Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell&#39;Istituto Ontario di Ricerca sul Cancro (# 08NOV230), la Fondazione canadese per l&#39;innovazione (# 13199), Cancro alla prostata Canada, Janssen Oncologia, il Cancer Program Regionale di Londra, e il sostegno dei donatori da Giovanni e Donna Bristol attraverso il London Health Sciences Foundation (a ALA). LEL è supportato da un Frederick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship Award di dottorato. ALA è supportato da un CIHR New Investigator Award e un ricercatore Award anticipata dal Ministero della Ricerca e Innovazione Ontario.

Tutti gli studi umani descritti in questo manoscritto sono state effettuate secondo protocolli approvati da Research umano Comitato Etico della Western University. Tutti sono stati condotti studi su animali in conformità con le raccomandazioni del Consiglio canadese per la cura degli animali, secondo protocolli approvati dalla Western University uso di animali sottocommissione. 1. Standard CTC Enumeration da paziente campioni di sangue Utilizzo del CSS 1. Sangue umano Raccolta dei campioni e preparazione per la trasformazione in strumento di preparazione <ol><li> Utilizzando tecniche salasso standard di asepsi, disegnare un minimo di 8,0 ml di sangue umano in una provetta CellSave 10 ml (di seguito denominato il tubo conservanti CTC), che contiene etilene acido diaminetetraacetic (EDTA) e un conservante cellulare proprietaria. Invertire le 5x tubo per impedire la coagulazione del sangue. I campioni possono essere trattati immediatamente o conservate a temperatura ambiente per un massimo di 96 ore. </li><li> Removreagenti e CSS dal frigo e lasciare che raggiungano la temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Usando una pipetta monouso 10 ml e pipetta automatizzata, raccogliere 7,5 ml di sangue dal tubo conservante CTC e lentamente dispensare il sangue in un tubo preparazione trasformazione strumento adeguatamente etichettati. </li><li> Aggiungere 6,5 ml di tampone di diluizione per ogni campione. Miscelare capovolgendo campione 5x. Campione centrifugare a 800 xg per 10 min con il freno in posizione &quot;off&quot;. Seguire le istruzioni sullo schermo sullo strumento di preparazione per caricare tutti i campioni dei pazienti nel sistema per l&#39;elaborazione. I campioni devono essere trattati entro 1 ora di preparazione. </li></ol> 2. Preparazione di controllo per la trasformazione in strumento di preparazione <ol><li> Vortice delicatamente il flacone di controllo e capovolgere 5x per mescolare. </li><li> Rimuovere con cautela il tappo dal flacone di controllo e inserire una preparazione tubo di elaborazione dello strumento capovolta sulla parte superiore del flaconcino scoperchiato. In un movimento rapido, invertire lacontrollare la fiala e versare il contenuto nel tubo di elaborazione. Mentre rovesciata, sfiora delicatamente i lati del flacone di controllo per rilasciare eventuali contenuti residui. </li><li> Rimuovere con attenzione il flacone di controllo invertita dal tubo di elaborazione, assicurando che nessun liquido si perde e mettere da parte. Usando una pipetta di 1.000 ml, raccogliere tutti i restanti contenuti della fiala e coperchio e pipettare delicatamente nel tubo di elaborazione. </li><li> Seguire le istruzioni sullo schermo sullo strumento di preparazione per caricare il controllo sul sistema per l&#39;elaborazione. </li></ol> 3. Scansione del campione sullo strumento di analisi <ol><li> Seguire le istruzioni sullo schermo sullo strumento di preparazione per scaricare tutti i campioni dal sistema. Cap Liberamente ogni cartuccia dispositivo magnetico e toccare il dispositivo magnetico con le mani o banco di laboratorio per liberare eventuali bolle che sono bloccati ai bordi della cartuccia. Una volta che tutte le bolle sono state rimosse, tappare bene la cartuccia, stesi il dispositivo magnetico piatto, e honcubate al buio per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. I campioni devono essere analizzati entro 24 ore di preparazione. </li><li> Accendere l&#39;analizzatore e inizializzare la lampada. Una volta riscaldato (~ 15 min), caricare la cartuccia verifica del sistema sullo strumento di analisi e