Ringraziamo il Dott. Yves L. Janin per i suoi commenti e suggerimenti fecondi. Vorremmo ringraziare HH Gad per CHIK / Ren e C. Combredet per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Institut Pasteur, il Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), l&#39;Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), l&#39;Institut Carnot - Pasteur Maladies infectieuses (Programma STING a POV e HM- L), l&#39;Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programma STING 2.0 a POV), e il &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Biblioteca Chemical progetto, borse di studio n ° I 06-222 / R e I 09-1739 / R per HM-L.). Il lavoro sulla CHIKV / Ren è stato supportato dagli ArbOAS progetto (ANR sovvenzione 2010-INTB-1601-1602).

1. Preparazione di 96 pozzetti Piastre figlia con composti <ol><li> Spostare piastre madri a 96 pozzetti contenenti 10 mM soluzioni madre di composti chimici in DMSO da -20 ° C a temperatura ambiente. Diluire composti 5x in DMSO per ottenere piastre di diluizione a 96 pozzetti intermedi a 2 mm. Diluizione si ottiene pipettando 5 ml in 20 ml di DMSO e miscelazione. </li><li> Dispensare 1 ml di piastre di diluizione nei pozzetti secchi di bianco, coltura tissutale con codice a barre piastre da 96 pozzetti. Questa prima serie di piastre figlia (D1) viene utilizzato per valutare la tossicità dei composti ad una concentrazione finale di 20 mM. Piastre figlia Conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Diluire composti nuovamente 1:10 pipettando 4 microlitri di piastre di diluizione in 36 ml di DMSO e miscelazione. Pipettare 1 ml nei pozzi asciutti di bianco, fondo piatto, colture di tessuti con codice a barre 96-pozzetti piatti. Questo secondo insieme di piastre figlia (D2) viene utilizzato per valutare l&#39;inibizione della MV replication da composti ad una concentrazione finale di 2 mM. Piastre figlia Conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di colture cellulari per determinare Compound tossicità <ol><li> Crescere le cellule HEK-293T a 37 ° C e 5% CO 2 in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) con stabilizzato L-glutammina e supplementato con 10% siero di vitello fetale (FCS), streptomicina (100 mcg / ml) e penicillina (100 IU / ml). Le cellule sono diversi passaggi per tripsinizzazione ogni 4-5 giorni, e diluito 1:10 in un pallone fresco. Le cellule devono essere in fase di log per esperimenti. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, recuperare le cellule mediante tripsinizzazione e di eseguire il conteggio delle cellule. Cellule pellet per centrifugazione e risospendere a 3 x 10 5 cellule / ml in terreno di coltura. Si consideri che 12,5 ml di sospensione cellulare sono necessari per ogni piastra screening. </li><li> Trasferire le cellule in una mangiatoia, e dispensare 100 ml di sospensione cellulare in zolle D1 contenenti spillo componenti chimiciONDI. Sospensione cellulare nel trogolo è regolarmente agitato per evitare la sedimentazione. </li><li> Spike controllo pozzetti A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 e G12 con 1 ml di DMSO. Pozzetti verranno utilizzati come riferimento per le cellule viventi (tossicità). Spike controllo pozzetti B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 e H12 con 1 ml di DMSO e 2,5 ml di una soluzione 0,5% IGEPAL per uccidere le cellule. Pozzetti saranno utilizzati come riferimento per le cellule morte (elevata tossicità). </li><li> Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 3. Preparazione di colture cellulari infette da rMV2/Luc <ol><li> Crescere e recuperare cellule come descritto in 2.1 e 2.2. Ancora una volta, Risospendere le cellule a 3 x 10 5 cellule / ml in terreno di coltura. Si consideri che 12,5 ml di sospensione cellulare sono necessari per ogni piastra screening. </li><li> Facoltativo: supplemento terreno di coltura con uridina a 20 mcg / ml. Nota: Quando lo screening di librerie chimiche per replicatio viralen inibitori, sembra che i composti di targeting primi passi della via di biosintesi delle pirimidine sono spesso isolati 13,16,27,28. L&#39;aggiunta di uridina al mezzo di coltura viene utilizzato per filtrare tali molecole antivirali. In effetti, questo ripristina efficacemente la replicazione virale quando gli enzimi a monte della via di biosintesi delle pirimidine sono bloccati. </li><li> Salvare 01:10 di sospensione cellulare per pozzetti di controllo con le cellule non infette, e procedere all&#39;infezione con il volume rimanente. </li><li> Scongelare il volume appropriato di soluzione rMV2/Luc. Le soluzioni di archivi MV sono di solito a 10 6 -10 8 particelle infettive per ml. La cultura deve essere infettato da 0.1 particelle infettive di rMV2/Luc per cellule bersaglio, che corrisponde a 0,1 molteplicità di infezione (MOI). Nota: rMV2/Luc deriva dal vaccino MV (ceppo Schwarz) e viene manipolato in un ambiente BSL2. </li><li> Aggiungi al virus di sospensione cellulare e mescolare delicatamente. Trasferire le cellule infette a un