Questo progetto è stato finanziato in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, con il numero di progetto ZIA BC 010329.

NOTA: Questo test viene eseguito in celle 293FT. Una linea epiteliale ben caratterizzata e facilmente trasfettabile derivata da cellule renali embrionali umane. Una singola piastra di coltura confluente di 10 cm di queste cellule fornisce in genere cellule sufficienti per la semina di 20 pozzetti di piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti. Le fasi 1-3 devono essere eseguite utilizzando una tecnica sterile in una cappa di sicurezza biologica.
1. Semina cellulare (giorno 1)
NOTA: In questa fase, le cellule vengono staccate dalle piastre di coltura tissutale, contate e seminate in piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti per la trasfezione nella fase 2 (Figura 2).
<ol><li>Aspirare il terreno dalle celle nel piatto da 10 cm. Lavare le celle con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aspirare.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di acido tripsin-etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 3-5 minuti a 37 °C per staccare le cellule dal piatto.</li>
	<li>Aggiungere 9 mL di terreno eagle modificato (DMEM) completo di Dulbecco alle cellule per neutralizzare la tripsina e pipettare ripetutamente su e giù per generare una sospensione omogenea di singole cellule.</li>
	<li>Trasferire immediatamente 20 μl di cellule in una provetta da 1,7 mL e miscelare con 20 μl di colorante blu di tripano. Contare le cellule utilizzando un contatore automatico di cellule (Tabella dei materiali) o un emocitometro.</li>
	<li>Diluire le cellule a 2 x 105 cellule/mL in terreno DMEM completo e aggiungere 2 mL a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti (4 x 105 cellule/pozzetto). Incubare le cellule a 37 °C e 10% di CO2 durante la notte. NOTA: Si consiglia di utilizzare celle da 293 piedi che sono state passate meno di 20 volte. In precedenza abbiamo scoperto che l'utilizzo di celle con un numero di passaggi maggiore può comportare una riduzione dei rapporti BRET e un aumento della variabilità del segnale da pozzetto a pozzetto.</li>
</ol>2. Trasfezione cellulare (Giorno 2)
NOTA: Qui, le cellule vengono trasfettate con i costrutti di espressione pCMV5-NanoLuc-CRAF e pCMV5-14-3-3ζ-Halo, insieme al vettore vuoto pCDNA3.1 (Figura 2).
<ol><li>Prima della trasfezione, diluire i plasmidi N-BRET a 5 ng/μL e pCDNA3.1 a 100 ng/μL e numerare un set di provette sterili da 1,7 mL.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di terreno di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) a ciascuna provetta, insieme a 5 ng di pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng di pCMV5-14-3-3ζ e 200 ng di PCDNA3.1.</li>
	<li>Aggiungere 2 μl di reagente di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) e agitare delicatamente per mescolare. Centrifugare brevemente le provette in una microcentrifuga per assicurarsi che tutto il liquido venga raccolto sul fondo delle provette e quindi incubare a circa 25 °C per 15 minuti.</li>
	<li>Aggiungere complessi di trasfezione goccia a goccia alle cellule e incubare a 37 °C/10% CO2 per 16-20 ore per consentire l'espressione delle proteine marcate con alone e nano. NOTA: L'aggiunta di un DNA vettore vettore vuoto (pCDNA3.1) è essenziale per ottenere un'elevata efficienza di trasfezione dei costrutti di espressione di N-BRET. La mancata aggiunta di vettore vuoto comporta una riduzione dei livelli di espressione delle proteine 14-3-3ζ-Halo e Nano-CRAF e, a sua volta, si traduce in rapporti BRET deboli e incoerenti, come discusso in precedenza22.</li>
</ol>3. Riplaccatura cellulare (Giorno 3)
NOTA: In questa fase, le cellule vengono trasferite su una piastra a 384 pozzetti e il ligando Halo 618 (+ligando; Tabella dei materiali) o DMSO (+veicolo) viene aggiunto per leggere le emissioni BRET nel passaggio 4. Le cellule rimanenti vengono trasferite su piastre di coltura fresche a 6 pozzetti per l'analisi del western blot nella Fase 5 (Figura 2).