selezionare la scheda di test QC. Seguire le istruzioni sullo schermo per eseguire le necessarie misure di controllo di qualità. </li><li> Caricare un campione sullo strumento di analisi e selezionare la scheda test del paziente. Verrà visualizzato tutte le informazioni salvate dallo strumento di preparazione. Fare clic su Start per inizializzare la scansione del campione. Il sistema esegue un fuoco grossolana e rilevamento dei bordi sulla cartuccia dispositivo magnetico. </li><li> Regolare tutti i bordi se necessario utilizzando i tasti direzionali. Selezionare Accetta. Il sistema effettuerà un bel fuoco e avviare la scansione del campione. </li><li> Dopo il controllo la scansione dei risultati deve essere convalidato utilizzando i criteri definiti per le celle a spillo ad alta (CK + DAPI + CD45 - APC +) e bassa (CK + DAPI + CD45 - FITC +) concentrazioni. A seguito di campione del paziente scansione dei risultati dovrebbe essere riesaminata per CTC catturati utilizzando i criteri definiti CTC (CK + DAPI + CD45 -). </li></ol> 2. CTC Caratterizzazione di marcatori definiti dall&#39;utente utilizzando il CSS 1. Preparazione di marcatori definiti dall&#39;utente e strumento inizializzazione <ol><li> Diluire l&#39;anticorpo di interesse utilizzando legame primario diluente alla concentrazione desiderata in una tazza reagente marcatore utilizzando la seguente formula, in cui la concentrazione di lavoro è la concentrazione dell&#39;anticorpo dopo l&#39;aggiunta al campione e la concentrazione di calcio è la concentrazione di anticorpo nel Coppa del reagente. Per i più campioni, regolare i volumi di anticorpi, come descritto nella tabella 1. Posizionare la tazza reagente marcatore nella posizione 1 nella cartuccia reagenti e load la cartuccia su CSS. Archivio Concentrazione = (concentrazione di lavoro x 850 microlitri) / 150 ml </li><li> Raccogliere il sangue, preparare i campioni, e caricare lo strumento di preparazione come descritto nel precedente standard CTC Enumeration da paziente campioni di sangue usando il protocollo CSS. Per attivare marcatore Inoltre personalizzato, selezionare Definito dall&#39;utente Assay quando richiesto dallo strumento di preparazione. Immettere il nome del marcatore e selezionare Salva. Come i campioni vengono caricati sullo strumento, l&#39;operatore verrà richiesto di indicare quale dovrebbe ricevere marcatore personalizzato selezionando Sì o No, se necessario. </li></ol> 2. Esempio di scansione di marcatori definiti dall&#39;utente sullo strumento di analisi <ol><li> Accendere lo strumento di analisi, inizializzare la lampada, ed eseguire il controllo di qualità e verifica del sistema, come descritto nella Sezione 3.2 del CTC Enumeration standard da paziente campioni di sangue usando il CSS </strong&gt; protocollo. </li><li> Caricare un campione sullo strumento di analisi e selezionare la scheda Impostazione. Per inizializzare il canale FITC, selezionare CellSearch CTC come ID Kit nella sezione Test di protocolli. Da questo menu, selezionare CTC ricerca, fare clic sul pulsante Modifica e impostare il tempo di esposizione, se lo desideri. Si raccomanda un tempo di esposizione di 1.0 sec non superare quando si utilizza il kit CSS CTC come questo può aumentare sanguinare-through in altri canali fluorescenti utilizzati per l&#39;identificazione CTC. </li></ol> 3. Adattamento del CSSProtocol standard per l&#39;uso in modelli preclinici mouse ** Adattato da Veridex Mouse / Rat CellCapture Kit (non più disponibile in commercio) 1. Raccolta di sangue Mouse e bagagli <ol><li> Prima della raccolta del sangue, corrono ~ 30 ml di 0,5 M EDTA avanti e indietro attraverso un ago G 22, lasciando una piccola quantità di EDTA nel mozzo. </li><li>Raccogliere un minimo di 50 ml di sangue del mouse da topi precedentemente iniettate cellule tumorali umane attraverso vie ortotopici, coda vena, o intracardiaci. Raccogliere il sangue dalla vena safena (per l&#39;analisi seriale CTC) o mediante puntura cardiaca (per terminale analisi CTC). Rimuovere l&#39;ago e distribuire il sangue in una provetta con EDTA Microtainer raccolta del sangue 1 ml. Miscelare per inversione o il tubo dolcemente flick per prevenire la coagulazione del sangue. Il sangue