Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NSC.

1. Preparazione di titoli di Master <ol><li> Fai maestri scorte dei composti da testare in DMSO. Preparare scorte a una concentrazione standard di 20 mM. Nota: qualsiasi concentrazione superiore a 10 mm può essere utilizzato. Composti che possono essere utilizzati come controlli positivi per convalidare questo saggio includono RAL, EVG, e DTG. </li><li> Garantire i composti sono sciolti in DMSO vortex le soluzioni più volte per 15 secondi e incubando a temperatura ambiente per 1 ora. Conservare le 20 soluzioni madre mM al buio a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione delle piastre con 96 pozzetti per Compound Screening <ol><li> Scegliere la linea di cellule da testare (es HOS o TZM-bl), e seminare 100 pl di tali cellule ad una densità di 4 x 10 4 cellule / ml (4.000 cellule / pozzetto) in mezzi (ad esempio modificato Eagle o DMEM Dulbecco supplementato con 5% (v / v) di siero fetale bovino, siero di vitello neonato 5%, e penicillina (50 unità / ml) più streptomycin). </li></ol> 3. Generazione di riserve di virus Produrre VSV-g-pseudotyped HIV trasfettando cellule 293 (come mostrato in Figura 1, fase 1) 32-34. <ol><li> Il giorno prima della trasfezione, piastra 293 celle su 100 piatti mm di diametro con una densità di 1,5 x 10 6 cellule. </li><li> Il giorno della trasfezione, trasfettare cellule 293 con 16 pg di tipo selvatico o mutante HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) e 4 microgrammi di VSV (pHCMV-g) utilizzando il metodo del fosfato di calcio 35. </li><li> Viene aggiunto circa 6 ore dopo il precipitato di fosfato di calcio, lavare 293 cellule due volte con tampone fosfato (PBS) e incubare con mezzi freschi per 48 ore. [DMEM supplementato con 5% (v / v) di siero fetale bovino, siero di vitello neonato 5%, e penicillina (50 unità / ml) più streptomicina (50 mg / ml)]. </li><li> Raccogliere il virus contenente surnatanti rimuovendo il supporto dal diametro di 100 mmpiatti, chiarire il surnatante mediante centrifugazione a bassa velocità a 3000 rpm per 10 minuti, filtrare il surnatante attraverso un filtro da 45 micron dimensione dei pori siringa, trattare surnatanti con DNasi Turbo per 30 minuti a RT e diluire surnatanti in mezzi per la preparazione in saggi di infezione . Conservare il surnatante virale congelati, in aliquote, a -80 ° C. Nota: la quantità di p24 nel supernatante viene determinato utilizzando un kit p24 saggio immunoenzimatico HIV-1. La concentrazione p24 è utilizzato per controllare la quantità di virus nel campione. Circa 500 ng di virus viene aggiunta alle cellule HOS placcato da 60 piatti mm di diametro ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule / piatto il giorno prima dell&#39;infezione. Dopo 48 h di incubazione, le cellule vengono raccolte, raccolte per centrifugazione, lavate e risospese in 100 microlitri di PBS. Aggiungi una pari quantità di luminescenza giornalista dosaggio del gene del reagente e misurare l&#39;attività luciferasi come descritto nelle sezioni 5.4.1 e5.4.2. Da questo, una diluizione appropriata del virus può essere fatto come discusso nel passo 4.6. </li></ol> 4. Composto screening in piastre con 96 pozzetti Schermo ciascun composto in triplice copia e media i risultati. Nota: l&#39;effetto di ciascun composto sulla replicazione virale viene corretto normalizzando il livello di replicazione ottenuto in assenza di qualsiasi composto. <ol><li> Determinare l&#39;intervallo di concentrazione empirica di essere proiettati. Nota: in genere, schermi con 11 diluizioni seriali sono fatti aggiungendo il composto alla colonna piastra per colonna e schermi con 7 diluizioni seriali sono fatti aggiungendo il composto per riga. Una triplice copia set di pozzi deve essere riservato per il controllo non composto. Inoltre, una colonna o una riga deve rimanere vuota per agire come controllo negativo / sfondo. Infine, se è una citotossicità cellulare o prova di infettività detterà se viene aggiunto virus. </li><li> Prepararediluizioni seriali della soluzione stock di 20 mm. Le concentrazioni sono scelti in funzione della gamma determinato empiricamente di concentrazioni da testare (come mostrato nella Tabella 1). Preparare le diluizioni in media a 10 volte la concentrazione finale desiderata, cioè se la concentrazione finale sta per essere a 100 micron, fare un archivio di lavoro 1 mm. Nota: composti con IC 50 s sopra 5-10 micron di solito non sono buoni candidati per lo sviluppo di farmaci. Nei test iniziali