Il test di doppia addizione di fluorescenza di calcio ad alta produttività consente l'identificazione di nuovi ligandi di piccole molecole di un recettore accoppiato a proteine G che segnala attraverso la cascata intracellulare di calcio. Il vantaggio principale del test a doppia addizione è la rilevazione di HTS agonista e antagonista in un singolo test con le stesse cellule a condizione che il segnale di fluorescenza duri due minuti. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi GPCR che segnali attraverso la cascata di calcio, che include la maggior parte della famiglia di peptidi dei neuroni artropodi, un GPCR.
Per la riproducibilità del test, è importante ottimizzare la densità cellulare, la velocità di iniezione e la concentrazione dell'agonista noto per la seconda edizione. A dimostrare la procedura sarà Bianca Henriques-Santos, ricercatrice associata post-dottorato nel mio laboratorio. Iniziare il test di fluorescenza del calcio rimuovendo il mezzo esaurito dal pallone T-75 contenente dal 70 al 90% di BMLK confluente a tre cellule.
Lavare le cellule con 10 millilitri di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco o DPBS. Dopo aver rimosso il DPBS, staccare le cellule utilizzando due millilitri di acido etilendiamminotetraacetico allo 0,25% di tripsina o EDTA e incubare per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere otto millilitri di mezzo selettivo e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri.
Prima di centrifugare la sospensione cellulare a 1000 x g per tre minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno F-12K contenente l'1% di siero bovino fetale o FBS e 400 microgrammi per millilitro di solfato G418. Per determinare la densità cellulare della sospensione per un'ulteriore diluizione, mescolare 20 microlitri di sospensione cellulare in 20 microlitri di 0,4% di tripano blu, quindi caricare 20 microlitri di miscela in una camera di conteggio delle celle per essere letta da un contatore di celle per la densità cellulare.
Diluire la sospensione cellulare utilizzando lo stesso mezzo F-12K e portare il volume finale a 15 millilitri ad una densità di quattro volte 10 alla quinta cella per millilitro. Per seminare le cellule nella piastra Poly-D lisina o PDL codificato 384 pozzetto. Aggiungere 25 microlitri della sospensione a celle diluite in 384 pozzetti della piastra utilizzando un sistema di manipolazione dei liquidi.
Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica nell'incubatore umidificato. Il giorno successivo, invertire rapidamente la piastra del pozzo 384 confluente al 90%. Per rimuovere il mezzo speso e delicatamente asciugato su asciugamani di carta sterili due o tre volte per rimuovere tutto il liquido dal piatto.
Eseguire i passaggi successivi nella luce fioca morbida all'interno dell'armadio di biosicurezza. Quindi, aggiungere 25 microlitri del colorante di carico in ciascun pozzetto utilizzando un sistema di gestione dei liquidi erogando 12,5 microlitri in ciascun pozzetto con una velocità di aspirazione e erogazione di 3,8 microlitri al secondo. Ripetere questa fase di pipettaggio per raggiungere un volume finale di 25 microlitri in ciascun pozzetto.
Una volta fatto, coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce ambientale e incubare a 37 gradi Celsius nell'incubatore umidificato ad anidride carbonica per 30 minuti. Dopo aver equilibrato la piastra coperta per altri 30 minuti, le celle sono pronte per lo screening ad alta produttività o HTS. Quindi, centrifugare la piastra del farmaco a 1200 x g in una centrifuga a piastre per un minuto.
Trasferire la soluzione peptidica agonista 10x di Rhimi-K-1 in un serbatoio auto-friendly da 150 millilitri. Nel lettore di piastre, fare clic su Gestisci protocolli. Quindi, nel protocollo di intensità fluorescente dell'endpoint, selezionare Flow Forte pre-lettura, fare clic su avvia misurazione per misurare il segnale di fondo per l'intero test HTS.
Inserire la piastra cella nel lettore di piastre. Nel cruscotto, fai clic su un pozzetto casuale sulla piastra, quindi fai clic su una nuova altezza di messa a fuoco. Fare clic su regolazione della messa a fuoco.
Fare clic su regolazione del guadagno. Assegnarlo come 5%-10% del valore massimo misurabile di fluorescenza. Fare clic su Avvia regolazione.
Fare clic su avvia misurazione per leggere l'intera piastra per il segnale di fluorescenza di fondo in unità di fluorescenza relative o RFU. Durante la lettura della piastra, fare clic su Stato corrente per visualizzare il valore di lettura in tempo reale. Per il test a doppia addizione, pipettare 10 microlitri della soluzione di farmaco su e giù tre volte utilizzando il sistema di manipolazione del liquido e aspirare 1,5 microlitri da ciascun pozzetto della piastra del farmaco a una velocità di aspirazione di 1,0 microlitri al secondo.
Erogare 0,5 microlitri dei composti nel saggio cellulare per raggiungere una concentrazione finale di due micromolari nello 0,2% di dimetil solfossido o DMSO. Dopo aver aggiunto i composti di screening, posizionare immediatamente la piastra di analisi nel lettore di piastre. Fare clic sul programma di lettura preimpostato e leggere la piastra nelle direzioni di lettura avanti e indietro.
Smaltire un microlitro di soluzione farmacologica rimanente nelle punte immergendo le punte in un serbatoio di rifiuti da 150 millilitri contenente circa 50 millilitri di DPBS. Incubare i composti di screening con le cellule per un totale di cinque minuti, compreso il tempo all'interno del lettore di piastre nell'armadio di biosicurezza con le luci spente. Quindi, aggiungere tre microlitri del peptide agonista Rhimi-K-1 dal serbatoio nella piastra di analisi utilizzando il sistema di manipolazione del liquido utilizzando 384 punte da 12,5 microlitri.
Inserire immediatamente la piastra nel lettore di piastre. Fare clic sul programma di lettura preimpostato e leggere la piastra nelle direzioni di lettura avanti e indietro. Una volta fatto calcolare manualmente il fattore Z per il controllo di qualità di ogni saggio su piastra.
Selezionare manualmente le molecole hit dalle mappe di calore sulla piattaforma dati HTS online e calcolare la percentuale normalizzata di attivazione o NPA e attività inibitoria, o I0 per gli hit agonisti e antagonisti. Per dimostrare questo test HTS è stata utilizzata una piastra interna SAC2-34-6170 composta da 320 piccole molecole casuali. L'HTS aveva un'eccellente qualità del saggio con un fattore Z di 0,7 che riflette la qualità del test indipendente dai composti testati.
È essenziale leggere la piastra immediatamente dopo aver aggiunto l'agonista perché il segnale di fluorescenza è di breve durata. Dopo questa procedura, la molecola hit identificata deve essere convalidata attraverso saggi dose-risposta e testata in cellule che non esprimono il GPCR bersaglio per escludere colpi fuori bersaglio.