<ol><li>Raccogliere i seguenti materiali e preparare l'area di lavoro come descritto di seguito.<ol><li>Utilizzando un bagnomaria a 37 °C, preriscaldare la tripsina-EDTA, insieme a terreni di prova privi di siero e terreni di prova integrati con FBS al 10% (vedere la tabella dei materiali per i dettagli).</li>
		<li>In base al numero di campioni da misurare, pre-etichettare tre set di provette sterili da 1,7 mL (Set 1-3) e un set di provette sterili a fondo conico da 15 mL. Equipaggiare una centrifuga a secchio oscillante con inserti per provette da 15 mL e pre-raffreddare a 4 °C.</li>
		<li>Inserire i seguenti elementi nella cappa di coltura tissutale: serbatoi di reagenti, piastre di coltura tissutale da 384 pozzetti, piastre di coltura tissutale da 6 pozzetti, pipetta multicanale e puntali, vetrini/camere per il conteggio delle cellule e colorazione blu di tripano (Tabella dei materiali), insieme ai set di provette da 1,7 mL 1-3.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogliere e contare le celle come descritto di seguito.<ol><li>Aspirare il terreno dalle piastre a 6 pozzetti e aggiungere 250 μl di tripsina-EDTA alle cellule. Incubare le piastre a 6 pozzetti a 37 °C fino a quando le cellule iniziano a staccarsi (3-5 min).</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di terreno di coltura integrato con FBS al 10% in ciascun pozzetto per neutralizzare la tripsina e pipettare energicamente su e giù per generare una sospensione a cellula singola.</li>
		<li>Trasferire 1 mL della sospensione cellulare nelle provette da 15 mL pre-marcate. Aggiungere un altro 1 mL di terreno di prova integrato con FBS al 10% a ciascuna delle provette da 15 mL.</li>
		<li>Capovolgere le provette 5 volte per miscelare e trasferire immediatamente 20 μl di sospensione cellulare nel set di provette 1.</li>
		<li>Centrifugare nella centrifuga a secchiello oscillante pre-raffreddata per 5 minuti a ~250 x g. Durante la fase di centrifugazione, miscelare 20 μL di colorante cellulare blu di tripano con le cellule nel set di provette 1 e quindi contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Una resa di 6-8 x 105 cellule/mL è tipica.</li>
		<li>Rimuovere le provette da 15 mL dalla centrifuga e aspirare il terreno dai pellet cellulari. Risospendere i pellet cellulari a 2 x 105 cellule/mL in terreni di prova privi di siero e pipettare energicamente per generare una sospensione di singola cellula. NOTA: L'uso di terreni di prova privi di siero viene utilizzato per la quiescenza delle normali vie di segnalazione cellulare.</li>
	</ol></li>
	<li>Riplaccare le celle in piastre a 384 pozzetti e 6 pozzetti come descritto di seguito.<ol><li>Capovolgere più volte le provette da 15 mL per garantire una sospensione cellulare omogenea e trasferire le provette da 500 μL a 1,7 mL dei set 2 e 3 dei set 3.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 μl di DMSO (+veicolo) al set 2 e 0,5 μl di ligando Halo 618 (+ligando) al set di provette 3 e pipettare per miscelare.</li>
		<li>Trasferire le sospensioni di cellule +veicolo e +ligando in pozzetti separati di serbatoi di reagenti. Utilizzando la pipetta multicanale (Tabella dei materiali), trasferire 40 μl della sospensione di cellule + veicolo dai serbatoi dei reagenti ai pozzetti quadruplicati della piastra di coltura a 384 pozzetti. Ripetere questo passaggio per le sospensioni di cellule + ligando.</li>
		<li>Trasferire le cellule rimanenti in piastre di coltura fresche a 6 pozzetti. Incubare le piastre da 384 pozzetti e 6 pozzetti per una notte a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lettura delle emissioni BRET (Giorno 4)
NOTA: In questa fase il substrato della nanoluciferasi (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) viene aggiunto alle cellule nella piastra di coltura a 384 pozzetti e vengono lette le emissioni dell'accettore N-BRET (618 nm) e del donatore (460 nm) (Figura 2). Vengono quindi calcolati i rapporti BRET corretti.
