Gli autori desiderano ringraziare tutti i colleghi che hanno reso possibile questo lavoro, in particolare Maya Balamane, Elizabeth Johnston Bianco, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, e Lungani Ndwandwe. Gli autori desiderano inoltre ringraziare tutto il personale del Dipartimento di Salute e personale Africa Centro che lavorano la Hlabisa trattamento di HIV e il programma Care.

<ol>
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<div> Questo lavoro è stato supportato dal Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Unione europea (SANTE 2007 147-790), il Centro statunitense per il controllo delle malattie tramite CAPRISA (titolo del progetto: rafforzamento dei sistemi sanitari e di fallimento del trattamento HIV (HIV- TFC)), e il programma Swiss South African comune di ricerca (SSJRP) assegno di ricerca dal titolo &quot;Swiss Prot / Sudafrica: Proteine ​​Bioinformatica Sviluppo delle risorse per importanti patogeni relative alla salute&quot;. RL è supportato dal Wellcome Trust (codice di autorizzazione 090.999 / Z / 09 / Z). i finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti. </div>

Diversi low cost metodi in-house sono state descritte negli sforzi per cercare di rendere l&#39;HIV farmaco-resistenza genotipizzazione più abbordabile 33, 34, 36. Non vi è alcun dubbio sulla necessità di integrare test di resistenza ai farmaci nel continuum di cura per le persone in terapia antiretrovirale in paesi a risorse limitate. Tuttavia, la maggior parte dei metodi riportati riguardare l&#39;applicazione di farmacoresistenza genotipizzazione nella sorveglianza della resistenza ai farmaci a livello di popolazione. Il metodo di genotipizzazione Saturno / Life Technologies è un protocollo completamente integrato per la sorveglianza e il monitoraggio della resistenza ai farmaci. Questo metodo è stato progettato per essere un protocollo di attuazione conveniente soprattutto open source e aperto le risorse di bioinformatica di accesso per l&#39;interpretazione della resistenza ai farmaci e la generazione di report per la gestione clinica. E &#39;stato dimostrato attraverso il confronto con il metodo di genotipizzazione Viroseq approvato dalla FDA per essereaccurate per identificare mutazioni di resistenza droga da un panel di ANRS campioni di prova di abilità, nel 100% dei campioni di pannelli di laboratorio che sono stati amplificati con successo. La precisione è stata valutata anche su campioni clinici di virus sottotipo C, il sottotipo più dominante in Africa australe. Il metodo era esatto sul sottotipo campioni C come era il sottotipo A e B. Tuttavia, se il metodo potrebbe essere utilizzato in altre parti del mondo dove CRF02_AG è prevalente, vi è la necessità per la modifica dei primer in quanto il metodo fallito per amplificare uno dei campioni del pannello che è stato dimostrato di avere CRF02_AG. In alternativa, una serie di primer degenerato sensibili a tutto gruppo M virus 33, 36 potrebbe essere utilizzata in regioni in cui la distribuzione sottotipo è più eterogenea 38. La sensibilità della trascrizione inversa e PCR può essere aumentata con l&#39;estrazione di RNA da maggiori volumi di plasma, come 500 ml. Il plasma può essere centrifuged a 21.000 xg per 90 min a concentrare le particelle virali prima di procedere con il protocollo come descritto dal mini kit di estrazione di RNA virale QIAamp. Come mostrato, il nuovo metodo ha un ulteriore vantaggio che produce rapporti completi per la gestione del singolo paziente. Queste relazioni sono un consolidamento del genotipo, il immunologici e virologici dati di monitoraggio così come la storia clinica e il trattamento da RegaDB. Questo è accompagnato da una interpretazione laboratorio dettagliata del profilo di resistenza seguita da una revisione altrettanto dettagliata della storia clinica del paziente e raccomandazioni di trattamento. L&#39;utilizzo di un medico specialista per esaminare i rapporti e fornire raccomandazioni per il trattamento per i pazienti fornisce mentorship tanto necessaria per infermieri e medici inesperti, che sono sempre forniscono ART in Sud Africa come parte delle raccomandazioni dell&#39;OMS per le attività di spostamento. Questi clinicarelazioni hanno dimostrato di essere strumenti didattici efficaci per i medici con poca o nessuna esperienza nella gestione della resistenza ai farmaci. Dal punto di vista del paziente, il nostro metodo riduce la necessità di recarsi in luoghi centralizzati per accedere ai servizi di HIV specialistici. Pertanto, il protocollo descritto nel suo complesso offre una buona piattaforma attraverso la quale l&#39;HIV gestione farmacoresistenza può essere integrato, ad un costo accessibile, nel continuum di cure per individui infetti da HIV in mancanza ART. I dati generati possono essere usate per scopi epidemiologici per valutare l&#39;evoluzione e trasmissione di farmacoresistenza nella comunità. La dimensione del frammento pol generato è sufficiente per più complessa analisi filogenetica che produrrà una migliore comprensione della epidemia a livello di popolazione.