trogolo, e dispensare 100microlitri di sospensione cellulare infettata nelle colonne 2 a 11 piastre di D2 contenenti composti chimici spillo. Sospensione di cellule all&#39;interno della depressione viene regolarmente miscelato delicatamente. </li><li> Nelle colonne 1 e 12, dispensare 100 microlitri di cellule non infette un pozzo per due. Cellule infettate sono dispensati negli altri pozzetti. </li><li> Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 4. Misure Luciferase attività e analisi dei dati <ol><li> Rimuovere le piastre D1 dal termostato, e determinare la vitalità cellulare con l&#39;aggiunta di 50 ml di base di luciferasi-fattibilità reagenti direttamente ai pozzetti di coltura. Miscelare e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Leggere le piastre con un luminometro. Tempo di integrazione è impostato a 100 msec per bene. </li><li> Rimuovere le piastre D2 dal termostato, e determinare l&#39;attività di luciferasi aggiungendo 50 ml di substrato luciferasi direttamente pozzetti di coltura. Incubare per 6 minuti a temperatura ambiente, e leggere le piastre con un luminometro come descriletto sopra. </li><li> Calcolare un Z&#39;-fattore per ciascuna piastra D1 del saggio di tossicità a garantire la qualità dello schermo 29. Z &#39;= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), dove μ + e + σ corrispondono a mezzo di luminescenza e deviazioni standard per le cellule HEK-293T con solo DMSO (senza tossicità), e-μ e σ-sono mezzi di luminescenza e deviazioni standard per pozzetti di coltura trattati con IGEPAL per uccidere le cellule. Z &#39;dovrebbe essere superiore a 0,5, o la corrispondente piastra viene scartato. </li><li> Impostare la soglia di tossicità a μ + / 2. Scartare composti con valori di luminescenza di sotto di questo cut-off (Figura 3A). </li><li> Calcolare un Z&#39;-fattore per ciascuna piastra D2 del saggio antivirale. Qui, μ + e + σ corrispondono a mezzo di luminescenza e deviazioni standard per cellule infettate coltivate con il solo DMSO, e μ e σ-sono mezzi di luminescenza e deviazioni standard per le cellule non infette. Ancora una volta, piatti con Z &amp; #39; valori inferiori a 0.5 vengono scartati. </li><li> Calcolare l&#39;inibizione della replicazione virale come segue: percentuale di inibizione = (μ + - attività di luciferasi per il composto X) / (μ + - μ-) * 100. Impostare la soglia di inibizione al 75%, e selezionare composti che sia a ridurre i valori di luminescenza di sotto di questo cut-off (Figura 3B) e non sono tossiche secondo i criteri descritti in 4.4. </li></ol> 5. Schermo secondario per la tossicità e ampio spettro di attività antivirale <ol><li> Assicurati 01:02 diluizioni seriali per ogni colpo composto in DMSO, a partire da 500 micron a 4 micron (8 diluizioni). Riempire bianco, tessuti piastre di coltura con codice a barre con 50 ml di terreno di coltura. Aggiungere 1 ml di ogni diluizione composto in pozzetti di coltura. Ripetete due volte per avere 3 piastre di coltura con diluizioni seriali duplicati per ogni composto colpo. </li><li> Preparare 37,5 ml di una sospensione di cellule HEK-293T a 6 x 10 5 cellule / ml in terreno di coltura come descritto sopra (in 2.1 e 2.2). Dispensare 2x 12,5 ml in tubi falcon e infettare le cellule sia con rMV2/Luc al MOI = 0.1 o CHIKV ricombinante che esprime Renilla luciferasi (CHIKV / Ren) a MOI = 0.2. Mescolare capovolgendo. Nota: CHIKV / Ren è derivato da un ceppo selvatico di CHIKV e quindi dovrebbe essere manipolato in un ambiente BSL3. Le piastre possono essere spostati da BSL3 a BSL1 volta substrato Renilla è stato aggiunto ai pozzetti di coltura (vedi sotto). </li><li> Dispensare 50 ml di infetti, rMV2/Luc-infected, o CHIKV / cellule Ren-infetti in piastre di coltura contenenti diluizioni seriali di composti ferita. Incubare 24 ore a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 50 ml di substrato luciferasi di lucciola per determinare l&#39;attività lucciola luciferasi in pozzi rMV2/Luc-infected. Aggiungere 50 ml di Renilla substrato luciferasi per determinare l&#39;attività luciferasi Renilla in CHIKV / pozzi Ren-infettati. Infine, aggiungere 50 ml di base di luciferasi-test vitalità reagente per cellule non infette per determinare la vitalità cellulare. </li><li> Dati Plot (Figura 4) e determinare le concentrazioni di composti che inibiscono colpite MV e la replica CHIKV del 50%. Ignorare composto mostrando una certa tossicità in questo saggio. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La pipeline di screening qui descritto mira a selezionare i composti con un profilo adatto come inibitori ampio spettro di virus a RNA. Quando una libreria di 10.000 composti è stato proiettato con questo protocollo e sono stati applicati criteri di filtraggio di cui sopra, cioè l&#39;inibizione della replicazione MV superiore al 75%, 40 composti (0,4%) ha ottenuto positive. Inoltre, circa la metà di loro ha mostrato una certa tossicità nel saggio di redditività basati luciferasi, e sono state disattese pe...