<ol><li>Preriscaldare i terreni di prova privi di siero in un bagno d'acqua a 37 °C e scongelare il substrato della nanoluciferasi a 25 °C. Diluire il substrato della nanoluciferasi 1:100 in un terreno di prova privo di siero e trasferirlo in un serbatoio di reagenti. Preparare una quantità sufficiente di questa miscela per aggiungere 10 μl a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti, più il 10%-15% di volume extra.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta multicanale (Tabella dei materiali), trasferire 10 μl della miscela di substrato in ciascuno dei pozzetti che contengono le cellule nella piastra di coltura a 384 pozzetti. Ruotare delicatamente la piastra per 1 minuto, manualmente o utilizzando uno shaker orbitale.</li>
	<li>Inserire la piastra da 384 pozzetti nel lettore di piastre multimodale e registrare le emissioni di 460 nm e 618 nm per tutti i pozzetti che contengono celle. NOTA: Per il lettore di piastre multimodale utilizzato per questa fase (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli), è stata utilizzata un'altezza di lettura di 6,5 mm, con una misurazione del tempo di lettura di 0,1 s, tuttavia potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione se si utilizzano altri lettori di piastre.</li>
	<li>Calcolare i rapporti BRET grezzi per +veicolo e +ligando in unità milliBRET (mBU) singolarmente, utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66436/66436eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Calcolare il rapporto BRET corretto sottraendo il rapporto BRET +veicolo da quello del +Ligando (Tabella supplementare 1). NOTA: Quando si confrontano i risultati di più esperimenti, i rapporti BRET corretti possono essere raggruppati e normalizzati alla media della coppia N-BRET Wildtype (WT), costituita da Nano-CRAFWT e 14-3-3ζWT-Halo (Tabella supplementare 1).</li>
</ol>5. Conferma dei livelli di espressione proteica (giorni 4 e 5)
NOTA: In questa fase le cellule nelle piastre a 6 pozzetti vengono lisate e i livelli di espressione proteica delle proteine Nano-CRAF e 14-3-3ζ-Halo vengono determinati mediante analisi western blot utilizzando anticorpi specifici per i tag Halo e Nano. (Figura 2).
<ol><li>Aggiungere gli inibitori della proteasi e della fosfatasi al tampone di lisi NP40 (Tabella dei materiali), ottenendo 200 μL di tampone di lisi per campione.</li>
	<li>Aspirare i terreni da piastre a 6 pozzetti che contengono cellule. Lavare le cellule una volta con 1 mL di PBS freddo e aspirare.</li>
	<li>Aggiungere 125 μl di tampone di lisi NP40 a ciascun pozzetto e incubare piastre a 6 pozzetti a 4 °C su una piattaforma oscillante per 15 minuti per lisare le cellule.</li>
	<li>Trasferire i lisati in provette da 1,7 mL su ghiaccio e centrifugare a 20.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Riposizionare i lisati chiarificati sul ghiaccio e determinare la concentrazione proteica utilizzando saggi disponibili in commercio, come i saggi di Bradford o dell'acido bicinconninico (BCA).</li>
	<li>Normalizzare la concentrazione proteica in tutti i campioni trasferendo un volume appropriato di lisato e tampone di lisi NP40 in provette fresche da 1,7 mL per un volume totale di 100 μL.</li>
	<li>Far bollire 5 tamponi per campioni di proteine (Tabella dei materiali) per 1 minuto e aggiungere 25 μl a ciascun campione. Far bollire i campioni per 5-6 minuti, quindi centrifugare brevemente le provette con impulsi per assicurarsi che tutto il campione si raccolga alla base della provetta.</li>
	<li>Caricare 25 μL di campione in ciascun pozzetto di gel proteici duplicati (Gel 1 e Gel 2) e quindi trasferire le proteine su membrane di nitrocellulosa o PVDF utilizzando le procedure standard di western blotting, come descritto in precedenza22.</li>
	<li>Bloccare le membrane in BSA-PBS al 3% a 25 °C per 30 minuti e quindi incubare le membrane durante la notte con l'anticorpo Halo (diluizione 1:1.000; Gel 1) e anticorpi nanoluciferasi o CRAF (diluizione 1:500; Gel 2) in soluzione salina tris-tamponata, addizionato con Tween-20 allo 0,2% (TBST; Tabella dei materiali).</li>
	<li>Lavare le membrane 1 volta per 5 minuti in 10 mL di TBST e quindi incubare a temperatura ambiente per 1 ora con l'anticorpo secondario anti-topo HRP, diluito 1:10.000 in TBST.</li>
	<li>Lavare le membrane 3 volte su una piattaforma oscillante in 10 mL di TBST a 25 °C per 5 minuti ciascuna. Rimuovere la TBST e visualizzare le bande proteiche utilizzando i reagenti ECL e un processore di pellicole radiografiche o un altro sistema di imaging appropriato.</li>
</ol>