può essere elaborato immediatamente o conservato a temperatura ambiente fino a 48 ore dopo l&#39;aggiunta di un volume uguale di CytoChex conservante cellulare. </li></ol> 2. CTC arricchimento <ol><li> Rimuovere i reagenti CSS dal frigorifero e lasciare che raggiungano la temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Trasferire l&#39;equivalente di 50 ml di sangue intero per un flusso x 75 mm 12 millimetri citometria tubo. Aggiungere 500 microlitri di tampone di diluizione per ogni campione, lavando giù qualsiasi sangue che rimane sui lati del tubo. Se necessario, una breve centrifuga centrifugapuò essere utilizzato per raccogliere il sangue residuo. </li><li> Vortice delicatamente il ferrofluido anti-EpCAM e aggiungere 25 microlitri di ciascun campione posizionando la punta della pipetta direttamente nel campione. Aggiungere 25 ml di reagente Valorizzazione Capture e vortice delicatamente per mescolare. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Mettere provette nel magnete e incubare per 10 min. Mentre provette sono ancora nel magnete, utilizzare una pipetta di vetro per aspirare accuratamente il liquido residuo senza toccare la parete del tubo vicino al magnete e scartare. </li></ol> 3. CTC colorazione <ol><li> Rimuovere le provette dal magnete e risospendere in 50 ml di acidi nucleici Dye, 50 ml di colorazione reagente, 1,5 ml di anti-topo CD45-APC, 5.0 ml di anti-umano HLA-Alexa Fluor 488, e 100 ml di Permeabilization reagente. Per campioni multipli, questi reagenti possono essere premiscelati e 206,5 ml di miscela possono essere aggiunti in ogni provetta. Vortex delicatamente per miscelaree incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Aggiungere 500 ml di tampone di diluizione, vortice delicatamente, provette posto nel magnete, e incubare per 10 min. Mentre provette sono ancora nel magnete, utilizzare una pipetta di vetro per aspirare accuratamente il liquido residuo senza toccare la parete del tubo vicino al magnete e scartare. Rimuovere le provette dal magnete e risospendere in 350 ml di tampone di diluizione. Vortex delicatamente per mescolare. </li></ol> 4. Magnetic Carica <ol><li> Utilizzando una punta di caricamento del gel, trasferire accuratamente l&#39;intero volume dal tubo campione in una cartuccia nel dispositivo magnetico. Inizia nella parte inferiore della cartuccia e ritirare lentamente la punta come il campione viene erogato. </li><li> Una volta che l&#39;intero campione è stato trasferito, tappare bloccare la cartuccia dispositivo magnetico e toccare il dispositivo magnetico con le mani o banco di laboratorio per liberare eventuali bolle che sono bloccati ai bordi della cartuccia come descritto nella Section 3.1 del CTC Enumeration standard da paziente campioni di sangue usando il CSS. </li><li> Pop eventuali bolle utilizzando una sterile 22 ago G intrappolando tra lo smusso e il bordo della cartuccia. Una volta che tutte le bolle sono stati rimossi, ricoprire con fermezza la cartuccia, porre il dispositivo magnetico piatto, e incubare al buio per almeno 10 min. I campioni devono essere analizzati entro 24 ore di preparazione. </li></ol> 5. Scansione dei campioni separati manualmente sullo strumento di analisi <ol><li> Accendere lo strumento di analisi, inizializzare la lampada, ed eseguire il controllo di qualità e verifica del sistema, come descritto nella Sezione 3.2 del CTC Enumeration standard da paziente campioni di sangue utilizzando il protocollo CSS. </li><li> Caricare il campione attraverso lo strumento di analisi e selezionare la scheda Impostazione. Cancellare tutti i dati esistenti sul tasto dati del dispositivo magnetico facendo clic sul pulsante Formato Sample. Attivare il canale di FITCnd impostare il tempo di esposizione di 1.0 sec come descritto nella Sezione 2.2 della CTC Caratterizzazione di marcatori definiti dall&#39;utente utilizzando il CSS. </li><li> Fare clic sulla scheda Test Paziente e selezionare Modifica per inserire le informazioni sul campione. Selezionare CellSearch CTC come ID Kit e CTC ricerca come protocollo di test. Inserire il restante informazioni necessarie come indicato come l&#39;asterisco. Salvare le informazioni campione e fare clic su Avvia. </li></ol>