L&#39;epidemia di HIV in Africa australe si è evoluto rapidamente 1 con un aumento esponenziale concomitante persone in terapia antiretrovirale (ART), soprattutto in Sud Africa 2, 3. Come prova sull&#39;impatto epidemiologico dei programmi di trattamento su larga scala nel ridurre l&#39;incidenza 4 e aumentando l&#39;aspettativa di vita in contesti a risorse limitate (RLS) 5 continua ad accumularsi, saranno intensificati gli sforzi per aumentare la copertura ART. L&#39;evoluzione di orientamenti verso l&#39;uso del trattamento come strumento di prevenzione 6, 7 sotto test e programmi di trattamento significa che il numero assoluto di individui in trattamento aumenterà ulteriormente. Un gran numero di persone saranno in ART per periodi di tempo più lunghi come l&#39;aspettativa di vita media degli individui su ART si avvicina a quella della popolazione infetta da HIV 8. Lo sviluppo e la trasmissione di resistenza ai farmaci HIV ha Always stato considerato una minaccia per le conquiste della ART 9-12. Pertanto, vi è la necessità per la sorveglianza ed il monitoraggio della resistenza ai farmaci più rigorosa come più individui sono avviate su ART. Test di resistenza ai farmaci genotipica (TSL) è stato utilizzato con successo nei paesi sviluppati, sia per la sorveglianza e il monitoraggio del virus HIV-1 farmaco-resistenza nei soggetti trattati con ART. In queste impostazioni, TSL è stato integrato nel continuum di cura per l&#39;HIV-1 individui infetti. La maggior parte delle linee guida internazionali raccomandano tsl per i pazienti pediatrici mancanza ART (di prima linea e di seconda linea) 13-15 adulto o, pazienti pediatrici esposti alla prevenzione della trasmissione da madre a figlio (PMTCT) regimi, ma successivamente infettati 16, e in ambienti con alti livelli di resistenza trasmessa droga tra gli individui con infezione acuta 13-15. Tuttavia, il costo, la tecnologia e infrastruttura, hanno limitato l&#39;attuazionezione di approcci simili alla droga monitoraggio della resistenza in RLS. Il trattamento South African HIV e il monitoraggio attualmente non raccomandano l&#39;uso di tsl nel guidare la scelta di ART per gli individui in mancanza di prima linea regimi 17. Gli individui sono accesi basata principalmente su parametri (carico virale di HIV-1 RNA) virologica. Tuttavia, nel 2012, il Southern African HIV clinici Society ha pubblicato le prime linee guida del Sud ARV africana test resistenza ai farmaci 18. Queste linee guida raccomandano test tsl per tutti gli adulti in mancanza di prima linea e di seconda linea ART e per i neonati infetti e bambini esposti a PMTCT 18. Tuttavia, TSL non è raccomandato 18 per gli individui con infezione acuta perché non ci sono evidenze attuali livelli elevati di resistenza ai farmaci trasmessa in Sud Africa 19-29. Si prevede che alcune di queste raccomandazioni saranno integrati nel tempo in tre nazionaliatment e monitoraggio linee guida dei vari paesi della regione. Già, in 2013 linee guida di trattamento sudafricani ora c&#39;è la raccomandazione di tsl al momento del guasto di seconda linea per gli adulti e al momento del guasto regime basato-PI-prima o seconda linea per i bambini 30. E &#39;stato dimostrato che l&#39;integrazione GRT nelle linee guida di trattamento in Sud Africa sarebbe