Questo test di imaging in vitro consente di quantificare l'effetto di diversi trattamenti cellulari o diversi genotipi sulla fagocitosi microgliale. Utilizzando due tipi di cellule che sono rilevanti per le malattie neurodegenerative, utilizziamo cellule morte di neuroblastoma per il carico fagocitico, che sono preparate in un modo che può essere facilmente ed economicamente scalato da grandi schermi di imaging ad alto contenuto. In un armadio di sicurezza biologica di classe 2, dissociare SH-SY5Y aspirando il mezzo.
Aggiungere 4 ml di tampone di dissociazione cellulare e rimuovere immediatamente il tampone in modo che rimanga meno di 1 ml come un film sottile che ricopre le cellule. Incubare per 2 o 3 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi a 10 ml di HBSS al pallone T-75.
E pipettare gli SH-SY5Ys in un tubo conico centrifugo da 15 ml. Centrifugare a 400xG per 5 minuti. Aspirare il surnatante e sospendere di sospendere le cellule in 2 ml di mezzo tamponato HEPES privo di fenolo rosso, assicurandosi di rompere i grumi prima della fissazione.
Fissare le cellule aggiungendo 2 ml di formaldeide al 4% di potenza al tubo e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente con occasionale agitazione delicata. Aggiungere 10 ml di HBSS al tubo. Quindi, centrifugare a 1200xG per 7 minuti.
Aspirare il surnatante e sospendere di frequente il pellet cellulare in 2 ml di mezzo tamponato HEPES privo di fenolo rosso. Contare e rimuovere 1 milione di cellule HS-SY5Y in un tubo a basso legame proteico da 2 ml. Portare il volume totale a 300-500 microlitri con supporti tamponati HEPES privi di fenolo rosso.
Quindi riscaldare brevemente il tubo a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Ricostituire l'estere STP del colorante fluorescente rosso sensibile al pH secondo le istruzioni del produttore. Quindi aggiungere 12,5 microgrammi di colorante per milione di cellule SH-SY5Y.
Mescolare delicatamente facendo scorrere il tubo. E incubare il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti, al riparo dalla luce. Aggiungere 1 ml di HBSS e centrifugare a 1200xG per 7 minuti e 4 gradi Celsius.
Scartare il surnatante. E lavare con 2 ml di HBSS. Sospendere di nuovo il pellet cellulare in mezzi macrofagi privi di fenolo rosso ad una concentrazione da 0,2 a 1,2 milioni di cellule per ml, in modo che 50 microlitri contengano da 10.000 a 60.000 cellule.
In un armadio di sicurezza biologica, preparare una soluzione di colorante reattivo reattivo all'estere succinimidyl permeante a cellule fluorescenti rosso intenso nei mezzi macrofagi. Aggiungere Hoechst 33342 e riscaldare la soluzione di lavoro a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Aspirare delicatamente il mezzo macrofagico iPSC, pipettando il surnatante cellulare con una pipetta multicanale in un serbatoio sterile.
Aggiungere 70 microlitri per pozzetta della soluzione colorante ai macrofagi iPSC utilizzando una pipetta multicanale. Incubare per 1 ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Riparare trattamenti sperimentali in mezzi macrofagici privi di fenolo rosso.
Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo macrofagico iPSC molto delicatamente con una pipetta multicanale e aggiungere 100 microlitri di HBSS per pozzetti. Rimuovere immediatamente HBSS mediante un leggero pipettaggio. Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzi macrofagi privi di fenolo rosso, oltre a trattamenti sperimentali in pozzeggi separati.
Incubare per 10 minuti a 1 ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri dell'SH-SY5Ys etichettato per pozzetti dai lati di ciascun pozzettino sul bordo del liquido. Quindi incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 3-5 ore.