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	<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> 63 (1), 11-30 (2013).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li><li>Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+at+each+follow-up+time+point+during+therapy+of+metastatic+breast+cancer+patients+predict+progression-free+and+overall+survival.">Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival.</a> Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).</li><li>Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+versus+imaging--predicting+overall+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).</li><li>Olmos, D., Arkenau, H. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cell+(CTC)+counts+as+intermediate+end+points+in+castration-resistant+prostate+cancer+(CRPC):+a+single-centre+experience.">Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience.</a> Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).</li><li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> J. Oncol. 2010, 426218 (2010).</li><li>Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry+analysis+of+circulating+tumor+cells.">Image cytometry analysis of circulating tumor cells.</a> Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).</li><li>Lianidou, E. S., Markou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+breast+cancer:+detection+systems,+molecular+characterization,+and+future+challenges.">Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges.</a> Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+liquid+biopsy+of+cancer.">Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer.</a> Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).</li><li>Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+development+of+circulating+tumor+cell+technology+for+clinical+use.">Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use.</a> J. Transl. Med. 10, 138 (2012).</li><li>Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-defined+protein+marker+assay+development+for+characterization+of+circulating+tumor+cells+using+the+CellSearch+system.">User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system.</a> Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).</li><li>Fehm, T., M&#252;ller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+status+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+breast+cancer:+a+prospective,+multicenter+trial.">HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial.</a> Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).</li><li>Liu, Y., Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+HER2-positive+metastatic+breast+cancer+patients:+a+valuable+prognostic+and+predictive+biomarker.">Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker.</a> BMC Cancer. 13, 202 (2013).</li><li>Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2.">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).</li><li>Marty, M., Cognetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+phase+II+trial+of+the+efficacy+and+safety+of+trastuzumab+combined+with+docetaxel+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-positive+metastatic+breast+cancer+administered+as+first-line+treatment:+the+M77001+study+group.">Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group.</a> J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).</li><li>Slamon, D., Eiermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+trastuzumab+in+HER2-positive+breast+cancer.">Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).</li><li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo.">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).</li><li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry.">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).</li><li>Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC Cancer. 12, 178 (2012).</li><li>Eliane, J. -. P., Repollet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+serial+changes+in+circulating+human+breast+cancer+cells+in+murine+xenograft+models.">Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models.</a> Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).</li><li>Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+yield+of+circulating+tumour+cells+facilitates+molecular+characterisation+and+recognition+of+discordant+HER2+amplification+in+breast.">Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast.</a> 102 (10), 1495-1502 (2010).</li><li>Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+circulating+tumor+cells+in+large+quantities+of+contaminating+leukocytes+by+a+multiplex+real-time+PCR.">Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR.</a> Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).</li><li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+circulating+tumor+cells+to+tumor+response,+progression-free+survival,+and+overall+survival+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer.">Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).</li><li>Allard, W. J., Matera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).</li><li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li><li>Yang, J., Weinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Epithelial-mesenchymal+transition:+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis.">A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).</li><li>Gradilone, A., Raimondi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+lacking+cytokeratin+in+breast+cancer:+the+importance+of+being+mesenchymal.">Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).</li><li>K&#246;nigsberg, R., Obermayr, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+EpCAM+positive+and+negative+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer+patients.">Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients.</a> Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).</li><li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells.">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li><li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

