Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Jean-Michel Ané presso il Dipartimento di Agronomia a UW-Madison per la fornitura di campioni truncatula Medicago. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della National Science Foundation (NSF) concessione CHE-0957784, l&#39;Università del Wisconsin Graduate School e la Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) e il programma Romnes Ricerca Faculty Fellowship (LL). EG riconosce un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.256.259).

1. Strumentazione <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. Utilizzare uno spettrometro di massa equipaggiati con una sorgente MALDI per l&#39;analisi di piccole molecole (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). Effettuare acquisizioni in modalità ione positivo o negativo a seconda degli analiti di interesse. Specificare un intervallo di massa di interesse e raccogliere 500 colpi laser / spot a 50 micron intervalli in entrambe le dimensioni X e Y attraverso la superficie del campione per generare immagini di ioni. La larghezza raster e numero di colpi laser possono essere regolati per ottenere rispettivamente maggiore risoluzione spaziale e l&#39;intensità del segnale massimo. Utilizzare picchi matrice DHB o standard interni applicati alla slitta o direttamente al tessuto per calibrare gli spettri di massa. </li><li> Alta Risoluzione LC-MS. (Vedi Tabella dei materiali / attrezzature) estratti del campione eseguito con LC-MS utilizzando fase inversa (RP) LC con una colonna C-18, o fase normale (NP), con una colonna HILIC a seconda delle analiti di interesse. Usa fasi mobili esfumature come appropriati per il tipo di campione specifico. Effettuare acquisizioni in modalità ioni positivi o negativi a seconda del tipo di campione. </li></ol> 2. Tissue Preparazione <ol><li> Tagliare il nodulo della radice della pianta, lasciando 3-4 mm di radice collegati al nodulo. </li><li> Subito dopo la dissezione, utilizzare pinze per posizionare il tessuto in una tazza criostato e coprire con gelatina (100 mg / ml in acqua deionizzata). E &#39;essenziale per il tessuto da attaccata al fondo della tazza con bolle d&#39;aria. </li><li> Flash congelare il tessuto posizionando la coppa in un bagno di ghiaccio / etanolo secco finché la gelatina si indurisce e diventa opaca. Conservare i campioni a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Rimuovere i campioni dal -80 ° C freezer, tagliare via la coppa criostato plastica e tagliare via l&#39;eccesso di gelatina. Montare il tessuto incorporato per il mandrino criostato con una monetina piccola quantità di temperatura di taglio ottimale (OCT) i media, pur non lasciando l&#39;ottobre toccare il tessuto. Mettere in criostatobox fino a quando i solidifica ottobre. </li><li> Lasciare il mandrino e gelatina equilibrare nella casella criostato (insieme a -20 o -25 ° C) per circa 15 min. </li><li> Utilizzare il criostato (vedi TABELLA MATERIALI / Equipment) alla sezione di tessuto circa lo spessore di una cella (8-20 micron a seconda del tipo di tessuto) e disgelo montare ogni fetta sul vetro ITO rivestite riscaldando la parte posteriore (non-ITO lato) di un vetrino ITO rivestito sul dorso della mano