Virus a RNA sono responsabili di una grande varietà di infezioni umane, e hanno un enorme impatto sulle popolazioni di tutto il mondo, sia in termini di salute pubblica e di costo economico. Vaccini efficaci sono stati sviluppati contro diversi virus a RNA umano, e sono ampiamente utilizzati come trattamenti profilattici. Tuttavia, vi è ancora una mancanza critica di farmaci terapeutici contro infezioni da virus RNA. Infatti, i vaccini non sono disponibili efficaci contro i principali agenti patogeni umani, come il virus della dengue, il virus dell&#39;epatite C o da virus sinciziale respiratorio umano (HRSV). Inoltre, i virus a RNA sono responsabili per la maggior parte delle patologie emergenti, che sono aumentate in frequenza a causa degli scambi globali e l&#39;impatto umano sui sistemi ecologici. Contro questa minaccia che rappresentano i virus a RNA, il nostro arsenale terapeutico è estremamente limitato e relativamente inefficiente 1-3. Terapie attuali si basano essenzialmente sul tipo ricombinante I interferoni (IFN-α / β) per stimolare l&#39;immunità innata,o la somministrazione di ribavirina. Sebbene il meccanismo di azione di questo analogico ribonucleoside è controversa e probabilmente si basa su vari meccanismi, l&#39;inibizione di IMPDH cellulare (inosina monofosfato deidrogenasi), che esaurisce piscine GTP intracellulare, è chiaramente essenziale 4. Ribavirina, in combinazione con Interferone-α, è il principale trattamento contro il virus dell&#39;epatite C. Tuttavia, i trattamenti IFN-α / β e ribavirina sono relativamente scarsa efficacia in vivo contro la maggior parte dei virus a RNA come efficiente smussato IFN-α / β segnalazione attraverso l&#39;espressione dei fattori di virulenza 5 e spesso sfuggire ribavirina 3. Questo aggiunto al fatto che il trattamento ribavirina sta sollevando importanti problemi di tossicità, anche se è stato recentemente approvato contro la malattia HRSV grave con benefici controversi 6. Più recentemente, alcuni trattamenti specifici per il virus sono stati commercializzati, in particolare contro il virus dell&#39;influenza, con l&#39;o sviluppof inibitori della neuraminidasi 3. Tuttavia, la grande diversità ed emergere permanente dei virus RNA preclude lo sviluppo di trattamenti specifici contro ciascuno di essi in un futuro relativamente vicino. Complessivamente, questo sottolinea la necessità di strategie efficaci per identificare e sviluppare molecole antivirali potenti nel prossimo futuro. È banale dire che un inibitore di ampio spettro attivo contro un grande pannello di virus a RNA possa risolvere questo problema. Anche se una tale molecola è ancora il sogno di un virologo, la nostra migliore comprensione dei meccanismi di difesa cellulari e sistema immunitario innato suggeriscono che alcune possibilità esistono 7,8. Diversi laboratori accademici e industriali sono ora alla ricerca di molecole che stimolano aspetti specifici dei meccanismi di difesa cellulare o vie metaboliche per smussare la replicazione virale. Sebbene tali composti probabilmente mostrerà significativi effetti collaterali, i trattamenti contro le infezioni virali acute saranno amministrareED per un tempo relativamente breve, rendendoli accettabili nonostante una certa tossicità potenziale sul lungo termine. Varie strategie sono state sviluppate per identificare tali ampio spettro molecole antivirali. Alcuni programmi di ricerca mirano a trovare le molecole che colpiscono specifiche vie di difesa o metaboliche. Questo include, per esempio, recettori di riconoscimento patogeno per suscitare l&#39;espressione genica antivirale 9 e attivare fattori antivirali come RNASEL 10, macchine autofagia promuovere degradazione virus 11, sintesi nucleoside percorsi guidati 12,13, o cascate apoptotiche per precipitare morte delle cellule infettate da virus 14. Altri gruppi hanno sviluppato schermi fenotipiche che non sono a target basati 13,15-17. In tal caso, le molecole antivirali sono semplicemente identificati dalla loro capacità di bloccare la replicazione virale in un dato sistema cellulare. Il presupposto generale è che un composto inibente 2-3 RNA virus non correlati avrebbe un profilo adeguato ad ampio spectrum molecola antivirale. La modalità di azione di composti hit selezionate con un approccio empirico