L&#39;autore (ALA) ha ricevuto un finanziamento che è stato fornito da Janssen Oncologia, la cui casa madre Johnson &amp; Johnson detiene inoltre Janssen Diagnostics LLC, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Nonostante lo sviluppo di molte nuove tecnologie CTC dopo l&#39;introduzione del CSS nel 2004, questa tecnica è ancora l&#39;unica tecnologia clinicamente approvato oggi sul mercato e, pertanto, è considerato il gold standard attuale per la rilevazione CTC e l&#39;enumerazione. Questo manoscritto ha dimostrato che, sebbene il CSS ha standard rigoroso controllo di qualità può essere soggetto a bias di interpretazione e che l&#39;identificazione CTC nei campioni dei pazienti è molto diverso da identificazione in camp...

Nel 2013 si stima che 580.350 persone muoiono di cancro e che i 1.660.290 nuovi casi di questa malattia viene diagnosticata in solo 1 negli Stati Uniti. La maggior parte di questi decessi si verifica in seguito allo sviluppo della malattia metastatica 2. L&#39;attuale mancanza di terapie efficaci nel trattamento di metastasi e di una comprensione limitata della cascata metastatica rende questo stadio della malattia altamente letale. La presenza di cellule tumorali circolanti (CTC) nel sangue sono stati dimostrati correlati con malattia metastatica 3. Queste cellule sono estremamente rari e la loro individuazione è indicativa di sopravvivenza globale in seno metastatico 4, 5 prostata e del colon-retto 6 cancro. In questi pazienti, la presenza di ≥ 5 (seno e prostata) o ≥ 3 (colon-retto) CTC in 7,5 ml di sangue è indice di prognosi peggiore rispetto ai pazienti con meno o nessun CTC rilevabili nelle samil volume e il sangue. Inoltre, la variazione del numero CTC durante o dopo l&#39;intervento terapeutico è stato dimostrato per essere utile come predittore di risposta al trattamento, spesso prima di tecniche attualmente utilizzate 7-10. È stato stimato che, in pazienti tumorali metastatiche, CTC verificano ad una frequenza di circa 1 a 10 CTC 5 -10 7 cellule mononucleate del sangue e in pazienti con malattia localizzata, questa frequenza può essere anche inferiore (~ 1 in 10 8). La natura rara di queste cellule può rendere difficile accurato e affidabile rilevare e analizzare CTC 11. Diversi metodi (recensito in precedenza 12-14) sono state utilizzate per arricchire e rilevare queste cellule sfruttando le proprietà che li differenziano dai circostante componenti del sangue. In generale, CTC enumerazione è un processo a due fasi che richiede sia una fase di arricchimento e una fase di rivelazione. Tradizionalmente, passaggi di arricchimento si basano su differenze di educazione fisicaProprietà iCal di CTC (dimensioni delle cellule, la densità, deformabilità) o sull&#39;espressione proteina marker (cioè di adesione delle cellule epiteliali molecola [EpCAM], citocheratina [CK]). Seguendo arricchimento, rilevazione CTC può essere eseguita in vari modi diversi, il più comune dei quali sono saggi a base di acido nucleico e / o approcci citometria. Ognuna di queste strategie sono uniche, avendo vantaggi e svantaggi, ma tutti mancano normalizzazione; una necessità per l&#39;ingresso in ambito clinico. Il sistema CellSearch (CSS) è stato quindi sviluppato per fornire un metodo standardizzato per il rilevamento e l&#39;enumerazione di rari CTC nel sangue umano usando la microscopia a fluorescenza e le tecniche di base di anticorpi 4-6. Questa piattaforma è attualmente considerato il gold standard nella CTC enumerazione ed è l&#39;unica tecnica approvato dalla US Food and Drug Administration (FDA) per l&#39;uso in clinica 15. Il CSS è una piattaforma a due COMPOSTE componentig, (1) il sistema CellTracks AutoPrep (di seguito denominato come strumento di preparazione), che automatizza la preparazione dei campioni di sangue umano, e (2) la CellTracks Analyzer II (di seguito indicato come strumento di analisi), che analizza questi campioni dopo la preparazione. Per distinguere CTC di contaminare leucociti strumento di preparazione impiega un anticorpo mediata, approccio separazione magnetica a base di ferrofluido-differenziale e la colorazione in fluorescenza. Inizialmente, il sistema etichette CTC utilizzando anticorpi anti-EpCAM coniugati a nanoparticelle di ferro. Il campione viene quindi incubato in un campo magnetico, e tutte le cellule non marcate vengono aspirati. Cellule tumorali selezionate vengono risospese e incubate in una macchia fluorescenza differenziale, costituito anticorpi di fluorescenza marcata e un reagente colorazione nucleare. Infine, il campione viene trasferito in una cartuccia magnetica, chiamato MagNest (di seguito denominato il dispositivo magnetico), e scanned usando lo strumento di analisi. Lo strumento di analisi è utilizzato per la scansione di campioni preparati usando diversi filtri di fluorescenza, ciascuno ottimizzato alla particella fluorescente appropriato, utilizzando una lente obiettivo 10X. CTC sono identificati come cellule che sono vincolati da anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, e 19), e la macchia nucleare 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Al contrario, leucociti contaminanti vengono identificati come cellule che sono vincolati da anti-CD45-allophycocyanin (APC) e DAPI. Seguendo la scansione, potenziali cellule tumorali informatici definiti vengono presentati all&#39;utente. Da queste immagini, l&#39;utente deve impiegare analisi qualitativa utilizzando i parametri definiti e colorazione differenziale discussi sopra per determinare quali eventi sono CTC. Oltre a fornire un metodo standardizzato per CTC enumerazione, il