione del rene Digestione <ol><li> Avendo acquisito alcuna approvazione istituzionale necessario, sacrificare e exsanguinate i topi con metodi standard e seguendo le normative vigenti e le linee guida per la cura degli animali. <ol><li> Anestetizzare il mouse con pentobarbital (0,07 mg / kg). </li><li> Procedere al dissanguamento. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina su un tavolo operatorio. </li><li> Spruzzare la zona addominale con etanolo al 70%. </li></ol></li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione D collagenasi al piatto di Petri. </li><li> Rimuovere e decapsulate entrambi i reni da ogni mouse. <ol><li> Aprire la cavità abdomimal facendo un&#39;incisione mediana attraverso la pelle addominale e del peritoneo dallo sternoil pube. </li><li> Esporre il rene sinistro spostando l&#39;intestino lateralmente al lato. </li><li> Separare con cautela la capsula sinistra con le pinze. Nota: La capsula appare come uno strato trasparente che circonda il rene e parzialmente coperta da tessuto adiposo perirenale. </li><li> Rimuovere il rene sinistro tagliando le navi peduncolo con una forbice chirurgica. </li><li> Ripetere la stessa procedura per il rene destro. Nota: Il rene destro è più craniale e più vicino alla linea mediana (pedicelli sono più corti). </li></ol></li><li> Posizionare il rene nel piatto di Petri. </li><li> Tagliare il tessuto renale in piccoli pezzi (1-2 mm di dimensione) utilizzando una normale lama formatura dei metalli e disporre i pezzi nella soluzione di collagenasi per 30-45 min in incubatore a 37 ° C (Figura 1). </li></ol> 3. Preparazione di cellule mononucleate del rene (KMNC) dalla digestione rene <ol><li> Ottenere una sospensione di cellule di renedigestione interrompendo meccanicamente il tessuto utilizzando un filtro (70 micron) e risospendere in 25 ml di terreno di coltura tissutale e mescolare. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare la sospensione cellulare. </li><li> Risospendere il pellet in 4 ml di 40% soluzione di Percoll e delicatamente sovrapporre su 4 ml di 80% soluzione di Percoll con una pipetta di plastica trasferimento, molto lentamente e con attenzione. Questo comporta due fasi nettamente separate da uno strato traslucido. Sulla parte superiore sarà uno strato giallo corrispondente ai lipidi. </li><li> Centrifugare a 1500 xg per 30 min a temperatura ambiente con la centrifuga in modalità off freno. </li><li> Rimuovere con aspirazione lo strato superiore di colore giallo e denso (circa 1-2 ml). </li><li> Raccogliere solo il leggero strato biancastro traslucido dall&#39;interfaccia delle due fasi con una pipetta di trasferimento. Trasferire molta attenzione questa sospensione in una provetta conica da 15 ml contenente 2 ml di terreno di coltura tissutale e quindi aggiungere 13 ml di terreno per fare un volume totale di15 ml. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere i campioni in 1 ml del mezzo. </li><li> Contare il numero di KMNC utilizzando trypan blu su un emocitometro ed esprimere i risultati come numero di KMNC per ml al rene. </li><li> Risciacquare una volta come sopra. </li></ol> 4. Isolamento del emopoietiche (CD45 +) Celle dal KMNC (Fase I) <ol><li> Risospendere le cellule fino a 10 7 in 90 ml di tampone di corsa. </li><li> Aggiungere 10 ml di microsfere CD45 e incubare per 15 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di corsa per arrestare la reazione. Centrifugare a 400 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in 500 ml di tampone di corsa. </li><li> Preparare la colonna magnetico mettendo a magnete e risciacquare con 3 ml di tampone di corsa. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna magnetica e raccogliere le cellule non marcati che passano attraverso la colonna. </li><li> Lavare le cellule tre volte con 3 ml di Running buffer. Poi raccogliere l&#39;effluente. </li><li> Rimuovere la colonna dal separatore e pipetta 5 ml di tampone di corsa sulle colonne e scovare la frazione etichettato immediatamente. Questa frazione contiene le cellule CD45 +. Contare le cellule. </li><li> Per calcolare il numero assoluto di linfociti T diversi sottoinsiemi in reni moltiplicare il numero totale di KMNC per la percentuale di cellule positive determinata mediante citometria di flusso (Figura 2). </li></ol> 5. Isolamento di DN cellule T CD45 + da Preparazione per selezione negativa (Fase II) <ol><li> Aggiungere 2,5 ml (0,5 mg / ml, 1,25 microgrammi) di ciascuno dei seguenti anticorpi biotinilati: anti-CD4 e anti-CD8, anti-recettore Fc (CD16/32), anti-MHC di classe II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetramer ogni 10 cellule ematopoietiche 7. </li><li> Incubare le cellule per 30 minuti nella camera fredda. </li><li> Aggiungere 1 ml microsfere anti-biotina. </li><li> Incubare per 30 min in una camera fredda. </li><li> Porre il tubo in tegli magnete e procedere a esaurimento. </li><li> Contare le cellule vitali per determinare il numero totale di cellule T DN nella frazione negativa utilizzando un emocitometro. </li><li> Controllare la purezza delle cellule DN T con citometria a flusso seguendo questa strategia di gating: primo cancello CD45 +, secondo cancello TCRαβ +. Escludi + cellule CD1d. Plot CD4 + CD8 + vs identificare cellule DN T (Figura 3). </li><li> Moltiplicare il numero totale per la percentuale determinata in purezza. Nota: utilizzando questo protocollo i risultati in una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression.">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li><li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li><li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression.">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li><li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells.">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li><li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice.">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li><li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells.">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li><li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25+CD4++TR+cells.">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li><li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220++double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production.">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li><li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li><li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+CD4(+)+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure.">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li><li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li><li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys.">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li><li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL/Mp-lpr/lpr+mice.">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li><li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome.">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li><li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice.">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li><li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function.">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Vi è un crescente interesse in cellule T DN poiché sono stati implicati in diverse condizioni patologiche, come disturbi autoimmuni, il cancro, la tolleranza del trapianto e malattie primarie di rene compresa insufficienza renale acuta (AKI), glomerulonefrite 8, 13. Pertanto, non vi è necessità di comprendere meglio e caratterizzare le funzioni fisiopatologiche delle cellule T DN. Tuttavia, attualmente non vi è una mancanza di comprensione della funzione di queste cellule rispetto ai CD4 e le cellule T C...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Periferico αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doppio negativo cellule (DN) T sono suddivisi in vari sottogruppi che possiedono fenotipi e funzioni 1-4 distinte. Cellule DN T sono poco conosciuti, ma sempre più spesso coinvolti nelle risposte immunitarie fisiopatologiche in differenti modelli di malattia 4-6. Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è sempre più coinvolto nella regolazione delle varie risposte immunitarie e autoimmuni e la modulazione della tolleranza allotrapianto. 4-6, 9 sono rari nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e dei linfonodi ). Tuttavia, essi sono i principali abitanti della normale rene e intestino epitelio 10-12. Molto poco si sa circa la loro funzione 7 del rene in stato stazionario e in condizioni patologiche come danno renale acuto (AKI) associata a Transpl reneant. A causa dei ruoli intricati di diverse cellule immunitarie nel regolare le risposte immunitarie, tra cui alloresponses, la definizione del ruolo di ogni giocatore è fondamentale per comprendere alloresponses e la progettazione di nuove terapie. Dato numero significativo di cellule DN T presenti nel rene in condizioni fisiologiche e diverse malattie, le cellule T DN sono suscettibili di svolgere un ruolo critico nel regolare le risposte immunitarie e autoimmuni nei topi e nell&#39;uomo, e alloresponses nei pazienti trapiantati. Accumulare se prova ancora sparse implica cellule DN T in entrambe le funzioni patogeni e immunosoppressori, ma è poco conosciuta perché e come mostrano una funzione dannoso o soppressiva specifico e come l&#39;ambiente li influenza. A causa della loro bassa abbondanza nel rene, sono necessari metodi migliorati di isolamento. Attualmente non esiste un protocollo standard per l&#39;isolamento di cellule T DN da tegli tessuti non linfoidi. Il nostro protocollo descrive un nuovo metodo per l&#39;isolamento di cellule T DN dal rene; Tuttavia, il metodo può essere utilizzata anche per vari tessuti non linfoidi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Laminar flow hood&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Baker Company, Inc</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:200px;">Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Hemocytometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:276px;">63514-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Atmosphere-controlled incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:200px;">&#160;(37&#176;C with 5% CO2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Analytical flow cytometer</td>
			<td style="width:257px;">LSR II&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:439px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:257px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Catalog&#160; Number</td>
			<td style="width:200px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:257px;">Media Tech</td>
			<td style="width:276px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:257px;">Roche</td>
			<td style="width:276px;">11088858001</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Percoll&#160;</td>
			<td style="width:257px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:276px;">&#160;17-0891-01</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">0.1% sodium azide (NaN3)</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:276px;">S2002</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Buffer phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:257px;">Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">PBS 10X</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">EDTA buffer&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:276px;">E1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">LS columns&#160;</td>
			<td style="width:257px;">MiltenyiBiotec</td>
			<td style="width:276px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">CD45+ microbeads</td>
			<td style="width:257px;">MiltenyiBiotec</td>
			<td style="width:276px;">6.78E-51</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Biotin microbeads&#160;</td>
			<td style="width:257px;">MiltenyiBiotec</td>
			<td style="width:276px;">130-090-485</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD45 (clone: 30-F11)&#160; PerCP&#160;</td>
			<td style="width:257px;">eBioscience&#160;</td>
			<td style="width:276px;">G1397</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD45 (clone: 30-F11)&#160; APC-Cy7</td>
			<td style="width:257px;">Biolegend&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">103116</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-TCR Pacific Blue&#160; (ab-chain, clone: H57-597)</td>
			<td style="width:257px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:276px;">HM3628</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD4 PE</td>
			<td style="width:257px;">eBioscience&#160;</td>
			<td>12-0043</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD8 FITC</td>
			<td style="width:257px;">eBioscience&#160;</td>
			<td>8011-0087</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD4 biotinylated (GK1.5)</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553728</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD8 biotinylated&#160; (clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553029</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553143</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-MHC class II (I-A d) biotinylated</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553609</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD1d PBS-57 tetramer</td>
			<td style="width:257px;">NHI tetramer&#160;</td>
			<td style="width:276px;">lote # 15621-PBS57</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:439px;">AutoMACS Running Buffer-&#160; MACS Separation Buffer&#160;</td>
			<td style="width:257px;">MIlteny I Biotec</td>
			<td style="width:276px;">130-091-221</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td style="width:276px;">000664</td>
			<td>Kidneys - Lymph Nodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Petri dish&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:276px;">356517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">70mc filter&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Plunger&#160;</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneMate Tubes 50 ml</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>C-3394-3</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">GeneMate Tubes 15 ml</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td style="width:276px;">C-3394-1</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Petri Dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:276px;">S33580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Plate 24 wells&#160;</td>
			<td style="width:257px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:276px;">354723</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of double negative &#945;&#946; t cells from the kidney