è determinato solo in un secondo tempo e, infine, può portare alla identificazione di nuovi bersagli cellulari per antivirali. È interessante notare, un&#39;analisi retrospettiva di nuovi farmaci approvati dalla US Food and Drug Administration tra il 1999 e il 2008 ha mostrato che, in generale, tali proiezioni fenotipici tendono a rendere meglio rispetto agli approcci di obiettivi di scoprire prima-in-class piccole molecole farmacologiche 18 . Replicazione virale in saggi cellulari high-throughput è di solito determinata da virus effetto citopatico. Le cellule sono infettate e coltivate in 96 - o 384 pozzetti in presenza di composti testati. Dopo alcuni giorni, strati cellulari vengono fissate e colorate con coloranti come cristallo violetto. Infine, l&#39;assorbanza è determinato con un lettore di piastre e composti che inibiscono la replicazione virale sono identificati per la loro capacità di conservare i livelli cellulari from indotta da virus effetto citopatico. In alternativa, effetto citopatico virale-mediate sono valutate con test di vitalità standard come la riduzione MTS. Tali saggi sono molto trattabili e conveniente, ma soffrono di tre importanti limitazioni. In primo luogo, essi richiedono una combinazione virus-cellula in cui la replicazione virale è citopatico in soli pochi giorni, ma questo non è sempre possibile, mettendo così per le strategie alternative 19. In secondo luogo, essi sono scarsamente quantitativa poiché si basano su una misura indiretta della replicazione virale. Infine, composti tossici possono essere segnati come risultati positivi, e quindi devono essere eliminate con uno schermo contatore che misura la vitalità cellulare. Per superare alcuni di questi ostacoli, virus ricombinanti o repliconi sono stati progettati dai genetica inversa per esprimere proteine ​​reporter, come EGFP o luciferasi, da una unità di trascrizione aggiuntivo o in frame con geni delle proteine ​​virali (alcuni esempi sono 20-23). Quando questi virus si replicano, giornalista proteins sono prodotte con proteine ​​virali stessi. Questo fornisce un saggio molto quantitativa per misurare la replicazione virale e valutare l&#39;attività inibitoria di molecole candidate. Ciò è particolarmente vero per i virus ricombinanti esprimenti luciferasi (o altri enzimi in grado di bioluminescenza) poiché questo sistema giornalista presenta una vasta gamma dinamica con elevata sensibilità e praticamente senza sfondo. Inoltre, non vi è alcuna fonte di luce di eccitazione, evitando interferenze con il composto fluorescenza 24. Qui, i dettagli di un protocollo high-throughput di vagliare librerie chimiche per gli inibitori ampio spettro di virus a RNA. I composti vengono testati prima su cellule umane infettate con un virus ricombinante morbillo (MV) che esprimono luciferasi di lucciola 25 (rMV2/Luc, Figura 1, schermo primario). MV appartiene a Mononegavirales ordine, ed è spesso considerato come un membro prototipo del virus RNA negativo-strandes. Come tale, MV genoma è utilizzato come modello per la polimerasi virale per sintetizzare molecole di mRNA che codificano per proteine ​​virali. Nel ceppo ricombinante MV chiamato rMV2/Luc, espressione della luciferasi è espressa da una unità di trascrizione aggiuntivo inserito tra P e geni M (Figura 2A). In parallelo, i composti vengono testati per la loro tossicità su cellule umane usando un reagente a base di luciferasi commerciale che valuta, quantificando ATP, il numero di cellule metabolicamente attive in coltura (figura 1, schermo primario). Librerie chimiche interi possono essere facilmente sottoposti a screening con questi due saggi per selezionare composti che non sono tossici e bloccano efficientemente replica MV. Poi, risultati sono riesaminati per l&#39;inibizione dose-risposta di replica MV, la mancanza di tossicità e per la loro capacità di alterare virus Chikungunya (CHIKV) replica (Figura 1, schermo secondario). CHIKV è un membro della famiglia Togaviridae e il suo genoma è apositive molecola a singolo filamento di RNA. Come tale, essa è del tutto estraneo a morbillo e composti che inibiscono sia MV e CHIKV levano in piedi una grande occasione per inibire un grande pannello di virus a RNA. Proteine ​​non strutturali CHIKV sono direttamente tradotti dal genoma virale, mentre