CSS permette per la caratterizzazione molecolare delle CTC sulla base di marcatori proteici di interesse. Questo interrogatorio cun essere effettuata a livello di singola cellula, utilizzando un isotiocianato di fluoresceina (FITC) canale di fluorescenza non richiesto per l&#39;identificazione CTC 16. Sebbene questa piattaforma fornisce la capacità di caratterizzazione molecolare, il processo dettagliato di protocollo di sviluppo e ottimizzazione non è ben definito. Tre marcatori disponibili in commercio sono stati sviluppati dal costruttore per l&#39;utilizzo con il CSS, compreso il fattore di crescita epidermico (EGFR), fattore di crescita epidermico umano del recettore 2 (HER2), e insulin-like growth factor 1 recettore (IGF-1R). Analisi HER2, in combinazione con il CSS, è stato utilizzato da diversi gruppi per illustrare il potenziale per la caratterizzazione CTC informare decisionale clinico e cambiare potenzialmente linee guida di trattamento esistenti. Ad esempio, Fehm et al. 17 dimostrato che circa un terzo dei pazienti con carcinoma mammario con tumori HER2-primario aveva HER2 + CTC. Inoltre, Liu et al.18 recentemente riportato che fino al 50% dei pazienti con HER + carcinoma mammario metastatico non ha avuto HER2 + CTC. Herceptin, un recettore HER2 interferire anticorpo monoclonale dimostrato di trarre enormi benefici pazienti i cui tumori esprimono sufficienti livelli di HER2, è un trattamento comunemente utilizzati per i pazienti con HER2 + tumori primari 19-21. Tuttavia, questi studi suggeriscono che Herceptin può essere essendo sub-ottimale utilizzati e che la caratterizzazione CTC può essere di aiuto nel predire la risposta al trattamento. In ultima analisi, caratterizzazione CTC può avere il potenziale per migliorare la cura personalizzata. La ricerca CTC è unico in quanto ha in gran parte utilizzato un approccio capezzale a banco. Questo metodo, a differenza di banco-to-capezzale di ricerca, che spesso può richiedere anni per urtare la cura del paziente, ha permesso CTC rapida entrata in ambito clinico. Tuttavia, i medici sono riluttanti a utilizzare i risultati dell&#39;analisi CTC nel trattamento dei pazienti dei processi decisionalizione a causa di una mancanza di comprensione della loro biologia sottostante. Pertanto appropriati modelli preclinici murini di tecniche di metastasi e complementari analisi CTC devono essere utilizzati al fine di indagare su queste questioni in sospeso. In generale, esistono due tipi di modelli preclinici utilizzati per studiare la cascata metastatica, (1) modelli metastasi spontanea, che permettono lo studio di tutti i passaggi della cascata metastatica, e (2) modelli metastasi sperimentali, che consentono soltanto lo studio delle successive fasi del processo metastatico come stravaso e formazione del tumore secondario 22. Modelli metastasi spontanee, coinvolgono iniezioni di cellule tumorali in opportune sedi ortotopico (ad esempio iniezione di cellule tumorali della prostata nella prostata per lo studio del cancro alla prostata). Le cellule sono poi dato tempo per formare tumori primari e spontaneamente metastatizzare siti secondari come l&#39;osso, polmone e linfonodi. Incontrasto, modelli metastasi sperimentali implicano l&#39;iniezione diretta di cellule tumorali nel sangue (ad esempio via vena caudale o iniezione intracardiaca per indirizzare le cellule a posizioni specifiche) e quindi saltare le fasi iniziali di intravasation e diffusione di organi secondari 22. Finora la maggior parte delle analisi CTC in in vivo sistemi modello è stato eseguito utilizzando sia basato citometria-23 o adattate tecniche CTC basato umane (ad es AdnaTest) 24. Anche se utile, nessuna di queste tecniche riflette adeguatamente CTC censimento utilizzando il CSS gold standard. Sulla base del riconoscimento clinico, natura standardizzata, e l&#39;utilizzo diffuso di CSS, lo sviluppo di una cattura e rilevazione tecnica CTC in vivo modellazione che utilizza preparazione del campione equivalente, elaborazione e criteri di identificazione sarebbe vantaggiosa risultati sarebbero paragonabili a quelli ottenuti da campioni di pazienti. Tuttavia, a causa del volume di requirements dello strumento preparazione non è possibile realizzare piccoli volumi di sangue usando questa piattaforma automatizzata. . Inoltre, il lavoro precedente di Eliane et al 25 ha dimostrato che la contaminazione dei campioni con le cellule epiteliali del mouse (che soddisfano anche la definizione standard CTC [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) può portare ad errori di classificazione delle cellule epiteliali squamose del mouse come CTC. Per affrontare questi problemi una tecnica adattata che permette l&#39;utilizzo del kit reagenti CSS CTC unita ad una procedura di isolamento manuale è stato sviluppato. L&#39;aggiunta di un FITC marcato antigene leucocitario umano (HLA) anticorpo per il saggio permette alle cellule tumorali umane di distinguerli da cellule epiteliali squamose mouse. Questo manoscritto descrive lo standard, sviluppata commercialmente e il protocollo CSS ottimizzato per la lavorazione di campioni di sangue e le insidie ​​più comuni che si possono riscontrare, tra cui discrepanzeelementi t che possono portare ad errori di classificazione CTC. Inoltre, la personalizzazione del dosaggio CSS esaminare caratteristiche proteiche definite dall&#39;utente CTC catturate e una tecnica analoga CSS adattato che permette l&#39;arricchimento e rilevamento delle CTC da piccoli volumi di sangue in modelli preclinici murini di metastasi sono descritti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