Analisi dell'interazione CRAF-14-3-3 in cellule vive utilizzando un approccio basato su BRET

<ol>
	<li>Blasco, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Raf,+but+not+B-Raf,+is+essential+for+development+of+K-Ras+oncogene-driven+non-small+cell+lung+carcinoma.">c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma.</a> Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).</li><li>Blasco, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+regression+of+advanced+pancreatic+ductal+adenocarcinomas+upon+combined+inhibition+of+EGFR+and+C-RAF.">Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF.</a> Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).</li><li>Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+gain-of-function+mutations+in+RAF1+cause+Noonan+syndrome.">Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).</li><li>Terrell, E. M., Morrison, D. 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A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+BRAF+monomer-to-dimer+transition+mediated+by+RAS+binding.">Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding.</a> Nat Commun. 13, 486 (2022).</li><li>Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Raf+dimerization+in+cell+signaling.">The importance of Raf dimerization in cell signaling.</a> Small GTPases. 4, 180-185 (2013).</li><li>Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+measuring+BRAF+autoinhibition+in+live+cells+using+a+proximity-based+NanoBRET+assay.">Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay.</a> STAR Protoc. 4, 102461 (2023).</li><li>Clark, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+zeta+negatively+regulates+raf-1+activity+by+interactions+with+the+Raf-1+cysteine-rich+domain.">14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain.</a> J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).</li><li>Machleidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBRET--A+novel+BRET+platform+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions.">NanoBRET--A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions.</a> ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).</li><li>Hekman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+C-Raf+phosphorylation+and+14-3-3+protein+binding+in+response+to+growth+factor+stimulation:+differential+roles+of+14-3-3+protein+binding+sites.">Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites.</a> J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464, 431-435 (2010).</li><li>Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+the+measurement+of+Raf-1+kinase+activity.">A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity.</a> Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Roy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+facilitates+Ras-dependent+Raf-1+activation+in+vitro+and+in+vivo.">14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).</li><li>Durrant, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+NanoBRET+screening+platform+to+identify+modulators+of+the+RAS/RAF+interaction.">Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction.</a> Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).</li></ol>

Nulla da rivelare.

Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine 14-3-3 svolgono un ruolo critico sia nell'attivazione che nell'inibizione delle chinasi RAF. Comprendere come questi eventi di legame sono regolati e gli effetti della modulazione di queste interazioni sulla segnalazione RAF e sull'oncogenesi guidata da RAF potrebbe scoprire nuove vulnerabilità terapeutiche che mirano alla funzione di CRAF. Tuttavia, il ciclo di attivazione di Raf è supportato da una pletora di proteine associate, modifiche post-traduzionali e cambiamen...