potenzialmente costo-neutrale. Considerando il costo dei farmaci di seconda linea di regime che sono relativamente più costosi rispetto ai farmaci di prima linea, con TSL per identificare i pazienti che hanno veramente bisogno di essere passato a terapia di seconda linea non comporterà alcun costo aggiuntivo per il programma. Inoltre, GRT può anche identificare altre ragioni per il fallimento, conservare le opzioni di trattamento e generare informazioni sui modelli di resistenza emergenti 31. Pertanto, è necessario ridurre il costo di metodi di monitoraggio della farmaco resistenza ulteriormente per migliorare l&#39;accesso, la qualità delle cure und esiti. Qui, vi presentiamo un metodo GRT progettato per utilizzare generici (open source) primer per la trascrizione inversa, la reazione a catena della polimerasi (PCR) e sequenziamento (Tabella 1), così come il software open source per lo più per l&#39;interpretazione resistenza ai farmaci. Per la gestione clinica, il protocollo è accompagnato da una revisione e reporting metodo completo con l&#39;interpretazione specialista del farmaco rapporto resistenza laboratorio con stretta aderenza alle linee guida nazionali di trattamento. Il protocollo è diviso in quattro componenti differenti; 1) HIV Acido ribonucleico (RNA) Estrazione, 2) trascrizione inversa e Polymerase Chain Reaction (PCR) amplificazione di bersagli virali, 3) sequenziali e 4) metodi bioinformatici per l&#39;analisi dei cromatogrammi, allineamento, curation e l&#39;interpretazione dei dati di sequenza.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1 farmacoresistenza ha il potenziale di compromettere seriamente l&#39;efficacia e l&#39;impatto della terapia antiretrovirale (ART). Poiché i programmi ART nell&#39;Africa sub-sahariana continuano ad espandersi, gli individui su ART devono essere attentamente monitorati per la comparsa di resistenza ai farmaci. Sorveglianza della resistenza trasmessa farmaco per monitorare la trasmissione di ceppi virali resistenti ai già ART è anche critico. Purtroppo, test di resistenza ai farmaci non è ancora facilmente accessibile nelle impostazioni limitate risorse, perché la genotipizzazione è costosa e richiede sofisticate di laboratorio e infrastruttura di gestione dei dati. Un genotipica metodo di monitoraggio farmacoresistenza accesso aperto per gestire gli individui e valutare la resistenza ai farmaci trasmesso e descritta. Il metodo utilizza il software libero e open source per l&#39;interpretazione dei modelli di resistenza ai farmaci e la generazione di report dei singoli pazienti. Il protocollo genotipizzazione ha un indice di amplificazione superiore al 95% per i campioni di plasma con avcarico Iral&gt; 1,000 HIV-1 RNA copie / ml. La sensibilità diminuisce in modo significativo per carica virale &lt;1.000 copie di HIV-1 RNA / ml. Il metodo qui descritto è stato validato nei confronti di un metodo di HIV-1 resistenza Drug Testing approvata dagli Stati Uniti Food and Drug Administration (FDA), il metodo di genotipizzazione Viroseq. Limiti del metodo qui descritto comprendono il fatto che non è automatizzato e che essa non anche per amplificare la forma circolante CRF02_AG ricombinante da un gruppo di validazione di campioni, anche se amplificato sottotipi A e B dello stesso pannello.