La maggioranza dei decessi per cancro si verifica in seguito allo sviluppo della malattia metastatica. Questa fase malattia altamente letale è associata con la presenza di cellule tumorali circolanti (CTC). Queste cellule rare hanno dimostrato di essere clinicamente significativa in seno metastatico, della prostata e del colon-retto. Il gold standard attuale in clinica rilevazione CTC ed enumerazione è il sistema CellSearch approvato dalla FDA (CSS). Questo manoscritto descrive il protocollo standard utilizzato da questa piattaforma nonché due protocolli adattati aggiuntive che descrivono il processo dettagliato di ottimizzazione marcatore definito dall&#39;utente per la caratterizzazione di proteine ​​CTC paziente e un protocollo paragonabile per la cattura CTC molto bassi volumi di sangue, utilizzando lo standard reagenti CSS, per lo studio in vivo modelli preclinici murini di metastasi. Inoltre, differenze di qualità tra CTC sangue donatore sano addizionati con cellule di coltura tissutale rispetto paziente samp sangueles sono evidenziati. Infine, diversi oggetti comunemente discrepanti che possono portare ad errori di classificazione CTC sono delineati. Presi insieme, questi protocolli forniranno una risorsa utile per gli utenti di questa piattaforma interessati alla ricerca preclinica e clinica di pertinenza di metastasi e CTC.

