Gli autori sono grati al Dr. Yangyang Yan nel laboratorio del Dr. Fred Sigworth alla Yale University per la generosa donazione di cellule HEK293 stabilmente esprimenti ratto proteina Slack-B. Inoltre, gli autori sono grati al Dott. Sigworth per crio-elettroni modello di microscopia omologia di Slack visualizzato nel video introduttivo. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH DH067517 e NS073943 a LKK

1. Colture Cellulari (Adattato da Fleming ed Kaczmarek 18,) <ol><li> Cellule di coltura in mezzi appropriati per maggiore di 2 ma meno di 10 passaggi prima di utilizzare questo test. Non trasfettate cellule HEK-293 e cellule HEK-293 che esprimono stabilmente ratto proteina Slack-B vengono coltivate in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco una metà e una metà di Leibovitz L-15 integrato con calore inattivato siero bovino fetale al 10% e antibiotici. 500 mcg / ml Geneticin (G418) è aggiunta cellule HEK-293 che esprimono stabilmente Slack-B per selezionare per l&#39;espressione del canale Slack. Cellule Passage a confluenza del 70-90% per dissociazione da piatti con una soluzione di tripsina-EDTA 0,25%. </li></ol> 2. Matrice extracellulare (ECM) Rivestimento del TiO 2 384 pozzetti Piastra biosensore ottico con fibronectina e Ovalbumina <ol><li> Preparazione della miscela fibronectina ECM e soluzione bloccante ovalbumina <ol><li> Preparare una soluzione di lavoro di fibronectin in tampone fosfato salino (PBS) con una concentrazione finale di 5 mg / ml di fibronectina in 20,0 ml di PBS. Da una concentrazione magazzino 1,0 mg / ml, aggiungere 100 ml a 20,0 ml di PBS per una diluizione di 200 volte. La soluzione di lavoro di fibronectina può essere suddiviso in aliquote e conservato a -20 ° C dopo la preparazione. </li><li> Preparare una soluzione madre 5% di ovoalbumina inattivato al calore in acqua sterile. Diluire ovalbumina in tessuto acqua di grado coltura sterile per una soluzione al 5% e al calore inattivare per 30 min a 60 ° C. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e filtrare la soluzione sterile. Aliquota della soluzione ovoalbumina 5% e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare una soluzione di lavoro 2% di ovoalbumina diluendo la soluzione di riserva 5% in PBS. Ad esempio, aggiungere 12,0 ml di soluzione al 5% ovoalbumina azionario per 18,0 ml di PBS per un volume finale di 30,0 ml. </li></ol></li><li> 384 pozzetti rivestimento piastra biosensore ottico <ol><li> Idratare la piastra TiO 2 con 20,0 microlitri / pozzettoacqua sterile grado coltura tissutale per 15 min. Le seguenti operazioni devono essere eseguite con una pipetta a 16 canali. </li><li> Lavare 1x piastra con 50.0 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Aggiungere 20,0 ml di soluzione di lavoro fibronectina a ciascun pozzetto ed incubare per 2 ore a temperatura ambiente per creare la ECM. </li><li> Lavare 1x piastra con 50.0 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Aggiungere 40,0 ml di soluzione di lavoro ovoalbumina a ciascun pozzetto e incubare overnight a 4 ° C per bloccare la piastra. </li><li> Lavare 3x piatto con 50.0 ml di PBS per pozzetto. Piastre rivestite ECM possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 48 ore. </li></ol></li></ol> 3. Semina delle cellule sulla 384 pozzetti biosensore ottico Piatto <ol><li> Rimuovere mezzi di crescita dalle cellule e aggiungere tripsina per staccare le cellule dalla piastra. Raccogliere le cellule e centrifugare a 1000 xg per 1 min. Rimuovere i supporti tripsina e risospendere le cellule in terreno di coltura. </li><li> Utilizzando un emocitometro o un automatizzatocontatore di cellule, determinare la concentrazione delle cellule. </li><li> Per minimizzare gli effetti di evaporazione durante l&#39;incubazione, verrà utilizzato 50,0 ml di mezzo di crescita per pozzetto. Le cellule devono essere diluite per ottenere il numero desiderato di cellule per pozzetto in un volume di 50,0 ml di mezzo di crescita. Per questi esperimenti, 1000 cellule / pozzetto sono state piastrate sul biosensore. </li><li> Lasciare le cellule inseminate da incubare una notte in mezzo di crescita a 37 ° C in aria / 5% di CO 2. </li></ol> 4. Preparazione del biosensore e composte Piastre per il dosaggio RWG ottica Biosensor <ol><li> Rimuovere la piastra dall&#39;incubatore e rimuovere i supporti la crescita delle cellule. Lavare le cellule 1x con Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS). Aggiungere 25,0 ml di HBSS ad ogni pozzetto. </li><li> Posizionare la piastra biosensore sullo scanner BIND e permettono alle cellule di portare a temperatura ambiente per 1-2 ore. </li><li> Preparare un piatto composto di separato da cui ligandi di interesse saranno annuncioded alla piastra biosensore durante il dosaggio. Per questi saggi, 25,0 ml di soluzione contenente composto stati aggiunti a ciascun pozzetto della piastra biosensore per un volume totale di 50,0 microlitri. Come tale, composti in soluzione sono stati preparati in 2x la concentrazione finale desiderata. </li></ol> 5. Eseguire il test RWG Optical biosensore <ol><li> Prendere una misura di base con il sistema Scanner per pozzi A1-P12 (metà piastra a 384 pozzetti SBS) usando la massima risoluzione di 3,75 micron / pixel per la centrale 1,5 mm ogni pozzetto usando il software BIND Scan. Questa scansione di base richiede circa 30 min. </li><li> Aggiungere 25,0 ml di soluzioni composti a ciascun pozzetto per pozzetti A1-P12. </li><li> Prendete una misura di base di pozzi A13-P24. </li><li> Aggiungere 25,0 ml di soluzioni composti a ciascun pozzetto per pozzi A13-P24. </li><li> Prendete una misura aggiunta del composto incarico per pozzi A1-P12, e ripetere per pozzi A13-P24. </li></ol> 6. Lanalisi di Assay dati con BIND Vista <ol><li> Aprire i dati di analisi BIND per la misurazione di riferimento in Windows, e fare clic sul pulsante &quot;Grid Editor&quot; per consentire la selezione delle cellule. Il software calcolerà le metriche di interesse definiti dall&#39;utente. </li><li> Aprire la &quot;Plug-in&quot;, che comprendono il &quot;Finder Cella&quot; e funzione &quot;Baseliner&quot;. Impostare i parametri in &quot;Finder cella&quot; in modo che le cellule sono distinguibili dallo sfondo del biosensore. </li><li> Esportare il file di mappa cellula che contiene i dati &quot;Finder cellulare&quot; per la misurazione di riferimento. </li><li> Ripetere i passaggi 6,1-6,2 per i dati post-addizione composto. </li><li> Aprire il &quot;Baseliner&quot; plug-in e importare la mappa cella dalla misurazione di riferimento. Il software calcolerà lo spostamento PWV tra i dati di base e composti posta. </li><li> Seleziona &quot;Δ cellulare media&quot; per l&#39;uscita dello spostamento medio in PWV per le cellule. I dati possono poi essere esportati in Microsoft Excel per ulteriori analisi. </li></ol>