Le chinasi RAF (ARAF, BRAF e CRAF) sono gli effettori diretti delle GTPasi RAS e i membri iniziatori della cascata chinasica RAF-MEK-ERK pro-proliferativa/pro-sopravvivenza. Studi recenti hanno dimostrato che l'espressione di CRAF svolge un ruolo chiave nella tumorigenesi di diversi tumori guidati da KRAS, tra cui il carcinoma polmonare non a piccole cellule e l'adenocarcinoma duttale pancreatico 1,2,3,4,5. Inoltre, le mutazioni germinali della CRAF causano una forma particolarmente grave di RASopathy, la sindrome di Noonan 6,7. Comprendere la regolazione del CRAF è fondamentale per lo sviluppo di approcci terapeutici di successo che mirino alla sua funzione nelle cellule.
Tutte le chinasi RAF possono essere suddivise in due domini funzionali, un dominio catalitico C-terminale (CAT) e un dominio regolatorio N-terminale (REG), che ne controlla l'attività (Figura 1A)8. Il dominio REG comprende il dominio di legame RAS (RBD), il dominio ricco di cisteina (CRD) e una regione ricca di serina/treonina (S/T-rich). In particolare, la regione ricca di S/T contiene il sito N', che si lega a 14-3-3 in modo dipendente dalla fosforilazione (S259 in CRAF; Figura 1A) 8. Il dominio CAT comprende il dominio chinasi, insieme a un secondo sito di docking 14-3-3 ad alta affinità, denominato sito C' (S621 in CRAF; Figura 1A) 8. Il legame differenziale delle proteine dimeriche 14-3-3 ai siti N' e C', insieme alla CRD, svolge un ruolo critico sia nell'attivazione che nell'inibizione di RAF 9,10,11,12,13. In condizioni normali di segnalazione, l'attivazione di RAF è avviata dal suo reclutamento nella membrana plasmatica da parte di RAS, permettendogli di formare dimeri attivi, di cui l'eterodimero BRAF-CRAF è la forma attiva predominante14,15. I saggi biochimici con BRAF e CRAF, insieme alle strutture di microscopia elettronica criogenica (Cryo-EM) di BRAF dimerico, indicano che un dimero 14-3-3 stabilizza i dimeri attivi di RAF legandosi simultaneamente al sito C' di entrambi i protomeri RAF (Figura 1B)9,13,16,17. Al contrario, gli studi hanno dimostrato che in condizioni di quiescenza, RAF adotta una conferma citosolica, autoinibita, in cui il dominio REG si lega al dominio CAT e ne inibisce l'attività 12,18,19,20. Questo stato chiuso è stabilizzato da un dimero 14-3-3 legato al sito CRD e N' nel dominio REG e al sito C' nel dominio CAT (Figura 1B)10,13,21. In BRAF, questo modello è supportato da recenti strutture Cryo-EM di monomeri BRAF autoinibiti e dai nostri precedenti studi biochimici 10,12,13,21,22. Tuttavia, mentre è dimostrato che 14-3-3 svolge un ruolo inibitorio nella regolazione di CRAF23, uno stato autoinibito simile a BRAF può svolgere un ruolo minore nella regolazione di CRAF12; pertanto sono necessari ulteriori studi per chiarire i meccanismi con cui le proteine 14-3-3 regolano l'attività di CRAF. La regolazione mediata da 14-3-3 delle chinasi RAF richiede una pletora di eventi di fosforilazione e de-fosforilazione di RAF, il legame con varie proteine regolatorie e le interazioni con la membrana plasmatica8. Pertanto, è fondamentale che le interazioni 14-3-3-RAF siano misurate in condizioni fisiologicamente rilevanti e in presenza di un doppio strato lipidico intatto.
Per risolvere questo problema, è stata utilizzata la tecnologia NanoBRET (d'ora in poi denominata N-BRET; vedere la Tabella dei materiali per i dettagli del kit) per sviluppare un test basato sulla prossimità per misurare le interazioni di CRAF con le proteine 14-3-3 nelle cellule vive (Figura 1C). Questo sistema basato su BRET misura le interazioni di due proteine di interesse (POI), in cui una proteina è marcata con un donatore di nanoluciferasi (Nano) e l'altra con un tag Halo, per la marcatura con il ligando accettore di energia Halo61822,24. L'interazione delle proteine di interesse si traduce nel trasferimento di energia da donatore a accettore, che a sua volta genera il segnale BRET (Figura 1C). La proteina donatrice Nano estremamente brillante (emissione (em) 460 nm) e il ligando Halo618 (em 618 nm) forniscono una maggiore separazione spettrale e sensibilità rispetto al BRET convenzionale, rendendola una piattaforma ideale per studiare le interazioni più deboli e rilevare sottili cambiamenti nel legame24. Infatti, abbiamo precedentemente sviluppato un test basato su N-BRET per misurare le interazioni autoinibitorie dei domini RAF REG e CAT, che è stato essenziale per la caratterizzazione di un pannello di mutazioni di RASopathy nella CRD di BRAF e ha dimostrato l'importanza critica di questo dominio per mantenere l'autoinibizione e prevenire l'attivazione costitutiva di BRAF12.
Il test qui descritto misura le interazioni tra CRAF, fuso con un tag Nano N-terminale (Nano-CRAF), e l'isoforma zeta di 14-3-3 fusa con il tag Halo C-terminale (14-3-3ζ-Halo; Figura 1C). Dimostriamo che le interazioni di Nano-CRAF con 14-3-3ζ-Halo generano un robusto segnale BRET, che a sua volta può essere interrotto da mutazioni che impediscono il legame di 14-3-3 al sito N' (S259A) e/o al sito C' (S621A). Il seguente protocollo fornisce passaggi dettagliati per l'esecuzione, l'ottimizzazione e la risoluzione dei problemi di questo test.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211&#160;</td>
			<td>Antibody for detecting HaloTag tagged&#160; proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td>Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRAF mouse monoclonal antibody (E10)&#160;</td>
			<td>Santa Crus Biotechnology</td>
			<td>sc-7267</td>
			<td>Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP secondary antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931-1ML&#160;</td>
			<td>Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE&#8482; 9</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>6365809001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBRET&#8482; kit&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1661&#160;</td>
			<td>NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, without Ca++ and Mg++&#160;</td>
			<td>Quality Biologicals&#160;</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995073</td>
			<td>High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium&#160; pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)&#160;&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#8482; I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For cell transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum media, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Trypan Blue Stain&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>T10282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 lysis buffer&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,&#160; NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 &#181;M leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x gel sample buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells (human)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>R70007&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-14-3-3&#950;-Halo&#160;&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision 2104 Multimode Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer 2104</td>
			<td>2104-0010&#160;</td>
			<td>600LP NanoBRET &#38; M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,&#160; Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Countess&#8482; II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMQAX1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher E1-ClipTip&#8482;&#160; Multichannel&#160; Pipettor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>4672070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (version 10.0.3)&#160;</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>94410153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1228K16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer 384-well CulturPlate&#8482;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007680</td>
			<td>White, polystyrene, tissue culture treated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence resonance energy transfer (bret)-based assay for measuring interactions of craf with 14-3-3 proteins in live cells

