Questo lavoro è supportato da una concessione nazionale scienziato sviluppo della American Heart Association: 10SDG3500034 e UTMB-BCN start up fondi per SSM. Gli autori riconoscono le strutture Cryo-EM e calcolo scientifico presso il Centro Sealy per la biologia strutturale presso UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ), così come Drs. Steve Ludtke e Ed Egelman aiuto con gli algoritmi di ricostruzione elicoidali 2D e 3D.

1. Preparazione del campione <ol><li> Scambio Buffer FVIII umano-BDD 14 e FVIII porcino-BDD 15 contro tampone HBS-Ca (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, 5 mM CaCl 2, pH = 7,4) e si concentrano a 1,2 mg / ml. Mantenere la soluzione proteica a -80 ° C. </li><li> Preparare nanotubi di lipidi (LNT) mescolando galactosylceramide (GC) e la fosfatidilserina (PS) a 1:4 w / w rapporto in cloroformio. Si evapora il cloroformio sotto argon e solubilizzare i lipidi in tampone HBS a 1 mg / ml. Mantenere la soluzione LNT a 4 ° C. </li></ol> 2. Cryo-microscopia elettronica di FVIII-LNT <ol><li> Cryo-EM Preparazione del campione <ol><li> Glow Discharge il 300 mesh Quantifoil R2 / 2 griglie di rame (lato carbonio up) in una miscela di O 2 e H 2 gas per 10 sec a 50 W. </li><li> Mescolare le soluzioni FVIII e LNT in tampone HBS-Ca 1:1 w / w rapporto e incubare per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Applicare una goccia di 2,5 pldi FVIII-LNT campione alla griglia microscopia elettronica idrofilo nel Vitrobot Mark IV camera umidificata (100% di umidità). </li><li> Blot e flash congelare la griglia (una macchia per 3,5 sec, forza tamponare 1) in un liquido C 2 H 6, raffreddato dal liquido N 2 per ottenere il ghiaccio amorfo. </li><li> Conservare griglie in scatole di stoccaggio sotto liquido N 2 (LN2). </li></ol></li><li> Raccolta dati Cryo-EM NOTA: Il JEM2100-LaB6 (2010) è dotato di un sistema operativo TEMCON costituito da un computer collegato al microscopio elettronico, uno schermo con finestre di lettura del sistema di aspirazione, sistema di illuminazione, HT, correnti lente e così via, e due pannelli: sinistra e destra, posizionato su entrambi i lati della colonna. Lo spostamento del fascio X, Y manopole (SHIFT Y, Y SIFT) e il multifunzione (DEF / STIG) manopole sono su entrambi i pannelli. Sul pannello di sinistra è la manopola di illuminazione (brigthness). Sul pannello di destra sono: l&#39;ingrandimento (MAG / CAM LUNGHEZZA) e messa a fuoco (FOCUS) manopole e tre imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) ed una di diffrazione (DIFF) modalità pulsanti. Noi acquistiamo i nostri dati in MAG1 in alpha 2. Le condizioni minime dosi di illuminazione (MDS) necessari per l&#39;acquisizione dati Cryo-EM sono impostati con i tasti da F1 a F6, riga in alto sul pannello di destra. In questo protocollo vengono utilizzate le impostazioni generiche: F1 - alzare / abbassare lo schermo, F2 - modalità SEARCH, F3 - Modalità FOCUS, F4 - modalità FOTO, F5 - MDS OFF / ON e F6 - BEAM BLANK, utilizzato per proteggere il campione dalla radiazione danneggiare deviando il fascio. <ol><li> Posizionare la crio-supporto nel crio-station e riempire il Dewar del titolare e la crio-stazione con LN2. Quando la temperatura raggiunge i -192 ° C, otturatore aperto sulla punta titolare, posto precedentemente congelato griglia di Cryo-EM nel luogo designato e fissarlo con una fascetta anello. </li><li> Inserire il crio-supporto nel microscopio elettronico. Riempire il Dewar del crio-porta e la camera anti-contaminante con LN2. Attendere che il titolare si stabilizzi per 30-60 min. Premere F6 su eaccendere il filamento su. Quando il filamento è saturo, premere F6 spento e aperto di scatto sul supporto per visualizzare la griglia. </li><li> Premere Basso Mag / alpha 1 (fissato a 200X MAG) e individuare le aree con ghiaccio sottile sulla griglia. </li><li> Passare a MAG 1/alpha 2 per impostare dose minima modalità (MDS) e acquisire i dati Cryo-EM a basse dosi di elettroni, senza danneggiare il campione. <ol><li> Premere F2 per impostare la modalità di ricerca. Ingrandimento fissato a 40.000 x. Ingrandisci fascio con la manopola brigtness di minima dose di elettroni ~ 0,04 e - / Å 2 · s. Premere DIFF per passare alla modalità di diffrazione. Impostare la lunghezza telecamera a 120 cm con manopola MAG / CAM LUNGHEZZA. Individuare aree sulla griglia nelle zone prescelte in LOWMAG che hanno nanotubi lipidi nei fori della pellicola di carbonio. </li><li> Premere F4 per impostare la modalità Foto a 40.000 X di ingrandimento e set di illuminazione con la manopola luminosità a dosi di 16-25 e - / A 2 · s. Premere il pulsante Standard Focus per impostare le condizioni di messa a fuoco regolando la Z-heightdel campione con i tasti Z UP / DOWN (pannello di controllo a destra). Impostare defocus tra -1,5 e -2,5 micron. </li><li> Allineare ricerca e la modalità PHOTO disegnando un quadrato nella finestra di visualizzazione in diretta sul monitor della fotocamera digitale in modalità SEARCH corrispondente