rivestita. Posizionare il lato ITO rivestito del vetrino riscaldato vicino alla fetta di tessuto congelato e lasciare la fetta di bastone sul vetrino. Posizionamento delle sezioni vicine sulla diapositiva fornirà un migliore allineamento durante MSI. </li></ol> 3. Matrix Applicazione <ol><li> Airbrush Applicazione di MALDI Matrix <ol><li> Tutte le procedure aerografo devono essere eseguite in una cappa aspirante. </li><li> Pulire accuratamente il contenitore della soluzione aerografo e ugello (vedi Tabella dei materiali / attrezzature) con metanolo eriempire il contenitore della soluzione con soluzione di matrice DHB (150 mg / ml nel 50% methanol/0.1% TFA v / v). </li><li> Tenere l&#39;aerografo di circa 35 cm dal campione e applicare 10-15 strati di matrice sulla superficie del vetrino con una durata di 10 sec spray e 30 sec tempo di asciugatura tra ogni cappotto. </li><li> Pulire accuratamente l&#39;aerografo nuovo con metanolo al termine per evitare di intasare dalla soluzione matrice. </li></ol></li><li> Spruzzatore automatico Applicazione di MALDI Matrix <ol><li> Seguire le istruzioni di start-up forniti dai produttori del sistema di spruzzatore automatico. </li><li> Per MSI di metaboliti in noduli radicali utilizzando 40 mg / ml (50% in methanol/0.1% TFA v / v) DHB come matrice, impostare la temperatura a ~ 80 ° C, velocità a 1250 mm / min, portata a 50 microlitri / min, e il numero di passaggi a 24. Per copertura ottimale, si raccomanda di ruotare l&#39;ugello 90 ° e / o compensare l&#39;ugello 1,5 millimetri tra ogni passata. Avviare il metodo spruzzatore. Come SIde nota, il particolare sistema di spruzzatore utilizzato qui riscalda l&#39;ugello per un&#39;evaporazione più rapida del solvente. Come solvente evapora, la concentrazione della matrice aumenta rapidamente. La matrice applicata al campione con l&#39;aerografo e lo spruzzatore automatico hanno concentrazioni confrontabili. </li><li> Seguire le istruzioni sullo spegnimento forniti dai produttori del sistema di spruzzatore automatico. </li></ol></li><li> Sublimazione Applicazione di MALDI Matrix <ol><li> Pesare 300 mg DHB nella parte inferiore della camera di sublimazione (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). </li><li> Stick il vetrino al dito freddo (porzione superiore della camera di sublimazione) con le sezioni di tessuto rivolto verso il basso con biadesivo, nastro conduttivo. Coprire tutta la parte posteriore della diapositiva con il nastro biadesivo anche per conducibilità, producendo anche deposizione di matrice. </li><li> Bloccare le metà superiore e inferiore della camera di sublimazione insieme al C-clamp. Collegare il vuoto e add ghiaccio e acqua fredda al serbatoio superiore. </li><li> Posizionare camera di sublimazione in un mantello riscaldante che è a temperatura ambiente. </li><li> Accendere la pompa a vuoto. Attendere 15 minuti e accendere il mantello di riscaldamento. Il mantello riscaldante dovrebbe raggiungere 120 ° C nel corso di 10 min. </li><li> Dopo 10 min, spegnere il fuoco, chiudere la valvola a vuoto (quindi l&#39;interno della camera rimane sotto vuoto) e spegnere la pompa a vuoto. </li><li> Lasciare la camera per venire a temperatura ambiente, aprire la valvola rilasciando la