Le metastasi sono una delle principali cause di decessi correlati al cancro. Questo fenomeno si verifica quando le cellule tumorali si staccano dal tumore primario, entrano nella circolazione sanguigna per raggiungere finalmente un organo bersaglio distante. Una volta che queste cellule staccate vanno nel sangue, le chiamiamo cellule tumorali secondarie.
Rappresentano un materiale variabile perché da un lato sono i principali colpevoli della formazione di metastasi e, dall'altro, sono più facili delle biopsie tumorali. In effetti, possono essere raccolti con una semplice puntura di sangue. Nonostante il basso numero di queste cellule nel campione di sangue, siamo i primi a stabilire diverse linee cellulari tumorali circolanti dal sangue del paziente con maggiore preoccupazione utilizzando la condizione controllata 3D.
Questa linea cellulare può essere utilizzata in qualsiasi linea cellulare commerciale per esperimenti di routine. Ad esempio, per lo screening genetico di farmaci, per proteine di interesse, ma anche per esperimenti in vivo per testare la capacità di inizio del tumore e il loro potenziale metastatico. CTC, linee cellulari tumorali circolanti, deve essere coltivato in condizioni 3D in ipossia.
Una volta che CTC ha formato le sfere, possiamo metterlo nel mezzo e centrifugarlo per cinque minuti a 300 RCF. Scartare il surnatante e aggiungere 500 microlitri di Accumax. Ne sospendiamo uno e incubamo la soluzione 20 minuti a 37 gradi.
Quindi lavare le sfere dissociate con PBS e pellettare le celle. Rispesci il pellet con un DMEM/F12 appena integrato e guarda le celle alla densità di cinque celle per microlitro in una nuova piastra a 24 attacchi bassi. Le sfere CTC centrifughe eliminano il surnatante e lavano il pellet due volte con PBS.
A 500 microlitri di PFE mescolare bene e incubare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti. Quindi, centrifugare le sfere fisse e lavare il pellet due volte con PBS, eliminando il volume massimo di PBS e aggiungere 20 microlitro di HistoGel formato. Prendilo in sospensione e fai una goccia sul vaso di coltura, lascialo asciugare per 10 minuti e staccalo usando un bisturi.
Ora è possibile elaborare per qualsiasi desiderato al fine di CTC mirati a una proteina desiderata di interesse. Raccogliere CTC e dissociare le sfere con Accumax come descritto in precedenza. Eliminare l'Accumax e risospesciare il pellet con tre mL di tampone bloccante e trasferire la sospensione attraverso un filtro a celle da 14 micrometri per ottenere una soluzione monocellulare.
Contare le cellule e spedirle in tubi e aggiungere un volume di 200.000 cellule, centrifugare i tubi e scartare il surnatante. Secondo la scheda tecnica dell'anticorpo, aggiungere in un tubo, il volume desiderato dell'anticorpo e in un altro tubo il suo isotipo e continuare i passaggi seguendo le indicazioni del produttore. Il tubo rimanente non sarà etichettato e l'uso di un mercato di redditività è fortemente suggerito in questo esperimento.
Sul citometro, iniziare con il tubo non etichettato per impostare la tensione nell'area etichettata negativamente. Successivamente, posizionare il tubo isotipico. L'isotipo servirebbe come controllo negativo per distinguere tra il segnale positivo e il segnale non specifico.
E termina l'esperimento con le cellule etichettate con l'anticorpo di interesse dove dovresti vedere uno spostamento nel cancello etichettato positivamente, se la proteina di interesse è espressa. Questo sospende le CTC dissociate in mezzo integrato alla densità di 200.000 cellule per ml. In un attacco Ultra Low 96, piastra di pozzo, sigillare il volume di 50 microlitri e incubare la piastra 24 ore in ipossia.
Il giorno seguente, aggiungere 50 microlitri di diversa concentrazione del farmaco testato e aggiungere lo stesso volume di DMEM / F12 solo per determinare ulteriormente la base della vitalità cellulare e incubare la piastra per altre 48 ore. Al terzo giorno, ricostituire l'agente e aggiungere 70 microlitri della miscela in ciascun pozzetto. Mettere la piastra su uno shaker orbitale per 20 minuti e poi misurare la luminescenza.
Questo test è uno strumento utile per testare un gran numero di farmaci al fine di valutare i loro effetti sulla crescita cellulare del CTC. In Eppendorf, le cellule risospese in 100 microlitri di PBS pizzicano la pelle sul retro del topo e inseriscono l'ago sotto la pelle. Iniettare lentamente l'intero volume nello stesso punto e monitorare la crescita del tumore ogni due giorni e sacrificare i topi se il tumore ha superato una dimensione di 1,5 centimetri cubici.
Prima dell'intervento chirurgico, iniettare per via sottocutanea un antidolorifico, sul lato ventrale dorsale del topo, fare una piccola incisione sotto la 10a costola. Sollevare delicatamente la milza e adagiarla su una garza sterile. Utilizzando una siringa da insulina, iniettare 50 microlitri di CTC risospese in PBS e attendere tre minuti senza rimuovere l'ago.
Ligate il vaso arterioso da un lato e il vaso venale dall'altro lato. Quindi rimuovere la milza tagliando direttamente sopra le due legature. Cucire il peritoneo addominale e la pelle e disinfettare bene l'area.
Lo scopo di questo esperimento è quello di testare la capacità delle CTC derivate da un paziente con cancro del colon-retto di colonizzare il fegato inducendo una previsione metastatica visibile. L'isolamento e la creazione della linea cellulare tumorale clinica è uno strumento emergente sia per studi fondamentali che traslazionali. Ad esempio, se hai un gene di interesse in cui gli studi in vivo hanno dimostrato che questo gene è coinvolto nella migrazione e nella capacità di invasione delle linee cellulari del cancro del colon-retto, eliminare questo gene nelle linee cellulari tumorali circolanti prima dell'iniezione nella milza dei topi, per consentire loro di colonizzare il fegato potrebbe essere un buon strumento per confermare il risultato in vivo.
Per gli studi traslazionali, la nostra prospettiva principale di isolare le linee cellulari tumorali circolanti è quella di utilizzare questo prezioso materiale nella medicina personalizzata. Dai campioni di sangue del paziente, isoleremmo e amplificheremmo le CTC in coltura per due o tre settimane al fine di avere abbastanza materiale per esaminare il pannello di farmaci disponibili e valutarne la citotossicità per attribuire finalmente