all&#39;area da acquisire in modalità foto. </li><li> Premere F3 per impostare la modalità di messa a fuoco a 100.000 X di ingrandimento. Concentrarsi illuminazione a coprire il chip CCD (~ 4-5 cm di raggio) e fuori asse per non irradiare la zona per essere ripreso in modalità foto. Regolare defocus a ~ -1.5 e -2.5 micron con la manopola FOCUS e corretto per l&#39;astigmatismo dell&#39;immagine con manopole DEF / STIG. </li></ol></li><li> Selezionare il FVIII-LNT per essere ripreso in modo di ricerca con l&#39;acquisizione di immagini in diretta nella finestra di visualizzazione in diretta sul monitor della fotocamera digitale. Centrare il FVIII-LNT in piazza disegnata sulla finestra Live View. </li><li> Registrare una immagine digitale sulla fotocamera CCD a 52.000 X efficace ingrandimento e 0,5 sec di esposizione passando alla modalità Foto e facendo clic sul nell&#39;acquisireE Pulsante sul monitor della fotocamera digitale al microscopio. Le condizioni di acquisizione dell&#39;immagine sono impostate come il bianco fascio (SERRANDE) aperto solo quando l&#39;immagine viene acquisita in modalità foto. </li><li> Controllare la qualità e la sfocatura dell&#39;immagine acquisita premendo CTRL-F per ottenere un Fast Fourier Transform (FFT). </li></ol></li></ol> 3. Ricostruzione 3D NOTA: Il software di analisi dell&#39;immagine utilizzata per l&#39;analisi 2D e 3D: EMAN2 e IHRSR sono liberamente disponibili. EMAN2 può essere scaricato dal http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Il software IHRSR può essere ottenuto dal Professor Egelman: egelman@virginia.edu. I filtri IHRSR finali vengono eseguiti sul Texas Advanced Computing centro cluster: http://www.tacc.utexas.edu/ presso l&#39;Università del Texas, Austin. L&#39;algoritmo di ricostruzione 3D mostrato in Figura 1 consiste di due fasi principali: in primo luogo la selezione di un insieme omogeneo di segmenti elicoidali (particelle) con il riferimento gratuito alignme 2Dnt (RFA) algoritmi implementati in EMAN 2, secondo conseguire una ricostruzione 3D basato sui parametri elicoidali e algoritmi retroproiezione incorporati in IHRSR. Il primo passo utilizza i programmi sviluppati per la selezione di insiemi di particelle omogenee per la ricostruzione 3D con SPA singola particella (algoritmi) per cui EMAN2 è stato specificamente sviluppato e distribuito: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Questo passo è stato adattato ai dati Cryo-EM. Il secondo passo si ottiene con l&#39;algoritmo IHRSR, che è specificamente progettato per il tipo di assemblee elicoidale ottenuti con le forme del fattore VIII ricombinante. Questo algoritmo è stato ampiamente documentato nella letteratura scientifica 12. <ol><li> Eseguire l&#39;analisi di immagini 2D con l&#39;EMAN2 scientifico suite di elaborazione delle immagini: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 per selezionare particella omogenea (segmento elicoidale) set per la ricostruzione elicoidale. <ol><li> Selezionare microscopio Cryo-EM con straight e ben organizzato tubi elicoidali con il software della fotocamera digitale e strumenti di visualizzazione. </li><li> Inverti, normalizzare e filtrare per raggi X pixel nella GUI e2workflow.py, ricostruzione particella singola opzione (spr): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> Importare le immagini invertite, normalizzati e X-ray pixel filtrata nella GUI e2helixboxer.py. Selezionare tubi elicoidali FVIII-LNT e segmento a 256 x 256 pixel (2.9 Å / pix) con il 90% di sovrapposizione con: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Valutare il defocus dalle micrografie originali e applicare la funzione di trasferimento di contrasto (CTF) di correzione (solo correzione di fase) per i segmenti elicoidali dagli stessi micrografie con l&#39;opzione e2ctf.py incorporata nel e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> Genera particelle iniziali (segmenti elicoidali) imposta nella GUI e2workflow.py opzione - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Calcolare le medie di classe 2D con l&#39;algoritmo e2refine2d.py applicando riferimento franco classificazione k-medio per selezionare insiemi di dati omogenei con lo stesso diametro e LNT grado di ordine elicoidale (Figura 2), seguendo lo script: &#39;e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - Ingresso = INPUT.hdf - NCL = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = medio - normproj-classkeepsig &#39;, cambiando il valore NCL conseguenza. <ol><li> Classificare i dati iniziali impostati in &#39;NCL = 151&#39; 150 classi con oltre 8 iterazioni con &#39;classkeep = 0.8&#39;, il che significa che particelle con meno del 80% di somiglianza alla media della classe sono esclusi dalla classe data. