이 작품은 NIH PBS (R21 AI095484)에 의해 지원된다. 우리는 CD1D 량체를위한 NHI의 테트라 핵심 시설을 감사합니다.

1. 악기의 제조, 문화, 미디어 및 시약 <ol><li> 상품 : 무균 조건 하에서 시약을 준비하고 층류 후드를 사용합니다. </li><li> 소 태아 혈청의 5 %, 수소 나트륨 2.1 g, 10 ㎖ 글루타민산 100 배, HEPES 10 ㎎, 1 밀리그램의 나트륨 피루 베이트 10 ㎖를 100 배의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가, RPMI 조직 배양 배지 1 L를 준비합니다. 참고 : 권장되는 조직 배양 배지, RPMI는 DMEM에 교환 할 수있다. </li><li> 5 % 콜라게나 &quot;D&quot;솔루션 (조직 문화 매체의 10 ML에 콜라게나 &quot;D&quot;5 ㎖)을 준비합니다. </li><li> 100 %, 80 % 및 40 %의 세 가지 다른 농도에서 퍼콜 솔루션을합니다. 다음의 농도는 1 샘플에 대해 계산됩니다. 실온에서 솔루션을 유지합니다. <ol><li> 퍼콜 용액 (원액부터) 희석 퍼콜 9 ML을 추가합니다; PBS 배 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 퍼콜 솔루션 :; 퍼콜 8 ㎖를 100 % 추가 PBS 1X 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 퍼콜 솔루션 :퍼콜 80 % 4 ㎖를 추가; PBS 1X 4 ㎖를 추가합니다. </li></ol></li><li> (FACS) 버퍼를 정렬 형광 활성화 된 셀의 1 L를 확인; 5 ML 10 % BSA (0.1 % BSA), 1 ㎖의 10 % 아 지드 화 나트륨 (0.1 %), 2 ㎖ EDTA 에이전트, 1X PBS 1,000 ml로 구성을 추가합니다. </li></ol> 신장 소화의 2. 준비 <ol><li> , 필요한 기관 승인을 획득 한 표준 방법으로 쥐를 희생에게서 피를 뽑다 현재 규정 및 동물 관리 지침에 따라 한. <ol><li> 펜토 바르 비탈 (0.07 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취. </li><li> 일어난 과다 출혈로 넘어갑니다. </li><li> 수술대에 누운 위치에 마우스를 놓습니다. </li><li> 70 % 에탄올과 복부 영역 스프레이. </li></ol></li><li> 페트리 접시에 콜라게나 D 솔루션의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 제거하고 각 마우스 모두에서 신장을 디 캡슐. <ol><li> 에 흉골의 복부 피부와 복막을 통해 중간 선 절개를함으로써 abdomimal 구멍을 엽니 다치골. </li><li> 측으로 측방 부위를 이동하여 좌측 신장을 노출. </li><li> 조심스럽게 집게로 왼쪽 캡슐을 분리합니다. 참고 : 캡슐은 신장을 둘러싸고있는 투명한 층으로 나타납니다 부분적으로 perinephric 지방 조직에 의해 덮여. </li><li> 수술 가위를 사용하여 척추 경 혈관을 절단하여 왼쪽 신장을 제거합니다. </li><li> 오른쪽 신장에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 참고 : 오른쪽 신장은 더 많은 두개골과 중간 선 (작은 꽃자루가 짧다)에 더 가깝다. </li></ol></li><li> 페트리 접시에 신장을 놓습니다. </li><li> 일반 금속 형성 블레이드를 사용하여 작은 조각으로 신장 조직 (치수 1 ~ 2 mm)를 절단하고 (그림 1) 37 ° C에서 인큐베이터에서 30 ~ 45 분 동안 콜라게나 솔루션으로 조각을 배치합니다. </li></ol> 신장의 소화에서 신장 단핵 세포 (KMNC) 3. 준비 <ol><li> 신장의 세포 현탁액을 얻을기계적 조직 배양 배지 25 ㎖에 스트레이너 (70 μm의)와에 resuspend를 사용하여 혼합 조직을 방해하여 소화. </li><li> 세포 현탁액을 펠렛 4 ° C에서 10 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 아주 천천히, 조심스럽게 40 % 퍼콜 용액 4 ㎖의 펠렛을 다시 일시 중단하고 부드럽게 전달 플라스틱 피펫으로 80 % 퍼콜 용액 4 ㎖에 오버레이. 이것은 분명히 반투명 층에 의해 분리 된 두 개의 단계가 발생합니다. 상단에있는 지질에 해당하는 노란색 층이 될 것입니다. </li><li> 브레이크 오프 모드에서 원심 분리하여 실온에서 30 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리기. </li><li> 흡인에 의해 노란색 두꺼운 꼭대기 층 (약 1 ~ 2 ㎖) 제거합니다. </li><li> 전송 피펫을 가진 두 단계의 인터페이스 만 약간의 흰 반투명 레이어를 수집합니다. 아주 조심스럽게 조직 배양액 2 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 원뿔형 튜브에이 현탁액을 전송하고 총 부피를 만들기 위해 배지 13 mL를 넣고15 ML. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기 </li><li> 배지 1 ㎖에 샘플에 resuspend. </li><li> 혈구에 트리 판 블루 배제를 사용 KMNC의 수를 계산 및 신장 당 ML 당 KMNC의 숫자로 결과를 표현한다. </li><li> 한 번 상기와 같이 씻는다. </li></ol> KMNC에서 4. 조혈의 분리 (CD45의 +) 세포 (단계 I) <ol><li> 버퍼를 실행의 90 μL에 10 7 세포를 재현 탁. </li><li> CD45 마이크로 비즈의 10 μl를 추가하고 4 ℃에서 15 분 동안 품어 </li><li> 반응을 정지 실행 버퍼 1 ML을 추가합니다. 