testiamo i composti solo contro il vettore WT. Promettenti composti che inibiscono efficacemente il vettore WT vengono poi testati contro un gruppo di mutanti resistenti ai farmaci. </li><li> Rimuovere le piastre a 96 pozzetti dall&#39;incubatore e aggiungere le diluizioni seriali dei composti da testare ai pozzetti in triplicato (come mostrato in Figura 1, fase 2). Nota: il volume aggiunto al pozzetto dovrebbe essere 1/10 del volume della concentrazione finale. Quindi, aggiungere 22 microlitri / pozzetto (volume finale pInoltre virus ost è di 220 ml) per i saggi di infettività. Per i saggi di citotossicità, aggiungere 11 microlitri / pozzetto (volume finale è di 110 ml / pozzetto). </li><li> Riportare le piastre a 96 pozzetti per l&#39;incubatrice. Per uno schermo citotossicità cellulare, incubare le piastre a 96 pozzetti 48 ore a 37 ° C e senza ulteriori manipolazioni sono necessari nel protocollo 4: passare al protocollo 5 Per i saggi di infettività, proseguire seguendo le istruzioni riportate nel protocollo 4.. </li><li> Saggi di infettività solo. Rimuovere le piastre dal termostato dopo un minimo di 3 ore di incubazione a 37 ° C con i composti da analizzare. Nota: questo permette il composto da assorbito dalle cellule prima dell&#39;infezione con il vettore HIV. </li><li> Preparare una diluizione magazzino del virus 33, 34 (di solito circa 1,3) che produrrà un segnale luciferasi tra 0,2-1,5 unità luciferasi relative (RLU) in cellule non trattate. Un intero piatto richiederà circa 10 ml della diluizionevirus ted. Aggiungere 100 ml di virus a ciascuno dei pozzetti, utilizzando un 8 o 12 pipetta multicanale. Non aggiungere virus alle negativo / sfondo pozzetti di controllo. Riportare le piastre per la 37 ° C incubatore per 48 ore. Nota: uno stock diluizione del virus 01:03 è tipica diluizione che produrrà un segnale luciferasi tra 0.2 -1.5 RLU basato su un saggio p24 mostrando che la concentrazione virale nel supernatante è approssimativamente 500 ng in 1,0 ml. </li></ol> 5. Preparazione e misurazione della citotossicità ed infettività in piastre con 96 pozzetti <ol><li> Aspirare il supporto dai pozzi (fenolo rosso nei media può interferire con il segnale luciferasi). Utilizzare una pipetta di vetro con una punta di pipetta 200 microlitri fissato all&#39;estremità. Inizia la parte superiore del supporto e lavorare lentamente giù verso l&#39;angolo in fondo al pozzo. Non spendere troppo tempo sul fondo del pozzo, o le cellule possono essere rimosse dal pozzo. </li><li> Aggiungere 100 ml di PBS integrato con 0,5 mM MgCl 2 a ciascun pozzetto. Questo deve essere fatto immediatamente dopo la media è rimosso in modo che le cellule non si seccano. </li><li> Solo per saggi di citotossicità, aggiungere 5 ml di tampone substrato dal saggio di rilevamento di luminescenza ATP per ogni flacone di dotazione del reagente liofilizzato. Un flaconcino è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti. <ol><li> Aggiungere 50 ml di tampone di lisi cellulare dal saggio rilevamento luminescenza ATP a ciascun pozzetto. Agitare la piastra a 96 pozzetti a 700 rpm a temperatura ambiente per 5 minuti usando un thermomixer compatto. </li><li> Aggiungere 50 ml di ricostituito luminescenza ATP di reagenti del dosaggio di rilevamento per tutti i pozzetti, eccetto per il controllo / sfondo negativi pozzi. Agitare a 700 rpm a temperatura ambiente per 5 minuti usando un thermomixer compatto. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 20 min per permettere tempo per lo sviluppo del segnale. </li><li> Leggere la piastra a 96 pozzetti utilizzando luminometro micropiastra. Nota: aprire il programma microplacca luminometro SoftMax Pro. Assicurarsi che il luminometro sia impostato per misurare luminescence ad una sensibilità di 5 letture / pozzetto. </li></ol></li><li> Solo per saggi di infettività, aggiungere 10 ml di tampone substrato dal saggio gene luminescenza reporter per ogni flacone di dotazione del reagente liofilizzato. Un flaconcino è sufficiente per ciascuna piastra da 96 pozzetti. <ol><li> Aggiungere 100 pl di luminescenza ricostituito giornalista saggio gene reagente a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 20 min per permettere tempo per lo sviluppo del segnale. </li><li> Leggere la piastra a 96 pozzetti utilizzando un luminometro micropiastre interpretato nel paragrafo 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Determinazione del CC 50 e IC 50 valori per Composti <ol><li> Trasferire i dati luciferasi dal luminometro micropiastra