<ol>
	<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).</li><li>Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conducting+functions+of+voltage-gated+ion+channels.">Non-conducting functions of voltage-gated ion channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).</li><li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels.">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li><li>Shamah, S. M., Cunningham, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell-based+assays+using+photonic+crystal+optical+biosensors.">Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors.</a> Analyst. 136, 1090-1102 (2011).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+biomolecular+interactions:+applications+in+proteomics.">label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics.</a> Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).</li><li>Cunningham, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+assays+on+the+BIND+system.">Label-free assays on the BIND system.</a> J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).</li><li>Hessel, A. a. O., A, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Theory+of+Wood's+Anomalies+on+Optical+Gratings.">A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings.</a> Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+application+of+label-free+detection+assays+in+drug+screening.">Advantages and application of label-free detection assays in drug screening.</a> Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).</li><li>Lee, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+optical+biosensor:+a+tool+for+G+protein-coupled+receptors+pharmacology+profiling+and+inverse+agonists+identification.">Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).</li><li>Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+K++channels,+Na++is+the+new+Ca2.">For K+ channels, Na+ is the new Ca2.</a> Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).</li><li>Santi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+regulation+of+Slick+and+Slack+K++channels+by+neuromodulators.">Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators.</a> J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).</li><li>Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slack+and+Slick+K(Na)+channels+regulate+the+accuracy+of+timing+of+auditory+neurons.">Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons.</a> J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel.">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels.">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li><li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy.">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li><li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors.">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li><li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

Steven M. Shamah è un dipendente di X-BODY Biosciences.