pressione del vuoto e rimuovere il campione. Le dimensioni della camera di sublimazione determinerà la quantità di matrice sublimato al vetrino. Le grandi camere di sublimazione (delle dimensioni di un bicchiere da 400 ml) utilizzerà circa 300 mg di DHB mentre le camere più piccole (la dimensione di un bicchiere da 150 ml) utilizzerà circa 100 mg di DHB e richiederanno tagliare il vetrino in modo che si inserisce nella camera. </li></ol></li></ol> 4. Acquisizione Immagine <ol> &lt;li&gt; Mark un modello + su ogni angolo del campione con una penna correttore liquido WiteOut per essere usato come &quot;insegnare punti&quot;. Posizionare il vetrino nella piastra di adattamento scorrevole MALDI e prendere un&#39;immagine ottica del campione utilizzando uno scanner. </li><li> Impostare un file di acquisizione immagine utilizzando il software fornito dalla società strumento con un passo raster di 50 micron e un diametro laser uguale o inferiore alla dimensione del passo raster. Su questo particolare strumento, l&#39;impostazione minima laser spedisce un diametro laser di impostazione laser circa 10 micron e piccolo ha un diametro di 40-50 micron. </li><li> Caricare l&#39;immagine ottica nel software e allineare la piastra con l&#39;immagine ottica. </li><li> Calibrare lo strumento prima di iniziare l&#39;acquisizione utilizzando ioni comuni matrici di cluster, standard interni, o un mix di calibrazione. </li><li> Specificano le aree di tessuto da analizzare con MSI, compreso un punto di pura matrice sul vetrino per essere utilizzato come &quot;bianco&quot;. </li><li> Inizia acquisizione. </li></ol> 5. Generazione Immagine <ol><li> Aprire il file di immagini nel software disponibile in commercio fornito dal venditore e estrarre le immagini di ioni. Altri software open-source è disponibile per MSI elaborazione dei dati 19. </li></ol> 6. Identificazione di Metaboliti <ol><li> Selezionare uno specifico m / z di interesse da parte lo spettro di massa utilizzando il software specifico del fornitore (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). Un analita può essere distinto da uno ione matrice quando un picco analita viene scelto dal spettro di massa e immagini ioni sono generati specificamente localizzata nella sezione di tessuto. </li><li> Generare un elenco di analiti di interesse e di effettuare esperimenti di MS / MS. Vedi Tabella 1 e Tabella 2 Risultati rappresentativi per le liste di campionamento di analiti. </li><li> Eseguire mirata analisi LC-MS su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione (o alta risoluzione MALDI-MS se disponibile) per ottenere accuratemisure di massa degli analiti di interesse e anche effettuare LC-MS/MS degli analiti bersaglio per ottenere modelli caratteristici di frammentazione. </li><li> Eseguire database di ricerca per determinare le identificazioni putativi per gli analiti mirati. Esempi di database metaboliti comprendono: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, e HMDB. </li><li> Per confermare le identificazioni putativi di accurata ricerca nei database di massa, far corrispondere la MS / MS da parte degli analiti mirati per MS / MS spettri di standard, letteratura, e / o software di previsione frammentazione. </li></ol>