Standard CTC Enumerazione Assay La sensibilità e la specificità del CSS è stata ben documentata in letteratura. Tuttavia, per validare il recupero CTC equivalente a spillo (cellule tumorali della prostata umana 1.000 LNCaP) e campioni di sangue umano unspiked da donatori volontari sani sono stati elaborati sulla CSS utilizzando il protocollo CSSCTC standard. Come previsto, i campioni unspiked erano liberi di CTC, 0.00 ± 0.00%, e il recupero CTC è stata dimostrata essere 86,9 ± 4,71% per i...

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Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono prognostico in diversi tumori metastatici. Questo manoscritto descrive il sistema Gold Standard CellSearch (CSS) CTC piattaforma di censimento e mette in evidenza errori di classificazione comuni. Inoltre, due protocolli adattati sono descritti per l&#39;utente definito caratterizzazione marcatore delle CTC e CTC censimento in modelli murini preclinici di metastasi che utilizzano questa tecnologia.

Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

adaptation-semiautomated-circulating-tumor-cell-ctc-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

15.8K Views.  London Health Sciences Centre.  Cellule tumorali circolanti (CTC) sono prognostico in diversi tumori metastatici. Questo manoscritto descrive il sistema Gold Standard CellSearch (CSS) CTC piattaforma di censimento e mette in evidenza errori di classificazione comuni. Inoltre, due protocolli adattati sono descritti per l'utente definito caratterizzazione marcatore delle CTC e CTC censimento in modelli murini preclinici di metastasi che utilizzano questa tecnologia. 

Video: Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

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In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica Gene Transfer e<em&gt; In vitro</em&gt; test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo risposta al trattamento di tumori primari e / o associati per metastasi preclinici e sviluppo clinico di Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolamento e propagazione di cellule tumorali circolanti da un mouse cancro modello

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Proton Therapy Delivery and Its Clinical Application in Select Solid Tumor Malignancies

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of radiation, the in vivo properties of photon and proton beams differ greatly and maybe exploited to optimize clinical outcomes. In particular, proton particles lose energy in a predictable manner as they pass through the body. This property is used clinically to control the depth at which the proton beam is terminated, and to limit radiation dose beyond the target region. This strategy can allow for substantial reductions in radiation dose to normal tissues located just beyond a tumor target. However, the degradation of proton energy in the body remains highly sensitive to tissue density. As a consequence, any changes in tissue density during the course of treatment may significantly alter proton dosimetry. Such changes may occur through alterations in body weight, respiration, or bowel filling/gas, and may result in unfavorable dose deposition. In this manuscript, we provide a detailed method for the delivery of proton therapy using both passive scatter and pencil beam scanning techniques for prostate cancer. Although the described procedure directly pertains to prostate cancer patients, the method may be adapted and applied for the treatment of virtually all solid tumors. Our aim is to equip readers with a better understanding of proton therapy delivery and outcomes in order to facilitate the appropriate integration of this modality during cancer therapy.

The fundamentals of radiation planning and delivery for proton therapy using prostate cancer as a model are presented. The application of these principles to other selected disease sites highlights how proton radiotherapy may enhance clinical outcomes for cancer patients.

Consegna di terapia del protone e la sua applicazione clinica nelle malignità del tumore solido Select

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Un metodo In Vivo per valutare la Gut-barriera e metabolismo epatico del Microbiota prodotti

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Un modello di coltura del tessuto Ex Vivo per fibrovascolare complicazioni nella retinopatia diabetica proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...