Il primo Z (Z &#39;) fattore è un metodo statistico comune per quantificare la qualità di un alto-capacità di screening assay 20, e poiché lo screening degli agonisti GPCR in questo saggio si è verificato in un saggio compatibile 384 pozzetti SBS, fornisce un&#39;eccellente misura della robustezza e la validità di questo test 21. Valore AZ &#39;di 1 indica un saggio teoricamente ideale, con un numero infinito di punti dati con deviazioni standard inesistenti. Valore AZ &#39;compresa tra 0,5-1...

Esaminando le cellule viventi nel loro contesto fisiologicamente rilevanti è fondamentale per la comprensione delle funzioni biologiche di bersagli cellulari. Tuttavia, i saggi che esaminano l&#39;interazione tra i canali e le proteine ​​citoplasmatiche normativi, come saggi coimmunoprecipitation, generalmente forniscono poche informazioni sul decorso temporale delle interazioni nelle cellule viventi. La maggior parte dei test cellulari attuali misurare un evento cellulare specifica, come ad esempio la traslocazione di una proteina fluorescente targhetta di interesse. Questi saggi richiedono l&#39;alterazione delle proteine ​​di interesse, che possono potenzialmente alterare il comportamento della proteina e diminuire la rilevanza fisiologica del bersaglio. Saggi cellulari non invasiva, che non richiedono manipolazione del sistema, forniscono una misura continua di attività cellulare e permettono studi di cellule nella loro più fisiologicamente rilevanti stato 4. Biosensori ottici sono progettati per produrreuna variazione misurabile in una caratteristica della luce che è accoppiato alla superficie del sensore. Biosensori ottici che utilizzano le onde evanescenti, tra cui risonanza plasmonica di superficie (SPR) e la risonanza lunghezza d&#39;onda reticolo tecniche (RWG), sono stati principalmente utilizzati per rilevare le affinità e cinetica delle molecole leganti ai loro recettori biologici immobilizzati sulla superficie del sensore. Più recentemente, disponibili in commercio biosensori RWG sono stati sviluppati per consentire il rilevamento della variazione relativa della massa all&#39;interno della porzione di fondo di cellule aderenti alla superficie del sensore ad alta risoluzione spaziale (fino a 3,75 micron / pixel) 5. Questi biosensori in grado di rilevare variazioni di massa in prossimità della membrana plasmatica di cellule viventi che derivano dalla stimolazione, come l&#39;adesione cellulare e la diffusione, la tossicità, la proliferazione e vie di segnalazione indotte da una varietà di recettori di superficie compresa recettori accoppiati alle proteine ​​G (GPCR) 6 . Biosensori RWG rilevano la relativa change nell&#39;indice di rifrazione in funzione della variazione relativa della massa entro 150 nm del biosensore 7. Quando le cellule vengono piastrate al biosensore, questa variazione dell&#39;indice di rifrazione riflette il cambiamento della massa in prossimità della membrana plasmatica della cellula risultante da un cambiamento in aderenza cellulare al biosensore. Questo protocollo discuterà la rilevazione delle interazioni proteina-canale utilizzando biosensori RWG. Sistemi di acquisizione dati RWG costituite da più componenti. Poiché l&#39;X-BODY Biosciences BIND Scanner è stato utilizzato per questi esperimenti, ci riferiremo ai componenti di questo particolare sistema, che consiste in un lettore di piastre, biosensori associati, software di acquisizione BIND Scan, e il software BIND View analisi 8. I biosensori cristallo fotonico, definiti in appresso come biosensori ottici, sono composti da una disposizione periodica di un dielettrico e materiale in 2 o 3 dimensioni che impedisce la propagazione della luce a specifichelunghezze d&#39;onda e direzioni. Strutture a cristallo fotonico si basano su un fenomeno chiamato anomalia di Wood. Prima scoperto da Wood nel 1902, queste anomalie sono effetti osservati nello spettro della luce riflessa da reticoli di diffrazione ottica in cui rapide variazioni di intensità di particolari ordini di diffrazione si verificano in determinate bande di frequenza stretti. Nel 1962, Hessel e Oliner presentato una nuova teoria delle anomalie di legno in cui finita periodo reticolo genera una lunghezza d&#39;onda di risonanza permanente 9. Nei biosensori ottici qui descritti, anomalie