in un foglio excel. <ol><li> Media sia i dati di luciferasi in triplice copia ed i dati del segnale di fondo / di controllo. Sottrarre il segnale di fondo media / controllo dal segnale medio triplicato per l&#39;intera gamma di concentrazione. </li> &lt;li&gt; normalizzare il segnale di correzione del fondo media degli intervalli di concentrazione contro l&#39;attività, se è citotossicità o infettività, in assenza di qualsiasi composto per determinare la percentuale di inibizione. Nota: percentuale di inibizione è definito come l&#39;attività di luciferasi in presenza del farmaco diviso per l&#39;attività di luciferasi in assenza di farmaco moltiplicato per 100. </li></ol></li><li> Utilizzare software Kaleidagraph per ottenere CC 50 e IC 50 valori <ol><li> Trasferire sia l&#39;intervallo di concentrazione empiricamente determinato e percentuale di inibizione dell&#39;attività di luciferasi in Kaleidagraph. </li><li> Tracciare i dati con l&#39;intervallo di concentrazioni sull&#39;asse x e la percentuale di inibizione di attività di luciferasi sull&#39;asse y. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team.">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li><li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens.">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li><li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland:+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study.">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li><li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+indinavir,+zidovudine,+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy.">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li><li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+dynamics+in+vivo:+virion+clearance+rate,+infected+cell+life-span,+and+viral+generation+time.">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy:+a+review+of+the+literature.">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+adherence+interventions:+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic.">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li><li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection.">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li><li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data.">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li><li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir/emtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients:+156-week+results+from+STARTMRK.">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li><li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum,+prevention,+and+management.">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li><li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+daily+dolutegravir+(S/GSK1349572)+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV:+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1,+a+dose-ranging,+randomised,+phase+2b+trial.">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li><li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs.">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li><li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li><li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li><li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elvitegravir:+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase.">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S/GSK1349572,+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor.">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li><li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng.">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li><li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O.">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li><li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways.">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors,+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles.">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors.">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li><li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies.">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li><li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation.">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li><li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy.">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li><li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Gli autori hanno nulla da rivelare.