버퍼를 실행 500 μL에서 4 ° C와에 resuspend에서 10 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 자석에 배치하여 자기 열을 준비하고 버퍼를 실행의 3 ㎖로 씻어. </li><li> 자기 칼럼을 통해 세포 현탁액을 통과하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. </li><li> runn 3 ㎖의 세포를 세 번 씻으십시오버퍼를 보내고. 그런 다음 유출 물을 수집합니다. </li><li> 분리 및 피펫 열에 버퍼를 실행 5 ㎖에서 열을 제거하고 즉시 표시된 부분을 세척하십시오. 이 부분은 CD45 + 세포가 포함되어 있습니다. 세포를 계산합니다. </li><li> 신장에 다른 T 세포 아형의 절대 수를 계산하는 것은 유동 세포 계측법에 의해 결정 양성 세포의 비율 (도 2)에 의해 KMNC의 총 수를 곱한다. </li></ol> 음의 선택에 의해 CD45 + 준비에서 DN T 세포 5. 절연 (단계 II) <ol><li> 다음 비오틴 항체의 각 2.5 μL (0.5 ㎎ / ㎖, 1.25 μg) 추가 : 안티 - CD4, 항 CD8, 안티-FC 수용체 (CD16/32을), 안티 MHC 클래스 II (IA의 B), 안티 - 매 10 7 조혈 세포에 대한 CD1D PBS-57 량체. </li><li> 차가운 방에서 30 분 동안 세포를 품어. </li><li> 1 ㎖ 안티 - 비오틴 마이크로 비드를 추가합니다. </li><li> 추운 방에서 30 분 동안 품어. </li><li> t에 튜브를 놓고그는 자석과 고갈로 진행합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 음의 분획 DN T 세포의 총 수를 결정하는 생세포 횟수. </li><li> 제 1 게이트 CD45의 +, 제 2 게이트 TCRαβ +이 게이팅 전략에 따라 유동 세포 계측법과 DN T 세포의 순도를 확인합니다. CD1D + 세포를 제외합니다. CD8 + 대 플롯 CD4 +는 DN T 세포 (그림 3)를 식별합니다. </li><li> 순도 결정된 비율로 총 수를 곱한다. 참고 : 90 % 이상 순수 DN T 세포의 인구에이 프로토콜의 결과를 사용하여. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression.">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li><li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li><li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression.">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li><li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells.">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li><li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice.">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li><li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells.">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li><li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25+CD4++TR+cells.">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li><li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220++double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production.">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li><li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li><li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+CD4(+)+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure.">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li><li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li><li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys.">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li><li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL/Mp-lpr/lpr+mice.">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li><li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome.">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li><li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice.">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li><li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function.">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