Il metodo convalidato era una modifica di un metodo riportato in precedenza 20. Il metodo di genotipizzazione Viroseq, che è stato approvato dalla FDA, è stato utilizzato come metodo di riferimento per la convalida. Un gruppo di campioni di prova di abilità ottenuti dalle Agenzie nazionali francesi per la ricerca sull&#39;AIDS e l&#39;epatite virale (ANRS) è stato utilizzato nel confronto principale tra i due metodi. I due metodi di genotipizzazione sono state del 100% concorde nell&#39;individuare tutti clinicamente importanti mutazioni associate alla resistenza droga come interpretato dal programma HIVDB per i campioni che sono stati amplificati con successo con entrambi i metodi. Come mostrato in Tabella 6, le sequenze nucleotidiche dei tre coppie erano 99,5% identico. Le sequenze amminoacidiche predette erano identici al 100%. Un campione su cinque non poteva essere amplificato con successo da Viroseq. In aggiunta al campione non amplificato dal Viroseq, il metodo in-house omesso di amplificare un secondo campione che è stato mostratoessere un virus ricombinante circolante (CRF02_AG) da Viroseq. I tre campioni amplificati con entrambe le metodologie erano sottotipo B (due campioni) e sottotipo A (un campione). <img alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;uso di un vicino di giunzione albero HKY fatto come parte della garanzia della qualità sequenza. Ci sono quattro coppie / gruppi di sequenza con distanze molto brevi genetiche. La distanza genetica tra RES655 e RES655_1 (stessi campioni sequenziati in giorni diversi) è 0.003. Il è un potenziale errore con la coppia RES637_1/RES638 come la loro distanza genetica è troppo breve (0.075) per i campioni provenienti da diversi individui epidemiologico scollegate. C&#39;è un altro RES637 sull&#39;albero con una distanza di 0,075 rispetto al RES638_1. Il cluster CQ01/CQ02 suggerisce che i due campionidal pannello sono duplicati dello stesso campione. Essi raggruppano insieme alla sequenza di riferimento sottotipo B confermando il sottotipo assegnato dallo strumento REGA Subtyping. CQ05 e CQ04 raggruppati con sottotipi A e G, rispettivamente, considerando che lo strumento REGA subtyping li ha classificati come A e CRF02_AG rispettivamente. Un altro strumento utile per subtyping HIV e ricombinazione è SCUEL, che è disponibile a http://www.datamonkey.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Un gruppo di cinque campioni è stato utilizzato per valutare la precisione del metodo in house. Dieci genotipi replicati sono stati generati per ciascuno dei cinque campioni. Utilizzando l&#39;analizzatore genetico 16 Capillare 3130xl, 48 dei 50 genotipi sono stati generati da 24 piste, preparate lo stesso giorno. Per tutti i cinque campioni, le sequenze amminoacidiche predette erano 100% concorde tra replicati. Per le sequenze di acido nucleico, there era&gt; 99% di somiglianza a coppie. Durante i primi due anni di utilizzo di questo metodo, sessanta campioni sono stati ripetuti in modo casuale da estrazione di RNA a sequenziamento. Non ci sono state differenze statisticamente significative tra il punteggio di qualità sequenza e il numero di basi misti tra le repliche. Sia il nucleotidiche e amminoacidiche confronti a coppie per i sessanta coppie erano superiore al 99% identico. Così le mutazioni di farmacoresistenza per tutte le coppie erano 100% concorde. Riduzione dei costi I volumi di reazione di RT, PCR e sequenziamento sono stati ridotti di almeno la metà, rispetto al metodo originale 20, 32, senza compromettere la qualità delle sequenze generate. Ciò ha consentito una riduzione dei costi del 50% per le fasi RT e PCR. Il nuovo metodo è stato originariamente progettato per funzionare con sei sequenziamento primer sequenza<html> tutti i 99 codoni del gene della proteasi e le prime 300 codoni della trascrittasi inversa gene 20, 32. Metodi simili usano anche sei a otto iniettori 33, 34. Alcuni metodi recentemente pubblicati hanno utilizzato meno di sei primer, anche se a volte il sequenziamento dei geni della proteasi e RT seprately 35, 36. Si è cercato di ridurre il numero di primer di sequenziamento da sei a quattro, (figura 6) <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> Figura 6. Confronto di sequenze contigue sei confrontarli quattro primer di sequenziamento per la generazione della sequenza pol 1197 bp che copre tutti i 99 HIV-1 proteasi codoni e le prime 300 codoni del gene trascrittasi inversa.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. Sequenze di una serie di 17 campioni generati da sei inneschi sono stati confrontati con sequenze generate dopo l&#39;esclusione di due primer (MAW46 e RTY). I sottotipi erano 14 sottotipo C, due sottotipo B, e un sottotipo A. Non ci sono state differenze significative nei punteggi di qualità sequenza. Ancora una volta, l&#39;identità pairwise media tra le 17 coppie di acido nucleico è stata del 99% e il 100% sul livello amminoacidico. Così, riducendo i primer di sequenziamento da sei a quattro determinato una riduzione del costo sequenziamento di quasi un terzo. L&#39;unico strumento software proprietario utilizzato in questo protocollo è stato Geneious per l&#39;assemblaggio sequenza. Gli strumenti di interpretazione farmaco-resistenza, nonché la relazione di generare strumenti sono tutti gratuiti, strumenti di accesso aperto. Questo riduce il costo ulteriore eliminando i costi associati con l&#39;uso di software