Attualmente non esiste un protocollo standard per l&#39;isolamento delle cellule T DN dai tessuti non linfoidi nonostante il loro coinvolgimento sempre segnalato in varie risposte immunitarie. Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è stato implicato nella regolazione delle risposte immunitarie e la tolleranza e autoimmuni di allotrapianto 1-6. Cellule DN T sono, tuttavia, rare nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e linfonodi), ma sono i principali abitanti del rene normale. Molto poco si sa circa la loro funzione fisiopatologico 7 a causa della loro scarsità in periferia. Abbiamo recentemente descritto una vasta analisi fenotipica e funzionale di questa popolazione nel rene 8 in stato stazionario e durante ischemia riperfusione. Analisi della funzione delle cellule T DN sarà notevolmente migliorata con lo sviluppo di un protocollo per il loro isolamento dal rene. Qui, descriviamo un nuovo protocollo che consente isolation di CD8 + cellule altamente puri ab CD4 + T e le cellule T DN dal rene murino. In breve, abbiamo digerire tessuto renale con collagenasi e isolare le cellule mononucleate del rene (KMNC) dal gradiente di densità. Questo è seguito da due passaggi per arricchire cellule T ematopoietiche dal 3% al 70% dal KMNC. La prima fase consiste in una selezione positiva di cellule ematopoietiche CD45 + utilizzando un kit di isolamento. Nella seconda fase, le cellule T sono DN negativamente isolati mediante rimozione delle cellule non desiderati utilizzando CD4, CD8, e MHC di classe II anticorpi monoclonali e CD1d α-GalCer tetramero. Questa strategia porta ad una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T. Colorazione della superficie con gli anticorpi suddetti seguita mediante analisi FACS è utilizzato per confermare la purezza.