del legno sono usati per produrre un biosensore RWG che quando stimolate con luce bianca riflette solo banda molto stretta di lunghezze d&#39;onda (tipicamente tra 850-855 nm). Biosensori singoli costituiti da un materiale plastico a basso indice di rifrazione con una struttura superficiale periodica che è rivestita con un sottile strato di materiale dielettrico biossido di titanio ad alta rifrazione (TiO 2). Quando le Biosenso è illuminato con una sorgente di luce di lunghezza d&#39;onda ampia, il reticolo ottico di cristalli fotonici riflette una ristretta gamma di lunghezze d&#39;onda della luce che viene misurata mediante uno spettrofotometro nello scanner BIND. L&#39;intensità massima di lunghezze d&#39;onda riflesse (onda di picco di valore, o PWV) viene quindi calcolata dal segnale. La PWV di luce si sposta su una variazione dell&#39;indice di rifrazione per effetto di un aumento o una diminuzione della massa all&#39;interno della vicinanza (~ 150 nm) della superficie biosensore. Biosensori ottici sono incorporati in un Society standard per Scienze Biomolecolari (SBS) micropiastre da 384 pozzetti per i saggi utilizzati in questi esperimenti. Biosensori RWV sono utilizzati per rilevare cambiamenti dopo l&#39;aggiunta di segnali esogeni in cellule viventi 10. Le cellule sono coltivate direttamente sulla superficie di un biosensore RWG e la variazione dell&#39;indice locale della rifrazione è monitorata in seguito al trattamento con stimoli specifici. La direzione del cambiamento in massa al biosensore può esseredeterminata perché un aumento dell&#39;indice di rifrazione locale di risultati da un aumento della massa vicino al biosensore e viene misurata come un aumento PWV. Viceversa una diminuzione della massa produce una diminuzione della PWV. La variazione rilevata PWV può derivare da numerosi eventi cellulari, inclusi i cambiamenti di adesione cellulare, la proteina assunzione / release, endocitosi e riciclaggio, esocitosi, l&#39;apoptosi, e del citoscheletro riassetto. Per esempio, il dosaggio può essere rilevare cambiamenti nelle interazioni proteina-canale fra i canali del potassio e altri componenti citoplasmatici o citoscheletro. L&#39;evento, tuttavia, deve avvenire all&#39;interno della zona di rilevamento nm ~ 150 vicino al biosensore, e nel caso di una cella a schiera, in prossimità della membrana plasmatica. Acquisizione di risposte cellulari viene eseguita con software BIND Scan e viene generata una rappresentazione di immagine di ciascuna delle 384 pozzetti nella piastra SBS. Questo sistema ha una risoluzione fino a 3,75 micron / pixel, permettendo la rilevazione di eventi in singole cellule, epossono essere utilizzati sia con linee cellulari (quali cellule HEK293 o CHO) o con cellule primarie più fisiologicamente rilevanti. L&#39;analisi delle immagini con BIND Vista software permette l&#39;individuazione di risposte cellulari sia in popolazioni di cellule individuali e. Come biosensori sono incorporati in standard SBS 384 pozzetti, il sistema è facilmente adattabile a screening ad alto rendimento (HTS). Resonance d&#39;onda reticolo biosensori ottici sono stati precedentemente utilizzati per rilevare variazioni di massa vicino membrana plasmatica delle cellule dopo l&#39;attivazione del GPCR 11. Il nostro laboratorio ha clonato due canali di sodio e potassio-attivata (K Na), Slack-B e Slick 12. L&#39;attività di entrambi i canali Slack-B e Slick ha dimostrato di essere molto fortemente influenzato da attivazione diretta della proteina chinasi C (PKC) 13. Attivazione di Gα proteine ​​q recettori accoppiati, come il recettore muscarinico M1 e la mGluR1 glutammato metabotropici receptor, regola potentemente l&#39;attività dei canali attraverso l&#39;attivazione della PKC. Questi canali K Na contribuiscono all&#39;adattamento neuronale durante la stimolazione costante e regolano la precisione dei tempi di azione Potenziali 14. Canali Slack sono noti per interagire con una varietà di molecole di segnalazione citoplasmatici, tra cui FMRP, la proteina Fragile X Ritardo Mentale 15,16. Mutazioni nel risultato Slack in più crisi parziali Migrazione dell&#39;Infanzia (MMPSI), una forma ad esordio precoce di epilessia che si traduce in grave ritardo dello sviluppo 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