proprietario. Inoltre, collective negoziazione ha consentito i reagenti per questo protocollo da confezionare in un kit per un facile accesso da Life Technologies ed è disponibile come Saturn / Life Technologies metodo 37 genotipizzazione. Inoltre, i membri Saturno può accedere ai reagenti ad un prezzo scontato. Ambito Clinico Il protocollo descritto è stato implementato il monitoraggio e la sorveglianza della resistenza ai farmaci in una comunità rurale in KwaZulu-Natal. Un totale di 604 genotipi sono stati generati da campioni clinici tra dicembre 2010 e maggio 2013 con un tasso di amplificazione del 95% per i campioni con carica virale&gt; 1.000 RNA copie / ml. Questo studio clinico di HIV farmaco-resistenza è stato approvato dal Comitato Etico di Ricerca Biomedica dell&#39;Università di KwaZulu-Natal (rif. BF052/10) e il Comitato Health Research del Dipartimento di KwaZulu-Natal della Salute (rif. HRKM 176/10). Relazioni dei singoli pazienti sono stati generati e rispediti alle clinicheper la gestione del paziente. Settantadue (72) genotipi sono stati generati come parte di una sorveglianza della resistenza ai farmaci trasmessa studio, annidati all&#39;interno di un ampio studio prospettico di sorveglianza HIV basato sulla popolazione. I campioni primari erano l&#39;ago puntura sangue intero raccolto in microtubi EDTA. Al genotipizzazione c&#39;era un tasso di amplificazione di 79% 19. Approvazione etica per la genotipizzazione di campioni dallo studio di sorveglianza è stato ottenuto presso l&#39;Università di KwaZulu-Natal Ricerca Biomedica Comitato Etico (rif. BE066107). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome Primer </td><td> Sequenza </td><td> Lunghezza </td><td> Direzione </td><td> Posizione HXB2 </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Avanti </td><td> 2028-2050 </td><td> 1 ° Turno PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Reverse </td><td> 3539-3509 </td><td> 1 ° Turno PCR </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC cacca </td><td> 20 </td><td> Avanti </td><td> 2147-2166 </td><td> Turno PCR seconda </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 3462-3441 </td><td> Turno PCR seconda </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Avanti </td><td> 2486-2508 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Reverse </td><td> 2630-2604 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Avanti </td><td> 2956-2994 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Reverse </td><td> 3129-3101 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 2967-2946 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Avanti </td><td> 2251-2277 </td><td> Sequencing </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Trascrizione, PCR e sequenziamento primer personalizzati utilizzati nella generazione di un frammento di 1197 bp pol copre tutti i 99 HIV-1 proteasi codoni e le prime 300 codoni del gene trascriptase inversa inverse. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. dNTP / Primer miscela per la reazione di trascrizione inversa. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) / reazione </td><td> Concentrazione / reazione </td></tr><tr><td> First Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mm) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Apice III trascrittasi inversa (200U/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Enzima miscela per la reazione di trascrizione inversa. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) / reazione </td><td> Concentrazione Finale / Reazione </td></tr><tr><td> DEPC acqua trattata </td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> PCR Buffer (10x) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MGCI 2 (50 mm) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> miscela dNTP (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Primer Froward (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Primer reverse (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq Polymerase (5 U / ml) </td><td> 0.1 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> Totale parziale </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Master mix per la nested PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) / reazione </td><td> Concentrazione / reazione </td></tr><tr><td> DEPC acqua trattata </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Sequencing Buffer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3.2 pmol / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td> Big Dye terminator mix Sequencing </td><td> 0.4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 5. Master mix per le reazioni di sequenziamento. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Viroseq </td><td align="center" colspan="4"> Inhouse </td><td rowspan="2"> % NA somiglianza </td></tr><tr><td> ID campione </td><td> Sottotipo </td><td> Punteggio di qualità </td><td> PR Mutazioni </td><td> Mutazioni RT </td><td> Sottotipo </td><td> Punteggio di qualità </td><td> Mutazioni PR </td><td> RT Mutazioni </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99.9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> La </td><td> 99,7 </td><td></td><td> K103N </td><td> La </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabella 6. Resul comparativats da una analisi parallela tra il metodo di genotipizzazione Viroseq e il metodo internamente con un pannello di campioni forniti dal ANRS.