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Unisci particelle medie di classecon la diffrazione elicoidale pronunciata in e2display.py per creare set di dati intermedio. </li><li> Classificare i dati intermedi fissati in 50 classi &quot;NCL = 51 &#39;per differenziare le classi con lo stesso diametro e grado di ordine. </li><li> Unisci le particelle dalle classi con lo stesso diametro e grado di ordine in e2display.py per creare il set di dati definitivi per la ricostruzione tridimensionale: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector. </li></ol></li></ol></li><li> Eseguire ricostruzione elicoidale con l&#39;algoritmo iterativo elicoidale reale spazio ricostruzione (IHRSR), come descritto in Egelman 17, 18. <ol><li> Stimare l&#39;aumento, Az (Å) dell&#39;elica FVIII-LNT dal combinato Fourier trasformata di particelle nel set di dati definitivi. </li><li> Definire l&#39;angolo azimutale ΔΦ (º) eseguendo i parametri IHRSR parallelo con una costante Az, aumentando ΔΦ da 576; a 60 ° in incrementi di 5 °. </li><li> Eseguire 100 cicli IHRSR consecutivi per ogni finale set di dati con un cilindro informe come un volume iniziale ed i parametri elicoidali iniziali Az e ΔΦ come definito in 3.2.1. e 3.2.2. </li><li> Controllare i volumi finali di convergenza dei parametri elicoidali e la corrispondenza tra le medie di classe dalla classificazione 2D del set di dati definitivi e le proiezioni della ricostruzione finale IHRSR. </li><li> Imporre simmetria le ricostruzioni 3D finali, corrispondente alla distribuzione unità asimmetrica osservata nei volumi 3D asimmetrici finali: 4 volte per il FVIII umano-LNT e 5 volte per il FVIII porcino-LNT. Eseguire altri 100 cicli di perfezionamento per generare una ricostruzione 3D finale simmetrizzata. </li><li> Calcolare la curva di correlazione Fourier Shell sia per volumi in primo luogo separando i corrispondenti dati impostati in pari e dispari: &#39;e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;outfile&gt; - split = 2 &#39;. Quindi eseguire 100 IHRSR filtri consecutivi come descritto in 3.2.3. Calcolare il FSC dei volumi 3D creati dai set di dati pari e dispari: &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;. </li></ol></li><li> Visualizza e segmento i volumi FVIII-LNT in UCSF chimera. </li><li><ol><li> Aprire i volumi finali dal punto 3.2.5. in UCSF Chimera e impostare il livello di contorno 0.005 nel TOOLS&gt; DATI VOLUME&gt; opzione Volume Viewer. </li><li> In Strumenti&gt; DATI VOLUME&gt; SEGMENTO MAP, selezionare volume in SEGMENTO scheda MAP e fare clic sul segmento segmento del volume. </li><li> I settori del Gruppo corrispondente ad una cella unitaria selezionando con CTRL + MAIUSC e facendo clic gruppo. </li><li> Colora i segmenti da cellule dell&#39;unità e helix con AZIONI&gt; opzione COLOR a sottolineare le caratteristiche strutturali. </li></ol></li></ol> 4. Electron Positron <ol><li> Negativamente Stained Preparazione del campione FVIII-LNT <ol> &lt;li&gt; Preparare i campioni FVIII-LNT come per gli esperimenti di Cryo-EM. </li><li> Glow scarichi griglia di rame ricoperto con carbone 300 mesh (lato carbonio alto) in una miscela di O 2 e H 2 gas per 10 sec a 50 W da per esperimenti Cryo-EM. </li><li> Applicare una goccia di 2,5 microlitri di sospensione FVIII-LNT con 6 nm nanoparticelle di oro colloidale alla griglia, asciugare il liquido in eccesso e macchiare negativamente applicando 5 ul di soluzione 1% acetato di uranile per 2 min. Asciugare il liquido in eccesso e asciugare la griglia. </li></ol></li><li> Raccolta dati Electron Positron <ol><li> Trasferire la griglia nel supporto tilt singolo. </li><li> Trasferire il supporto al microscopio elettronico. </li><li> Raccogliere serie tilt automaticamente con il software SerialEM 19 a 2 ° incrementi su un range angolare di -60 ° a +60 ° e registrare le immagini con una telecamera CCD a 52.000 X di ingrandimento efficace, -6 a -10 micron sfocatura e la dose di elettroni di 150 - 170 electrons / A 2 · s per tomogram. </li></ol></li><li> Electron Positron Ricostruzione di FVIII-LNT Nota: Ricostruire la serie inclinata pFVIII-LNT e hFVIII-LNT acquisita in 4.2. con l&#39;opzione ETomo del software MDI seguendo il tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html <ol><li> Utilizzando una finestra di terminale, aprire il tomogramma in 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Bin tomogramma dal 4 con il IMOD BINVOL comando per ridurre le dimensioni del tomogramma. </li><li> Selezionare la corretta angolazione per ruotare il nanotubo lipidico lungo l&#39;asse Y nel tomogramma categorizzata utilizzando il comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Ruotare la piena tomogramma con il comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Ritagliare il nanotubo lipidico selezionato orientato lungo l&#39;asse Y con il comando IMOD CLIP RIDIMENSIONAMENTO. </li><li> Aprire il ritagliata sub-tomogram con 3DMOD. </li><li> Clicca sul tomogramma per visualizzare la disposizione delle molecole di Fattore VIII lungole fette in Z e lungo l&#39;asse Y nel volume sub-tomogram. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione e possono essere contattati direttamente per quanto riguarda le procedure pubblicate in questo manoscritto.