Wild type C57BL / 6 (B6) rene contiene circa 1,5-2,1 x 10 6 cellule mononucleate al rene. Circa meno del 10% sono CD45 + cellule ematopoietiche. Per la preparazione di cellule mononucleate rene (KMNC), i reni sono tagliati in piccoli pezzi, come mostrato in Figura 1 seguito da digestione con collagenasi 5%. Questo è seguito eseguendo una centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere KMNC strato (figura 2, pannello di sinistra).</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Double Negative Î±Î² T Cells from the Kidney at JoVE.com

Isolation of Double Negative &amp;#945;&amp;#946; T Cells from the Kidney

Cellule DNabT sono rari tra cellule T periferiche; tuttavia, sono abbondanti in alcuni tessuti non linfoidi. Difficoltà di isolare le cellule T DN dal tessuto linfoide non ostacola la loro analisi funzionale, nonostante l&#39;aumento riconosciuto significato fisiopatologico. Descriviamo un nuovo protocollo per l&#39;isolamento di cellule altamente purificate DN T di rene murino.

Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

12.1K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine.  Cellule DNabT sono rari tra cellule T periferiche; tuttavia, sono abbondanti in alcuni tessuti non linfoidi. Difficoltà di isolare le cellule T DN dal tessuto linfoide non ostacola la loro analisi funzionale, nonostante l'aumento riconosciuto significato fisiopatologico. Descriviamo un nuovo protocollo per l'isolamento di cellule altamente purificate DN T di rene murino. 