La CRAF è un effettore primario delle GTPasi RAS e svolge un ruolo critico nella tumorigenesi di diversi tumori guidati da KRAS. Inoltre, la CRAF è un hotspot per le mutazioni germinali, che hanno dimostrato di causare la RASopathy evolutiva, la sindrome di Noonan. Tutte le chinasi RAF contengono più siti di legame dipendenti dalla fosforilazione per le proteine regolatorie 14-3-3. Il legame differenziale di 14-3-3 a questi siti gioca un ruolo essenziale nella formazione di dimeri attivi di RAF sulla membrana plasmatica in condizioni di segnalazione e nel mantenimento dell'autoinibizione di RAF in condizioni di quiescenza. Comprendere come queste interazioni sono regolate e come possono essere modulate è fondamentale per identificare nuovi approcci terapeutici che mirano alla funzione dei RAF. Qui, descrivo un saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per misurare le interazioni di CRAF con le proteine 14-3-3 nelle cellule vive. In particolare, questo test misura le interazioni di CRAF fuso a un donatore di nano luciferasi e 14-3-3 fuso a un accettore di tag Halo, dove l'interazione di RAF e 14-3-3 determina il trasferimento di energia da donatore a accettore e la generazione del segnale BRET. Il protocollo mostra inoltre che questo segnale può essere interrotto da mutazioni che hanno dimostrato di impedire il legame di 14-3-3 a ciascuno dei suoi siti di attracco RAF ad alta affinità. Questo protocollo descrive le procedure per la semina, la trasfetzione e la riplaccatura delle cellule, insieme a istruzioni dettagliate per la lettura delle emissioni di BRET, l'esecuzione dell'analisi dei dati e la conferma dei livelli di espressione proteica. Inoltre, vengono forniti esempi di risultati dei saggi, insieme alle fasi di ottimizzazione e risoluzione dei problemi.