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Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene:+a+new+matrix+for+the+selective+analysis+of+low+molecular+weight+amines+and+direct+determination+of+creatinine+in+urine+by+MALDI-TOF+MS.">2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).</li><li>Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base-driven+matrix-assisted+mass+spectrometry+for+targeted+metabolomics.">Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Jpn. 55, 145-148 (2007).</li><li>Paschke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirion-A+Software+Package+for+Automatic+Processing+of+Mass+Spectrometric+Images.">Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).</li><li>Parry, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=omniSpect:+an+open+MATLAB-based+tool+for+visualization+and+analysis+of+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+images.">omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Come discusso sopra, la preparazione del campione è la fase più critica del flusso di lavoro MSI. Incorporare il tessuto non uniforme causerà sezionamento essere difficile o impossibile in alcuni casi. La dimensione del vano e adeguato tempo di equilibrio sono cruciali per mantenere l&#39;integrità dei tessuti ed evitando piegatura e lacrime. Selezione di matrice e tecnica di applicazione giocherà un ruolo nella determinazione dei tipi di analiti da rilevare, la risoluzione spaziale, e la riproducibilità dei risul...

Il settore in crescita della metabolomica ha molte importanti applicazioni biologiche, tra cui la scoperta di biomarcatori, decifrando vie metaboliche nelle piante e negli altri sistemi biologici, e tossicologia profiling 4,6-10. Una grande sfida tecnica quando si studiano i sistemi biologici è quello di studiare percorsi metabolomica senza interrompere il loro 11. MALDI-MSI consente per l&#39;analisi diretta dei tessuti intatti che consente il rilevamento sensibile di analiti in singoli organi 12,13 e perfino singole cellule 14,15. La preparazione del campione è un passo cruciale nella produzione di immagini spettrali di massa riproducibili e affidabili. La qualità delle immagini dipende molto da fattori come il tessuto mezzo di inclusione, spessore di strato, matrice MALDI e tecnica di applicazione matrice. Per applicazioni di imaging, spessore della sezione ideale è la larghezza di una cella (8-20 micron a seconda del tipo di campione). MALDI richiede deposizione di un organico, crystallinpreparato a matrice e, tipicamente un acido debole, sul campione per assistere l&#39;ablazione analita e ionizzazione. 16 differenti matrici forniscono diverse intensità di segnale, ioni interferenti, e l&#39;efficienza di ionizzazione di diverse classi di composti. La tecnica di applicazione matrice gioca anche un ruolo nella qualità delle immagini di spettri di massa e tecniche diverse è adatto per diverse classi di analiti. Tre modalità applicative matrice vengono presentati in questo protocollo: aerografo, spruzzatore automatico, e la sublimazione. Applicazione matrice aerografo è stato ampiamente utilizzato nella diagnostica per immagini MALDI. Il vantaggio dell&#39;applicazione matrice aerografo è che è relativamente semplice e veloce. Tuttavia, la qualità dell&#39;applicazione matrice aerografo dipende fortemente dall&#39;abilità dell&#39;utilizzatore e tende ad essere meno riproducibile e provocare la diffusione di analiti, in particolare piccole molecole 17. Sistemi di spruzzatore automatici devono meccanici simili a aerografo applicazione della matrice, ma have sviluppato per rimuovere la variabilità visto con applicazione aerografo manuale, rendendo lo spray più riproducibile. Questo metodo può essere a volte più in termini di tempo di applicazione matrice aerografo tradizionale. Sia aerografo manuale e sistemi di spruzzatore automatici sono metodi di applicazione della matrice a base di solventi. Sublimazione è una tecnica di applicazione matrice secca che sta diventando sempre più popolare per l&#39;imaging spettrale di massa dei metaboliti e piccole molecole perché riduce analita diffusione, tuttavia, manca la necessaria solvente per estrarre e osservare composti massa superiore 18. Individuazione Fiducioso di metaboliti in genere richiede misurazioni di massa accurata avere identificazioni putativi seguiti da massa tandem (MS / MS) esperimenti di convalida con MS / MS spettri di essere rispetto agli standard, la letteratura, o spettri teorici. In questo protocollo alta risoluzione (massa potenza di 60.000 m / z 400 risoluzione), cromatografia liquida (LC)-MS è accoppiato MALDI-MSI per ottenere sia informazioni spaziali e identificazioni sicure di metaboliti endogeni, utilizzando Medicago truncatula radici e noduli radicali come il sistema biologico. Esperimenti MS / MS possono essere eseguite direttamente sul tessuto con MALDI-MSI o su estratti di tessuto con LC-MS e utilizzati per la validazione delle identificazioni dei metaboliti. Questo protocollo fornisce un metodo semplice per mappare metaboliti endogeni in M. truncatula, che può essere adattato e applicato al MSI di piccole molecole in vari tipi di tessuto e sistemi biologici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gelatin</td>
			<td style="width:181px;">Difco</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td>
			<td style="width:611px;">heat to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat- HM 550</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:163px;">956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&#160;</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25-75-0.8 mm (width-length-thickness)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Airbrush</td>
			<td>Paasche Airbrush Company</td>
			<td>TG-100D</td>
			<td>coupled with 75 ml steel container</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td style="width:163px;">HTX.TMSP.H021-U</td>
			<td>Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sublimation apparatus&#160;</td>
			<td>Chemglass Life Science</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>Ultimate Pressure = 1x10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:163px;">276601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">FlexImaging</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td>269841</td>
			<td>One example of &#34;vender specific software&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MALDI LTQ Orbitrap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td>
			<td>High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Q Exactive</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maldi-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in medicago truncatula root nodules