In questo lavoro viene presentato un metodo per distinguere tra due organizzazioni membrana di proteine ​​altamente omologhe: FVIII umano e suino auto-assemblati su nanotubi lipidi nelle condizioni che si verificano nel corpo umano. Nella procedura descritta, FVIII umano e suino sono organizzati con successo elicoidalmente su nanotubi lipidi, che è la fase più critica. Il prossimo passo fondamentale è quello di preservare il campione in ghiaccio sottile amo...

Coagulazione del sangue Fattore VIII (FVIII) è un grande glicoproteina di 2332 aminoacidi organizzati in sei settori: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Su trombina attivazione FVIII agisce come cofattore di Fattore IXa all&#39;interno del complesso tenasi legato alla membrana. Il legame di FVIII attivato (FVIIIa) per FIXa in maniera membrana seconda migliora FIXa efficienza proteolitica più di 10 5 volte, che è fondamentale per un efficiente coagulazione del sangue 4. Nonostante il ruolo importante FVIII svolge nella coagulazione e la formazione del complesso tenasi, la struttura FVIII legato alla membrana funzionale è ancora da risolvere. Per risolvere questo problema, nanotubi doppio strato lipidico (LNT) ricche in fosfatidilserina (PS), in grado di legarsi con alta affinità FVIII 8, 9 e assomiglia alla superficie delle piastrine attivate sono state sviluppate 10. Organizzazione elicoidale consecutivo di FVIII legato a LNT ha dimostrato di essere efficave per la determinazione della struttura di FVIII stato legato alla membrana da Cryo-EM 5. Funzionalizzati LNT sono un sistema ideale per studiare proteina-proteina e proteina-membrana di proteine ​​di membrana associate ad elica organizzato da Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM ha il vantaggio rispetto ai metodi tradizionali strutturali come la cristallografia a raggi X e NMR, come il campione viene conservato in più vicino al ambiente fisiologico (buffer, membrana, pH), senza additivi e isotopi. Nel caso di FVIII, lo studio della struttura di membrana con questa tecnica è ancora più fisiologicamente rilevanti, come la LNT assomigliare per dimensione, forma e composizione pseudopodi delle piastrine attivate in cui i complessi tenasi assemblano in vivo. Difetti e carenza di FVIII causa Emofilia A, un grave disturbo della coagulazione che colpisce 1 su 5.000 maschi della popolazione umana 4, 6. La maggior parte delle eLa terapia stati efficaci per l&#39;emofilia A è la somministrazione per tutta la vita di FVIII ricombinante umano (hFVIII). Una complicazione significativa della terapia ricombinante FVIII emofilia A è lo sviluppo di anticorpi inibitori per la forma umana che colpisce circa il 30% dei pazienti emofilia A 13. In questo caso, viene utilizzato FVIII porcino (pFVIII) concentrato, come display FVIII suina bassa cross-reattività con anticorpi inibitori contro FVIII umano e forme complessi funzionali con FIXa umana 7. Stabilire l&#39;organizzazione di membrana sia suina e forme di FVIII umani è importante per capire le basi strutturali della funzione cofattore FVIII e implicazioni per emostasi del sangue. In questo studio, descriviamo una combinazione di nanotecnologie lipidi, Cryo-EM, e analisi della struttura progettata per risolvere l&#39;organizzazione di membrana delle due forme FVIII altamente omologhi. I dati presentati Cryo-EM e strutture 3D per Porci elicoidale organizzataFVIII ne ed umano carica negativa LNT mostra il potenziale del nanotecnologie proposto come base per la determinazione della struttura di FVIII e fattori e complessi in un ambiente membrana fisiologica coagulazione legata alla membrana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">JEM2100 with LaB6&#160;</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">JEM-2100</td>
			<td style="width:447px;">operated at 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">with TEMCON software</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan626 Cryo-holder</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">626.DH</td>
			<td style="width:447px;">cooled to -175 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">with temperature controler unit</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan 4K x 4K CCD camera</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">US4000</td>
			<td style="width:447px;">4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Solarus Model 950 plasma cleaner</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:205px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Materials</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">01821</td>
			<td style="width:447px;">plasma cleaned for 10 s on high power</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">Quantifoil R2/2 300 mesh</td>
			<td style="width:205px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Q225-CR2</td>
			<td style="width:447px;">Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">19481</td>
			<td style="width:447px;">1% solution, filtered</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:239px;">Galactosyl ceramide</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">860546</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840035</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Software</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">EM software Digital Micrograph</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">EM software EMAN</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">EM software Spider</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">EM software IHRSR</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;">Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (IMOD)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (SerialEM)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">UCSF-Chimera</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