Canali ionici controllano le proprietà elettriche dei neuroni e altri tipi di cellule eccitabili consentendo selettivamente ioni di fluire attraverso la membrana plasmatica 1. Per regolare l&#39;eccitabilità neuronale, le proprietà biofisiche di canali ionici sono modificate da proteine ​​e molecole di segnalazione, che spesso si legano ai canali stessi per formare un complesso eteromerico canale 2,3. Saggi tradizionali esaminare l&#39;interazione tra canali e proteine ​​regolatrici richiedono etichette esogeni che possono potenzialmente alterare il comportamento della proteina e diminuire la rilevanza fisiologica del bersaglio, fornendo poche informazioni sul decorso temporale delle interazioni nelle cellule viventi. Biosensori ottici, come il sistema X-BODY Biosciences BIND Scanner, utilizzano una tecnologia priva di etichetta romanzo, risonanza lunghezza d&#39;onda reticolo (RWG) biosensori ottici, per rilevare i cambiamenti in risonanza luce riflessa nei pressi del biosensore. Questo saggio permette la rilevazione della relativacambiare in massa all&#39;interno della porzione di fondo di cellule viventi aderenti alla superficie biosensore risultanti da ligando cambiamenti indotti nella adesione cellulare e la diffusione, la tossicità, la proliferazione e cambiamenti nelle interazioni proteina-proteina in prossimità della membrana plasmatica. RWG biosensori ottici sono stati utilizzati per rilevare le variazioni di massa vicino membrana plasmatica delle cellule in seguito all&#39;attivazione dei recettori accoppiati a proteina G (GPCR), recettori tirosina chinasi e altri recettori della superficie cellulare. Cambiamenti ligando-indotta nelle interazioni proteina-canale ioni possono essere studiate usando questo test. In questo articolo, descriveremo la procedura sperimentale utilizzato per rilevare la modulazione di Slack-B sodio e potassio-attivata (K Na) canali di GPCR.

Slack-B stabilmente transfettate cellule HEK-293 e controllano untransfected HEK-293 cellule sono state seminate a 1.000 cellule / pozzetto in 384 e-ECM, rivestite RWG piastre biosensore. Immagini dal centro di 1,5 mm 2 del biosensore sono stati registrati con una risoluzione di 3,75 micron / pixel (Figura 1). Mappe gradiente di densità di massa sono stati generati pre e 30 minuti dopo aggiunta del composto con il software BIND Scan. Il BIND View software è stato utilizzato per determinare ...

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Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Tecniche biosensore ottico in grado di rilevare variazioni nella massa in prossimità della membrana plasmatica in cellule viventi e consentono di seguire le risposte cellulari in entrambe singole cellule e popolazioni di cellule. Questo protocollo descrive rilevamento della modulazione dei canali del potassio da G recettori accoppiati alle proteine ​​in cellule intatte utilizzando questo approccio.

L&#39;uso di biosensori ottici privi di etichetta per rilevare modulazione dei canali del potassio da G-recettori accoppiati a proteine

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

use-label-free-optical-biosensors-to-detect-modulation-potassium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Yale School of Medicine.  Tecniche biosensore ottico in grado di rilevare variazioni nella massa in prossimità della membrana plasmatica in cellule viventi e consentono di seguire le risposte cellulari in entrambe singole cellule e popolazioni di cellule. Questo protocollo descrive rilevamento della modulazione dei canali del potassio da G recettori accoppiati alle proteine ​​in cellule intatte utilizzando questo approccio. 

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Collegamento sonde biologiche ai biosensori ottici che utilizza silice agenti di accoppiamento silanici

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Ricerca

Bioingegneria

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Rilevamento ottico di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Una tecnica senza etichetta per l&#39;Imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

Valutazione di collagene ed elastina microarchitetture dipendente dalla pressione nelle arterie della resistenza umana, diretta da microscopia di fluorescenza privo di etichetta

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...