Descriviamo un saggio rapido, efficiente e riproducibile che può essere utilizzato per composti schermo di citotossicità e per la loro capacità di inibire la replicazione del WT e resistente HIV-1 farmaco. La capacità di identificare rapidamente i composti e testare la loro efficacia e la citotossicità è cruciale nello sviluppo di farmaci nuovi e migliorati contro HIV-1. Una volta composti di piombo sono identificati, analoghi del composto guida possono essere prodotti e testati utilizzando lo stesso dosaggio. Il saggio è relativamente semplice. Ci sono entrambi i controlli positivi e negativi che consentono all&#39;utente di diagnosticare i problemi più comuni (composti tossici, problemi con il vettore stock). L&#39;uso di un insieme triplicato di pozzetti senza composto aggiunto indica che si è verificato l&#39;infezione virale. Il fatto che la citotossicità è misurata in un saggio indipendente misinterpreting evita una riduzione della luciferasi citotossicità causata da un effetto specifico sulla replicazione virale. I passaggi criticinel protocollo si preparano le piastre in modo che le cellule sono distribuiti uniformemente nei pozzetti, che i pozzetti hanno le concentrazioni appropriate dei composti da testare, aggiungendo la stessa quantità di virus a ciascuno dei pozzetti, e misurando l&#39;attività di luciferasi per determinare il CC 50 e IC 50 valori. Il saggio è sicuro, quantitativa e riproducibile. Il saggio è sicuro perché il vettore è la replica difettoso. Il saggio è quantitativa e riproducibile perché si basa su un singolo vettore rotonda che esprime la luciferasi, che può essere saggiata esattamente e convenientemente. In un round saggio più replicazione del virus, la misurata IC 50 dipende dal numero di cicli di vita virali; questo è un problema particolare quando i saggi coinvolgono sia WT e virus resistenti ai farmaci che potrebbero avere le capacità di replica significativamente diversi. Ci sono stati diversi saggi enzimatici riferito in precedenza che possonoessere utilizzato per lo screening per gli inibitori IN. I saggi che coinvolgono tecnologia PCR real time per misurare il DNA integrato richiedono proteine ​​ricombinanti purificate (s), e sono, in generale, sia più laborioso e costoso, 36, 37. Sebbene sia possibile utilizzare saggi enzimatici per misurare l&#39;impatto dei composti sugli altri enzimi virali (RT e proteasi), ciascun enzima richiede un proprio sistema di dosaggio. L&#39;unico test vettore rotonda, come descritto, può essere utilizzato, senza modifiche, per lo screening inibitori della RT. Un test simile può essere usato per individuare inibitori di proteasi; Tuttavia, in un saggio di inibitore della proteasi, i composti devono essere aggiunti alle cellule usate per produrre i vettori. Un saggio correlate, utilizzando cellule e vettori differenti, può anche essere usato per individuare busta (env) e inibitori entrata fusione HIV. Infine, il test può essere utilizzato, in scala ingrandita, con dispensatori robotici automatizzati. Così, il saggio può essere utilizzato per lo screening di grandi librerie di composti contro WT e mutant HIV. Tuttavia, il fatto che il test in grado di rilevare un inibitore della replicazione dell&#39;HIV che agisce in diverse fasi del virali punti del ciclo di vita di una limitazione nell&#39;interpretazione dei dati. Di per sé il saggio non definisce la fase del ciclo di vita è bloccato da un composto. Se si pone questa domanda, può essere risolto utilizzando il tempo di saggi di addizione 38, e testando il composto contro le proteine ​​virali ricombinanti purificate. Purtroppo, nonostante il successo di farmaci anti HIV, vi sono ancora problemi sia con resistenza e tossicità. In assenza di un vaccino efficace contro l&#39;HIV, è necessario non solo per sviluppare nuovi farmaci terapeutici che saranno efficaci contro i mutanti resistenti ai farmaci esistenti, ma anche per sviluppare farmaci profilattici che possono ridurre la diffusione del virus. Se l&#39;uso profilattico di farmaci anti-HIV incudes il trattamento delle persone infette, questo approccio un onere speciale sullo sviluppo di farmaci che hanno little o nessuna tossicità a lungo termine.