helical organization of blood coagulation factor viii on lipid nanotubes

<html> Crio-microscopia elettronica (Cryo-EM) 1 è un approccio efficace per indagare la struttura funzionale di proteine ​​e complessi in uno stato e membrana idratata ambiente 2. Coagulazione Fattore VIII (FVIII) 3 è un multi-dominio plasma sanguigno glicoproteina. Difetto o carenza di FVIII è la causa di emofilia di tipo A - un disturbo grave emorragia. Dopo l&#39;attivazione proteolitica, FVIII lega alla serina proteasi Factor IXa sulla membrana piastrinica carica negativa, che è fondamentale per la coagulazione 4. Nonostante il ruolo fondamentale FVIII svolge nella coagulazione, informazioni strutturali per il suo stato di membrana è incompleta 5. Ricombinante concentrato di FVIII è il farmaco più efficace contro il tipo emofilia A e commercialmente disponibile FVIII può essere espresso come umano o porcino, entrambi i complessi funzionali che formano con fattore IXa umano 6,7. &quot;&gt; In questo studio presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica (Cryo-EM), lipidi nanotecnologia e la struttura di analisi applicato per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi:. Umana e suina La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio organizzare elicoidalmente le due forme Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto. I risultati rappresentativi dimostrano che il nostro approccio è sufficientemente sensibile per definire le differenze nell&#39;organizzazione elicoidale tra i due altamente omologa in sequenza (86% di identità di sequenza proteine). protocolli dettagliati per l&#39;organizzazione elicoidale, Cryo-EM e tomografia elettronica (ET) di acquisizione dati sono dati. L&#39;bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) analisi della struttura applicate per ottenere le ricostruzioni 3D di umana e suina FVIII-LNT è discusso. Le strutture FVIII-LNT umane e suine presentati mostrano le potenzialità della metodologia proposta per Calculate il funzionale, organizzazione legata alla membrana della coagulazione del sangue Fattore VIII ad alta risoluzione.