Dopo l'incubazione della fagocitosi, aspirare delicatamente i supernatanti cellulari pipettando con una pipetta multicanale e scartare. Lavare una volta con 100 microlitri di PBS. Quindi fissare le cellule aggiungendo 100 microlitri di formaldeide di potenza al 2% e incubando per 15 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare i pozzi e aggiungere 100 microlitri di PBS. Procedere direttamente all'imaging con il microscopio ad alto contenuto, o coprire con sigillante a piastre e lamina, e conservare la piastra a 4 gradi Celsius, fino a quando necessario. Accendere il microscopio di imaging ad alto contenuto e aprire il software di acquisizione delle immagini.
Caricare la piastra di analisi nel microscopio facendo clic sull'icona LOAD nella parte superiore dello schermo. Selezionare la scheda SETUP". Nei menu a discesa nella casella in alto a sinistra, selezionare il tipo di piastra appropriato.
L'opzione di messa a fuoco automatica: due picchi "L'obiettivo: 40x Acqua, NA 1.1 "Confocal" modalità e Binning di 1. Lavare l'obiettivo Acqua 40x prima dell'uso tramite il menu delle impostazioni. Nella casella di selezione dei canali, utilizza l'icona più per aggiungere i canali DAPI, Alexa 647 e Alexa 568.
Impostare questi per misurare su un singolo piano di un micrometro. Ottimizzare le impostazioni di tempo e potenza per l'efficienza di colorazione della piastra di dosaggio. Assicurarsi che i canali non vengano misurati contemporaneamente, facendo clic sulla sequenza di canali per separare i canali.
Sotto la navigazione e definisci il layout, seleziona i pozzi di misurazione e seleziona da 9 a 12 campi per pozzo. Durante l'installazione, fare clic su un campo rappresentativo sulla mappa della piastra. E controlla ogni canale di misurazione a turno per assicurarti che la colorazione sia presente e che le immagini siano focalizzate regolando l'offset del canale.
Per caricare i dati su un server per l'analisi remota, fare clic sulla casella "lavori online" e sul relativo nome utente. Salva il protocollo di analisi facendo clic sul pulsante Salva e fai clic sulla scheda Esegui esperimento" in alto. Un test di fagocitosi della vita delle cellule vive ha mostrato che con 10.000 SH-SY5Ys per pozzetto, il numero di particelle di fagocitosi per cellula è aumentato linearmente con il tempo ed è stato inibito di circa il 50% dalla citocalasina D.Con quantità più elevate di SH-SY5Ys per pozzetto, la fagocitosi ha mostrato scarsa linearità, probabilmente a causa della scarsa segmentazione di iPSC, macrofagi e SH-SY5Y in un campo visivo più affollato.
I seguenti risultati sono stati ottenuti eseguendo un imaging ad alto contenuto a cellule fisse, inclusa questa immagine rappresentativa della fagocitosi. L'aumento della quantità di SH-SY5Ys ha comportato un numero maggiore di particelle fagocitose per cellula. Il test della fagocitosi è stato convalidato utilizzando diversi inibitori della fagocitosi.
La citocalasina D e Jasplakinolide hanno inibito significativamente la fagocitosi rispettivamente del 91 e del 90%. E la bafilomicina A1 ha ridotto significativamente la fagocitosi del 31% quando pre-incubata per 1 ora prima della fagocitosi. L'aggiunta di Annexin 5 ricombinante ha ridotto significativamente la fagocitosi del 30% se aggiunta ai pozzi immediatamente prima dell'aggiunta di SH-SY5Y.
Risolto SH-SY5Ys siamo confermati per esporre fosfatidilserina utilizzando una sonda fluorescente Annexin 5. Mentre gli SH-SY5Y vivi erano negativi per la colorazione annexin 5. Diverse lunghezze della durata della fagocitosi, da 1 a 5 ore, sono state testate utilizzando l'aggiunta scagliona di carico fagocitico.
La lunghezza complessiva di questo protocall può essere ridotta preparando il carico fagocitico e macchiando i macrofagi iPSC in parallelo. Se vuoi farlo, elabora i tempi in anticipo e usa le tue incubazioni per preparare soluzioni per i passaggi futuri.