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Test di resistenza ai farmaci per l&#39;HIV-1 individui infetti in mancanza di terapia antiretrovirale (ART) in grado di guidare le terapie future e migliorare i risultati del trattamento. Ottimizzazione dei singoli e della popolazione esiti di salute in alta prevalenza di HIV, ma a risorse limitate in ultima analisi richiederà conveniente e accessibile genotipizzazione resistenza ai farmaci e metodi di interpretazione.

Un metodo di monitoraggio Affordable HIV-1 resistenza ai farmaci per le impostazioni limitate risorse

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

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Medicine

18.4K Views.  University of KwaZulu-Natal, Durban, South Africa.  Test di resistenza ai farmaci per l'HIV-1 individui infetti in mancanza di terapia antiretrovirale (ART) in grado di guidare le terapie future e migliorare i risultati del trattamento. Ottimizzazione dei singoli e della popolazione esiti di salute in alta prevalenza di HIV, ma a risorse limitate in ultima analisi richiederà conveniente e accessibile genotipizzazione resistenza ai farmaci e metodi di interpretazione. 

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Metodo per Novel Anti-Cancer Drug Development utilizzando Espianti Tumore di campioni chirurgici


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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Medicina

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una retina Protesi per Localized istopatologico Analysis: Part 2 epiretinica impianti con retina aderenze

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance saggi: massimizzare il potenziale per scoprire clinicamente rilevanti Resistenza Meccanismi

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

Bioluminescenza-Based Metodo Tumore quantificazione per il monitoraggio del tumore Progressione e gli effetti del trattamento in modelli murini linfoma

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, pancreatitis, and pancreatic cancer. All three of these diseases mark active areas of study, not only to develop immediate therapy, but also to better understand their pathophysiology. There are few tools to further these areas of study. Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. The technique requires the intricate dissection of the second portion of the duodenum and ampulla, followed by the occlusion of the bile duct and the cannulation of the pancreatic duct. Although the technique is technically challenging at first, the applications are myriad. Ambiguity in the specifics of the procedure between groups highlighted the need for a standard protocol. This work describes the expression of a green fluorescent protein (GFP) within the pancreas after the pancreatic duct infusion of a viral vector expressing GFP versus a sham surgery. The infusion and therefore expression is specific to the pancreas, without expression present in any other tissue type.

Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. A pancreatic duct infusion technique for drug and viral delivery to pancreatic cells is presented here.

Infusione del dotto pancreatico: un metodo efficace e selettivo di somministrazione di farmaci e virus

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...