RAF kinases (ARAF, BRAF, and CRAF) are the direct effectors of RAS GTPases and the initiating members of the pro-proliferative/pro-survival RAF-MEK-ERK kinase cascade. Recent studies have shown that CRAF expression plays a key role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers, including non-small cell lung cancer and pancreatic ductal adenocarcinoma1,2,3,4,5. Moreover, germline CRAF mutations cause a particularly severe form of the RASopathy, Noonan syndrome6,7. Understanding CRAF regulation is critical for developing successful therapeutic approaches that target its function in cells.
All RAF kinases can be divided into two functional domains, a C-terminal catalytic (CAT) domain and an N-terminal regulatory (REG) domain, that controls its activity (Figure 1A)8. The REG domain encompasses the RAS binding domain (RBD), the cysteine-rich domain (CRD), and a serine/threonine-rich region (S/T-rich). Notably, the S/T-rich region contains the N&#39; site, which binds to 14-3-3 in a phosphorylation-dependent manner (S259 in CRAF; Figure 1A)8. The CAT domain encompasses the kinase domain, along with a second high-affinity 14-3-3 docking site, referred to as the C&#39; site (S621 in CRAF; Figure 1A)8. The differential binding of dimeric 14-3-3 proteins to the N&#39; and C&#39; sites, along with the CRD, plays critical roles in both RAF activation and inhibition9,10,11,12,13. Under normal signaling conditions, RAF activation is initiated by its recruitment to the plasma membrane by RAS, allowing it to form active dimers, of which the BRAF-CRAF heterodimer is the predominant active form14,15. Biochemical assays with BRAF and CRAF, along with cryogenic electron microscopy (Cryo-EM) structures of dimeric BRAF, indicate that a 14-3-3 dimer stabilizes active RAF dimers by binding simultaneously to the C&#39; site of both RAF protomers (Figure 1B)9,13,16,17. Conversely, studies have shown that under quiescent conditions, RAF adopts a cytosolic, autoinhibited confirmation, where the REG domain binds to the CAT domain and inhibits its activity12,18,19,20. This closed state is stabilized by a 14-3-3 dimer bound to the CRD and N&#39; site in the REG domain and to the C&#39; site in the CAT domain (Figure 1B)10,13,21. In BRAF, this model is supported by recent Cryo-EM structures of autoinhibited BRAF monomers and by our previous biochemical studies10,12,13,21,22. However, while 14-3-3 is shown to play an inhibitory role in CRAF regulation23, a BRAF-like autoinhibited state may play a lesser role in CRAF regulation12; therefore further studies are required to clarify the mechanisms by which 14-3-3 proteins regulate CRAF activity. The 14-3-3-mediated regulation of RAF kinases requires a plethora of RAF phosphorylation and de-phosphorylation events, the binding to various regulatory proteins, and interactions with the plasma membrane8. Therefore, it is critical that 14-3-3-RAF interactions are measured under physiologically relevant conditions and in the presence of an intact lipid bilayer.
To address this issue, NanoBRET (from here on referred to as N-BRET; see Table of Materials for kit details) technology was utilized to develop a proximity-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells (Figure 1C). This BRET-based system measures the interactions of two proteins of interest (POI), where one protein is tagged with a nanoluciferase (Nano) donor and the other with a Halo tag, for labeling with the Halo618 energy acceptor ligand22,24. Interaction of the proteins of interest results in donor to acceptor energy transfer, which in turn generates the BRET signal (Figure 1C). The extremely bright Nano donor protein (emission (em) 460 nm) and the Halo618 ligand (em 618 nm) provide greater spectral separation and sensitivity over conventional BRET, making it an ideal platform for studying weaker interactions and detecting subtle changes in binding24. Indeed, we previously developed a N-BRET-based assay for measuring the autoinhibitory interactions of the RAF REG and CAT domains, which was essential for the characterization of a panel of RASopathy mutations in the BRAF CRD and demonstrated the critical importance of this domain for maintaining autoinhibition and preventing constitutive BRAF activation12.
The assay described here measures the interactions of CRAF, fused to an N-terminal Nano tag (Nano-CRAF), and the zeta isoform of 14-3-3 fused to C-terminal Halo tag (14-3-3&#950;-Halo; Figure 1C). We show that the interactions of Nano-CRAF with 14-3-3&#950;-Halo generates a robust BRET signal, which can in turn be disrupted by mutations which prevent 14-3-3 binding to the N&#39; site (S259A) and/or the C&#39; site (S621A). The following protocol provides detailed steps for performing, optimizing, and troubleshooting this assay.