le proteine ​​strutturali sono codificati mediante trascrizione e la traduzione di una molecola di mRNA subgenomico. La nostra replica saggio in vitro per CHIKV si basa su un ceppo ricombinante chiamato CHIKV / Ren, che esprime Renilla luciferasi come parte spaccati della poliproteina nonstructural attraverso un inserimento del gene reporter tra nsP3 e sequenze NSP4 26 (Figura 2B). La misura dell&#39;attività di luciferasi Renilla consente il monitoraggio della replicazione virale nella fase iniziale del ciclo di vita CHIKV. Questo protocollo ad alta produttività è stato usato per identificare rapidamente composti con un profilo adatto antivirali ad ampio spettro in una libreria commerciale di 10.000 molecduli arricchito di diversità chimica. I composti sono stati essenzialmente seguendo la regola di Lipinski di cinque, con un peso molecolare compreso 250-600 dalton, e registrare i valori D inferiore a 5. Maggior parte di queste molecole erano nuove entità chimiche non disponibili in altre biblioteche commerciali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

Virus a RNA sono responsabili di gravi malattie umane come l&#39;influenza, bronchite, dengue, epatite C o il morbillo. Essi rappresentano anche una minaccia emergente a causa di un aumento degli scambi mondiali e le popolazioni umane che penetrano sempre più ecosistemi naturali. Un buon esempio di tale situazione emergente è epidemie di virus chikungunya del 2005-2006 nell&#39;Oceano Indiano. I recenti progressi nella nostra comprensione delle vie cellulari che controllano la replicazione virale suggeriscono che i composti di targeting funzioni della cellula ospite, piuttosto che il virus stesso, potrebbe inibire un grande pannello di virus a RNA. Alcuni composti antivirali ad ampio spettro sono stati identificati con ospite analisi mirate. Tuttavia, misurando l&#39;inibizione della replicazione virale in colture cellulari con riduzione degli effetti citopatici come visualizzatore ancora rappresenta una strategia di screening fondamentale. Tali schermi funzionali sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus ricombinanti che esprimono giornalista enzimi capable della bioluminescenza come la luciferasi. Nella presente relazione, abbiamo dettaglio un gasdotto high-throughput screening, che combina il morbillo ricombinanti e virus chikungunya, con saggi di vitalità cellulare, per identificare i composti con un profilo antivirale ad ampio spettro.

Questo gasdotto di screening si basa in primo luogo sulla selezione dei composti che inibiscono la replicazione MV e non mostra alcuna tossicità cellulare significativa (Figura 1, schermo primario). Sfrutta saggi basati luciferasi per determinare la tossicità cellulare e l&#39;inibizione della replicazione virale. Tutte le fasi di pipettamento e acquisizione dati può essere eseguita in un ambiente ad alta produttività con una piattaforma robotica. Tossicità cellulare de...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Saggi in vitro per misurare la replicazione del virus sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus a RNA ricombinanti esprimenti luciferasi o altri enzimi in grado di bioluminescenza. Qui i dettagli di una pipeline screening ad alto rendimento che unisce tali ceppi ricombinanti di morbillo e virus chikungunya per isolare antivirali ad ampio spettro di librerie chimiche.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K Views.  Institut Pasteur, CNRS UMR3569.  Saggi in vitro per misurare la replicazione del virus sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus a RNA ricombinanti esprimenti luciferasi o altri enzimi in grado di bioluminescenza. Qui i dettagli di una pipeline screening ad alto rendimento che unisce tali ceppi ricombinanti di morbillo e virus chikungunya per isolare antivirali ad ampio spettro di librerie chimiche. 

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infezione di cellule HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Un High-throughput Cre-Lox attivato membrana virale Fusion test per identificare gli inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Screening ad alta produttività dei composti chimici per chiarire i loro effetti sulla persistenza batterica

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...