La maggior parte delle tecniche utilizzate per studiare piccole molecole, come farmaci o metaboliti endogeni, impiegare estratti tissutali che richiedono l&#39;omogeneizzazione del tessuto di interesse che potrebbe potenzialmente causare variazioni nelle vie metaboliche in fase di studio 1. Mass spettrometria di imaging (MSI) è uno strumento di analisi potente che può fornire informazioni spaziali di analiti all&#39;interno fette intatto di campioni di tessuti biologici 1-5. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per studiare vari tipi di composti tra cui proteine, peptidi, lipidi, e piccole molecole come metaboliti endogeni. Con matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI)-MSI, distribuzioni spaziali di più metaboliti possono essere rilevati simultaneamente. Qui, un metodo sviluppato specificamente per lo svolgimento di mirati metabolomica MSI esperimenti sulle radici di legumi e noduli radicali viene presentata, che potrebbe rivelare intuizioni processi biologici che avvengono. Ilmetodo qui presentato mostra un flusso di lavoro tipico MSI, dalla preparazione del campione per l&#39;acquisizione delle immagini, e si concentra sulla fase di applicazione matrice, dimostrando diverse tecniche applicative matrice che sono utili per rilevare piccole molecole. Una volta che vengono generate le immagini MS, l&#39;analisi e l&#39;identificazione dei metaboliti di interesse è discusso e dimostrato. Il flusso di lavoro standard qui presentato può essere facilmente modificato per diversi tipi di tessuto, specie molecolari, e la strumentazione.

Una panoramica sperimentale di MSI è mostrato in Figura 1. All&#39;inizio dell&#39;esperimento, preparazione del campione è un passaggio fondamentale. I noduli vengono tagliati dalla radice vegetale e incorporati in gelatina. Il tessuto deve essere appiattita contro la tazza criostato, in assenza di bolle, mentre viene congelato; questo garantirà allineamento facile e corretto del tessuto mentre viene sezionato. Quando il tessuto viene affettato, è importante tagliare il tessuto allo spessore adegua...

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MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spettrometria di imaging (MSI) è un potente strumento che può essere utilizzato per scoprire e identificare le varie specie chimiche nei tessuti intatti, preservando i composti nel loro ambiente naturale, in grado di fornire nuove intuizioni in processi biologici. Qui un metodo MSI sviluppato per l&#39;analisi di piccole molecole è descritto.

MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Root noduli

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

18.8K Views.  University of Wisconsin- Madison.  Mass spettrometria di imaging (MSI) è un potente strumento che può essere utilizzato per scoprire e identificare le varie specie chimiche nei tessuti intatti, preservando i composti nel loro ambiente naturale, in grado di fornire nuove intuizioni in processi biologici. Qui un metodo MSI sviluppato per l'analisi di piccole molecole è descritto. 

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Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

Generazione di piante Composite in Medicago truncatula Per saggi nodulazione

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

Ricerca

Biologia

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificazione di Trascrizioni e metaboliti<em&gt; Drosophila</em&gt; Teste

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution of efflux pumps from the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa in a biomimetic environment that allows for an accurate investigation of their activity of transport. Three prerequisites are fulfilled: compartmentation in a lipidic environment, use of a relevant index for transport, and generation of a proton gradient. The membrane protein transporter is reconstituted into liposomes together with bacteriorhodopsin, a light-activated proton pump that generates a proton gradient that is robust as well as reversible and tunable. The activity of the protein is deduced from the pH variations occurring within the liposome, using pyranin, a pH-dependent fluorescent probe. We describe a step-by-step procedure where membrane protein purification, liposome formation, protein reconstitution, and transport analysis are addressed. Although they were specifically designed for an RND transporter, the described methods could potentially be adapted for use with any other membrane protein transporter energized by a proton gradient.

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

We present a protocol for the in vitro investigation of efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa. This protocol allows for the generation of a robust, reversible, and tunable proton gradient within the liposome membrane and hence should be adaptable to any membrane protein energized by the protomotive force.

In vitro Indagine della MexAB Efflux pompa da Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Sincronizzazione di<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Per Indagine del ciclo cellulare batterica

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Misure contrattilità isolati su muscoli papillari per le inchieste sui Cardiac inotropo nei topi

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

Calibrazione e utilizzo delle prestazioni del microcoil MRM dimostrato sulle radici della trogola Medicago a 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

Divergenza del microbiota radicale in diversi habitat in base a reti di correlazione ponderate

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...