La disponibilità di farmaci mirati diversi passaggi essenziali nella HIV-1 ciclo di vita virale ha portato alla terapia di combinazione farmaco (chiamato terapia altamente attiva antiretrovirale, o HAART), che ha notevolmente migliorato il trattamento delle infezioni da HIV-1, e la sopravvivenza a lungo termine dei pazienti. HAART, che utilizza tipicamente combinazioni di due nucleosidico della trascrittasi inversa (RT) e inibitori sia un inibitore della proteasi o un inibitore non nucleosidico RT, ha convertito una malattia mortale in una condizione di vita lunga 1-5. Tuttavia, nonostante i molti successi di HAART in soppressione sostenuta della replicazione virale, ma ha dei limiti. HAART non sradicare l&#39;HIV, in modo che i pazienti non vengono curati e la terapia è lunga vita. Ci sono problemi con la tossicità della droga e con l&#39;emergere di ceppi resistenti ai farmaci. La resistenza può nascere a tutti i farmaci anti-HIV approvati, tra cui i farmaci recentemente approvati che mirano HIV integrasi (IN). La resistenza ai farmaci probabilmente deriva Becauso di mutazioni spontanee che si verificano durante la replicazione virale (tasso di errore di 3 x 10 -5 ciclo mutazioni / base / replica) 6. Quando sorgono mutazioni nei geni che codificano per i bersagli di farmaci anti-retrovirali, un piccolo sottoinsieme di queste mutazioni porterà ad una riduzione di sensibilità del ceppo virale ai farmaci. Per evitare lo sviluppo di resistenza ai farmaci, le concentrazioni del farmaco devono essere mantenuti a livelli che sopprimono completamente replicazione dell&#39;HIV. Scarsa aderenza al regime terapeutico aggrava il problema, e può portare al rapido sviluppo di resistenza 7-9. Anche se concentrazioni di farmaco possono variare in pazienti a causa di assorbimento differenti, il metabolismo, la distribuzione ei livelli di escrezione, elevate concentrazioni di droga possono portare a tossicità 10. Poiché la terapia continua per la vita del paziente, esistono gravi problemi di sicurezza circa la tossicità a lungo termine di anti antiretrovirali. Gli anti-retrovirali comunemente usati in HAART possono avere effetti negativi and ci sono stati episodi in cui gli effetti collaterali sono stati in pericolo di vita 11-15. I problemi riscontrati pazienti con lo sviluppo di resistenza e tossicità alla base della necessità di sviluppare nuovi farmaci che bloccano efficacemente la replicazione dei ceppi resistenti al farmaco comuni del virus con poca o nessuna tossicità a lungo termine. Pertanto, vi è la necessità di un metodo che può schermo per i composti che bloccano fasi essenziali del ciclo vitale del virus rapidamente. Qui si descrive un dosaggio efficace che può essere utilizzato per valutare la citotossicità di composti e la loro capacità di bloccare rapidamente ed efficacemente la replicazione di entrambi WT e ceppi di HIV resistenti ai farmaci. Il test utilizzato è simile a un saggio che è stato sviluppato per lo screening farmacoresistenza in virus isolato da pazienti 16-18. Anche se il dosaggio può essere utilizzato senza modifiche per schermo per i composti che possono bloccare la trascrizione inversa dell&#39;HIV, noi descrIBE utilizzando il test per valutare IN inibitori. IN è un enzima virale essenziale che inserisce il DNA virale nel genoma cellulare 19. Anche se si stanno sviluppando una serie di promettenti inibitori, alcuni dei quali sono attualmente in fase di sperimentazione clinica, solo Isentress 20, 21 (noto anche come raltegravir o RAL) e, più recentemente, Elvitegravir (EVG) 22 e dolutegravir (DTG) 23 sono stati approvato dalla FDA. Questi composti sono attivi contro l&#39;HIV B e sottotipi non B in coltura cellulare e nei pazienti 24, 25. Tuttavia, il trattamento con RAL seleziona per farmaco-resistente di HIV-1 IN mutanti, tra cui Y143R, N155H, e G140S/Q148H 24, 26-31. N155H e G140S/Q148H anche ridurre l&#39;efficacia di EVG, che sottolinea la necessità di progettare e sviluppare seconda generazione IN Inibitori di trasferimento del filamento (INSTIs) che sono efficaci contro queste mutazioni di resistenza.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Sebbene un certo numero di farmaci anti HIV sono stati approvati, ci sono ancora problemi con la tossicità e la resistenza ai farmaci. Ciò dimostra la necessità di individuare nuovi composti in grado di inibire l&#39;infezione da parte resistente droga comuni ceppi HIV-1 con tossicità minima. Qui si descrive un dosaggio efficace che può essere utilizzato per determinare rapidamente la citotossicità e l&#39;efficacia di un composto contro i ceppi WT e mutanti cellulare. La linea cellulare porta è seminato in una piastra a 96 pozzetti e, dopo una incubazione 24 ore, vengono aggiunti serialmente diluizioni dei composti da testare. Nessun ulteriore manipolazioni sono necessarie per i test di citotossicità cellulare; per anti HIV saggi una quantità predeterminata di una o WT o farmaco resistente HIV-1 vettore che esprime luciferasi viene aggiunta alle cellule. La citotossicità viene misurata utilizzando un saggio dipende luminescenza ATP e l&#39;impatto dei composti sulla infettività viene misurata determinando la quantità di lucifeRASE in presenza o assenza di inibitori putativi. Questo test di screening richiede quattro giorni per completare e composti multipli può essere proiettato in parallelo. I composti vengono proiettati in triplicato ei dati sono normalizzati ai livelli infettività / ATP in assenza di composti bersaglio. Questa tecnica fornisce una misurazione rapida e precisa della efficacia e la tossicità di potenziali composti anti-HIV.