그들은 같은자가 면역 질환, 암, 이식 허용, 급성 신장 손상 (AKI)을 포함하여 신장의 주요 질환과 같은 다른 병리학 적 조건에 연루되고 있기 때문에 DN T 세포에 대한 관심이 증가가, 8, 13 사구체 신염. 따라서, 더 나은 DN T 세포의 병태 생리 학적 기능을 이해 및 특성화가 필요하다. 그러나, 현재 CD4와 CD8 T 세포에 비해 이러한 세포의 기능에 대한 이해의 부족이있다. 가장 큰 이유는 차 림프 ?...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

주변 αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - 이중 부정은 (DN) T 세포는 별개의 표현형과 기능 1-4을 가지고 다양한 하위 집합으로 분할된다. DN T 세포는 제대로 이해하고 있지만 점점 다른 질병 모델 4-6의 병태 생리 학적 면역 반응에 연루된다. DN T 세포는 점점 더 다양한 면역 및자가 면역 반응의 조절과 이식 실험 관용의 변조에 연루되는 고유 한 면역 세포의 유형입니다. 4-6, 9 그들은 비장과 림프절 (말초 혈액 및 이차 림프 기관에 드문 ). 그러나, 그들은 정상 신장 및 소화관 상피 10-12의 주요 거주자. 약간은 정상 상태에서의 신장에서의 기능 7에 대해 이러한 신장 transpl과 관련된 급성 신장 손상 (AKI)과 같은 병적 인 조건에서 알려져있다개미. 이 때문에, 각 플레이어의 역할을 정의 alloresponses 포함한 면역 반응을 조절하는 다른 면역 세포의 복잡한 역할은 alloresponses 승낙 새로운 치료제를 설계하는데 중요하다. 생리적 및 다양한 질병 상태에서 신장에 존재 DN T 세포의 상당수 감안 DN T 세포는 이식 수혜자에서 중요한 마우스 및 인간 면역 및자가 면역 반응을 조절하는데 역할 및 alloresponses 재생할 가능성이있다. 아직도 흩어져있는 증거 불구하고 축적하는 것은 모두 병원성 및 면역 기능에 DN T 세포를 연루하지만, 왜, 어떻게 그들이 특정 유해하거나 억제 기능을 발휘하고 환경 영향을 그들이 어떻게 그것을 제대로 이해된다. 때문에 신장에서의 낮은 풍요, 분리의 개선 된 방법이 필요합니다. t에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 없습니다그는 비 림프 조직. 우리 프로토콜은 신장에서 DN T 세포의 분리를위한 신규 한 방법을 설명한다; 그러나, 상기 방법은 또한 다양한 비 - 림프 조직을 위해 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Laminar flow hood&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Baker Company, Inc</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:200px;">Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Hemocytometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:276px;">63514-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Atmosphere-controlled incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:200px;">&#160;(37&#176;C with 5% CO2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Analytical flow cytometer</td>
			<td style="width:257px;">LSR II&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:439px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:257px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Catalog&#160; Number</td>
			<td style="width:200px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:257px;">Media Tech</td>
			<td style="width:276px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:257px;">Roche</td>
			<td style="width:276px;">11088858001</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Percoll&#160;</td>
			<td style="width:257px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:276px;">&#160;17-0891-01</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">0.1% sodium azide (NaN3)</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:276px;">S2002</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Buffer phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:257px;">Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">PBS 10X</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">EDTA buffer&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:276px;">E1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">LS columns&#160;</td>
			<td style="width:257px;">MiltenyiBiotec</td>
			<td style="width:276px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">CD45+ microbeads</td>
			<td style="width:257px;">MiltenyiBiotec</td>
			<td style="width:276px;">6.78E-51</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Biotin microbeads&#160;</td>
			<td style="width:257px;">MiltenyiBiotec</td>
			<td style="width:276px;">130-090-485</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD45 (clone: 30-F11)&#160; PerCP&#160;</td>
			<td style="width:257px;">eBioscience&#160;</td>
			<td style="width:276px;">G1397</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD45 (clone: 30-F11)&#160; APC-Cy7</td>
			<td style="width:257px;">Biolegend&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">103116</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-TCR Pacific Blue&#160; (ab-chain, clone: H57-597)</td>
			<td style="width:257px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:276px;">HM3628</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD4 PE</td>
			<td style="width:257px;">eBioscience&#160;</td>
			<td>12-0043</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD8 FITC</td>
			<td style="width:257px;">eBioscience&#160;</td>
			<td>8011-0087</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD4 biotinylated (GK1.5)</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553728</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD8 biotinylated&#160; (clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553029</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553143</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-MHC class II (I-A d) biotinylated</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553609</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD1d PBS-57 tetramer</td>
			<td style="width:257px;">NHI tetramer&#160;</td>
			<td style="width:276px;">lote # 15621-PBS57</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:439px;">AutoMACS Running Buffer-&#160; MACS Separation Buffer&#160;</td>
			<td style="width:257px;">MIlteny I Biotec</td>
			<td style="width:276px;">130-091-221</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td style="width:276px;">000664</td>
			<td>Kidneys - Lymph Nodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Petri dish&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:276px;">356517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">70mc filter&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Plunger&#160;</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneMate Tubes 50 ml</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>C-3394-3</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">GeneMate Tubes 15 ml</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td style="width:276px;">C-3394-1</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Petri Dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:276px;">S33580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Plate 24 wells&#160;</td>
			<td style="width:257px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:276px;">354723</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of double negative &#945;&#946; t cells from the kidney