FVIII suina umana ricombinante e sono stati organizzati con successo ad elica sul carico negativamente singolo LNT doppio strato, che assomiglia alla superficie delle piastrine attivate. L&#39;organizzazione elicoidale del FVIII umano e suino-LNT era coerente attraverso le micrografie digitali raccolti (Figura 2). La LNT controllo e l&#39;umano e tubi elicoidali FVIII-LNT suina sono stati selezionati e segmentati con la GUI e2helixboxer.py e insiemi di dati iniziali creati con la GUI e2...

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Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Vi presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica, lipidi nanotecnologie, e analisi della struttura applicata per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi: umane e suine. La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio per organizzare elicoidale le due forme contenenti Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi di lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto.

Elicoidale Organization of Blood fattore VIII della coagulazione su Lipid nanotubi

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K Views.  University of Texas Medical Branch.  Vi presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica, lipidi nanotecnologie, e analisi della struttura applicata per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi: umane e suine. La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio per organizzare elicoidale le due forme contenenti Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi di lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto. 

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Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very promising application for molecular sensors, field effect transistor and super thin and flexible electronic devices1-4. Anodic arc discharge supported by the erosion of the anode material is one of the most practical and efficient methods, which can provide specific non-equilibrium processes and a high influx of carbon material to the developing structures at relatively higher temperature, and consequently the as-synthesized products have few structural defects and better crystallinity.
 To further improve the controllability and flexibility of the synthesis of carbon nanostructures in arc discharge, magnetic fields can be applied during the synthesis process according to the strong magnetic responses of arc plasmas. It was demonstrated that the magnetically-enhanced arc discharge can increase the average length of SWCNT 5, narrow the diameter distribution of metallic catalyst particles and carbon nanotubes 6, and change the ratio of metallic and semiconducting carbon nanotubes 7, as well as lead to graphene synthesis 8. 
 Furthermore, it is worthwhile to remark that when we introduce a non-uniform magnetic field with the component normal to the current in arc, the Lorentz force along the J&times;B direction can generate the plasmas jet and make effective delivery of carbon ion particles and heat flux to samples. As a result, large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes were simultaneously generated by such new magnetically-enhanced anodic arc method. Arc imaging, scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM) and Raman spectroscopy were employed to analyze the characterization of carbon nanostructures. These findings indicate a wide spectrum of opportunities to manipulate with the properties of nanostructures produced in plasmas by means of controlling the arc conditions.

Anodic arc discharge is one of the most practical and efficient methods to synthesize various carbon nanostructures. To increase the arc controllability and flexibility, a non-uniform magnetic field was introduced to process the one-step synthesis of large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes.

Sintesi simultanea di nanotubi a parete singola carbonio e del grafene in un Plasma Arc magneticamente avanzata

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Ricerca

Bioingegneria

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in transcription of non-coding RNAs, specifically of microRNAs. Here, we propose a strategy to study the potential role of transcription factor in regulating transcription of microRNAs using publically available data, computational resources and high throughput data. We use the H3K4me3 epigenetic signature to identify microRNA promoters and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing data from the ENCODE project to identify microRNA promoters that are enriched with transcription factor binding sites. By transfecting cells of interest with shRNA targeting a transcription factor of interest and subjecting the cells to microRNA array, we study the effect of this transcription factor on the microRNA transcriptome. As an illustrative example we use our study on the effect of STAT3 on the microRNA transcriptome of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells.

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

Nanotubi di DNA come un Versatile strumento per lo studio di polimeri semiflessibili

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&amp;#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

La microscopia della forza di trazione ad alta velocità di throughput tramite PDMS rivela effetti dipendenti dalla dose di trasformazione del fattore di crescita , sulla transizione epitelil-to-mesenchymic

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...