Se il test (Figura 1, punti 1 e 2) è stata eseguita con successo, allora i valori luciferasi dovrebbero somigliare i dati presentati nella tabella 2 Eseguire la scansione di tutti i range di concentrazione.; un composto potenzialmente potente rivelerà aumentando l&#39;attività luciferasi da sinistra a destra, e il controllo deve avere la più alta attività luciferasi. Se l&#39;attività luciferasi non superi 0,1 Unità luciferasi relative (RLU) su tutta la gamma di concentrazione, questo di solito indica che il composto ha ucciso le cellule. Se i dati luciferasi è maggiore o uguale a 2,0 RLU in tutte le diluizioni seriali, poi i composti non erano in grado di inibire HIV-1 infezioni alle concentrazioni testate. Tracciando la concentrazione dei composti contro la percentuale di inibizione di attività di luciferasi in Kaleidagraph (Tabella 3, parte A), dopo l&#39;esecuzione di analisi di regressione lineare, produrrà risultati simili a t<html> tubo mostrato in tabella 3, parte B. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Preparazione di HIV-1 Stocks virali e l&#39;installazione di citotossicità cellulare e Single-round infettività saggi. Nella fase 1, cellule 293T sono trasfettate con pNL4.3ΔEnv.LUC e VSV-G ed incubato per 48 ore per produrre virus 34 . Il virus viene raccolto e conservato (congelato a -80 ° C in aliquote) finché non viene utilizzato nei saggi di infettività. Per il passaggio 2, cellule HOS vengono seminate in una piastra a 96 pozzetti e incubate per 24 ore. Le cellule sono poi pre-incubate con diluizioni seriali dei composti da testare per 3 ore e poi infettati con il virus (sia WT o resistenti ai farmaci). Dopo una incubazione 48 ore, l&#39;attività della luciferasi è misurata. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabella 1. Drug Screening Serial diluizione Prototype. Uno screening più rigoroso coinvolge 11 diluizioni seriali che in genere partono da 10 micron e finiscono a 0,0005 micron. Le diluizioni seriali sono preparati 10x; ci sono 100 microlitri di cellule e 100 ml di virus in ogni pozzetto). A questo volume e seguendo questi calcoli, le diluizioni seriali saranno sufficienti per 3 righe di un&#39;intera piastra a 96 pozzetti. I saggi di citotossicità sono preparati allo stesso modo; tuttavia le diluizioni seriali 11 partono da 250 micron e terminano a 0.05 micron. Solo 11 ml delle diluizioni sono aggiunti ai pozzetti nella piastra che contengono 100 ml di cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa cifra.</a> <img alt="Tabella 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabella 2. Luciferasi Lettura segnale dati e Determinazione della percentuale di inibizione di attività luciferasi. La tabella dati mostra un tipico insieme di dati luciferasi per un composto successo. La tabella mostra inoltre i calcoli aggiuntivi necessari per determinare la percentuale di inibizione dell&#39;attività di luciferasi e il CC 50 e IC 50 valori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabella 3. Linear Regression Analysis Tabella dati. Parte A. Graficamente la gamma di concentrazione utilizzata contro la percentuale di inibizione di attività di luciferasi in Kaleidagraph produrrà le relative curve di inibizione. Parte B, Le curve di inibizione sono definiti dalla 3 parametricofunzione sigmoidale e in forma di dati mediante regressione lineare analisi 18. Questa tabella dati viene quindi utilizzato in combinazione con Microsoft Excel per calcolare le concentrazioni di farmaco necessarie per inibire l&#39;integrazione virus e citotossicità cellulare del 50%, ad esempio, IC 50 e CC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Qui si descrive la citotossicità cellulare e singoli saggi di infettività rotonde che consentono lo screening rapido e preciso dei composti di determinare la loro citotossicità cellulare (CC 50) e valori di IC 50 contro WT e resistente di HIV-1 farmaco.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Views.  National Cancer Institute.  Qui si descrive la citotossicità cellulare e singoli saggi di infettività rotonde che consentono lo screening rapido e preciso dei composti di determinare la loro citotossicità cellulare (CC 50) e valori di IC 50 contro WT e resistente di HIV-1 farmaco. 

Video: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Reverse Genetics recupero mediato del Infettive Norovirus Murine

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...