비 림프 조직에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 다양한 면역 반응에서의 점점보고 참여에도 불구하고 현재 없습니다. DN T 세포는 allotransplants 1-6로 면역 및자가 면역 반응과 내성을 조절에 연루되어 고유 한 면역 세포의 유형입니다. DN T 세포는 말초 혈액 및 이차 림프​​ 기관 (비장과 림프절)에서 드문,하지만,하지만, 정상적인 신장의 주요 거주자입니다. 아주 작은 인해 주변에서의 소수 자신의 병태 생리 학적 기능 7에 대한 알려져있다. 우리는 최근에 정상 상태 및 허혈 재관류 손상시 신장 8이 인구의 포괄적 인 표현형 및 기능 분석을 설명했다. DN T 세포 기능 분석을 크게 신장에서의 그들의 분리를위한 프로토콜을 개발함으로써 강화 될 것이다. 여기, 우리는 isolatio 수있는 새로운 프로토콜을 설명뮤린 신장으로부터 고순도 AB CD4 + CD8 + T 세포 및 DN T 세포의 N. 간단히 말해서, 우리는 콜라게나 제를 사용하여 신장 조직을 소화하고 밀도 구배에 의해 신장 단핵 세포 (KMNC)를 분리. 이것은 KMNC에서 70 %로 3 %에서 조혈 T 세포를 풍부하게하기 위해 두 단계로 이어진다. 첫 번째 단계는 CD45 + 분리 키트를 사용하여 조혈 세포의 포지티브 선택으로 구성된다. 두 번째 단계에서는, DN T 세포는 부정적인 CD4, CD8, 및 MHC 클래스 II 단일 클론 항체 및 CD1D α-galcer 량체를 사용하여 원하지 않는 세포의 제거에 의해 격리됩니다. 이 전략은 90 % 이상 순수 DN T 세포의 인구에 이르게한다. FACS 분석이어서 상기 항체 표면 염색은 순도를 확인하기 위하여 사용된다.

야생형 C57BL / 6 (B6) 신장 신장 당 약 1.5-2.1 × 10 6 단핵 세포가 포함되어 있습니다. 약 10 % 미만은 조혈 CD45 + 세포 수 있습니다. 5 % 콜라게나 제를 사용하여 분해 한 다음도 1에 나타낸 바와 같이 신장 단핵 세포 (KMNC)의 제조에 대하여, 신장이 작은 조각으로 절단된다. 이것은 KMNC 층 (도 2, 왼쪽 패널) 수집하는 밀도 구배 원심 분리를 수행...

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Isolation of Double Negative &amp;#945;&amp;#946; T Cells from the Kidney

DNabT 세포가 말초 T 세포 사이 드물다; 그러나, 그들은 특정 비 림프 조직에 풍부합니다. 비 림프 조직에서 DN T 세포를 분리의 어려움은 병태 생리 학적 중요성을 인식 증가에도 불구하고 자신의 기능 분석을 방해한다. 우리는 쥐의 신장에서 고순도 DN T 세포의 분리를 위해 새로운 프로토콜을 설명합니다.

신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

12.1K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine.  DNabT 세포가 말초 T 세포 사이 드물다; 그러나, 그들은 특정 비 림프 조직에 풍부합니다. 비 림프 조직에서 DN T 세포를 분리의 어려움은 병태 생리 학적 중요성을 인식 증가에도 불구하고 자신의 기능 분석을 방해한다. 우리는 쥐의 신장에서 고순도 DN T 세포의 분리를 위해 새로운 프로토콜을 설명합니다. 