Autore in primo piano: Integrazione di saggi basati su BRET e analisi di mutazioni rare per decifrare la regolazione della chinasi RAF nelle cellule vive

Saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per la misurazione delle interazioni di CRAF con proteine 14-3-3 in cellule vive

The primary focus of our research is to uncover new vulnerabilities in the Ras-MAPK kinase pathway through the study of rare disease associated mutations within. We recently developed another BRET-based assay for measuring the auto inhibitory activities of RAF kinases in live cells. Importantly, this assay was essential for characterizing a group of rare germline mutations in the BRAF cysteine rich domain, which demonstrated the critical importance of this domain for maintaining BRAF auto inhibition and for preventing constitutive BRAF biological activity.This assay measures the interactions of 1433 proteins with the RAF kinase CRAF, and these interactions play essential roles in mediating RAF function in both development and disease. In addition, this assay combined with previously established assays for measuring RAF auto inhibition and the RAF-RAF interaction form the basis of a toolkit for dissecting the regulatory mechanisms of RAF kinases in live cells.

Se eseguita come descritto in questo protocollo (Figura 2), l'interazione di Nano-CRAFWT e 14-3-3ζ-Halo dovrebbe produrre rapporti BRET corretti di 50-60 mBU (Figura 3A; Tabella supplementare 1). CRAF contiene due siti di attracco 14-3-3 dipendenti dalla fosforilazione, il sito N' e il sito C' (Figura 1)8. Pertanto, i controlli appropriati per ridurre il legame CRAF:14-3-3ζ inclu...

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Questo protocollo descrive un saggio basato su BRET per misurare le interazioni della chinasi CRAF con le proteine 14-3-3 in cellule vive. Il protocollo delinea i passaggi per la preparazione delle celle, la lettura delle emissioni BRET e l'analisi dei dati. Viene inoltre presentato un risultato di esempio con l'identificazione dei controlli appropriati e la risoluzione dei problemi per l'ottimizzazione del saggio.

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot ...

L'obiettivo principale della nostra ricerca è quello di scoprire nuove vulnerabilità nella via della chinasi Ras-MAPK attraverso lo studio delle mutazioni associate a malattie rare. Recentemente abbiamo sviluppato un altro test basato su BRET per misurare le attività autoinibitorie delle chinasi RAF nelle cellule vive. È importante sottolineare che questo test è stato essenziale per caratterizzare un gruppo di rare mutazioni germinali nel dominio ricco di cisteina BRAF, che ha dimostrato l'importanza critica di questo dominio per il mantenimento dell'autoinibizione di BRAF e per la prevenzione dell'attività biologica costitutiva di BRAF.Questo test misura le interazioni delle proteine 1433 con la chinasi RAF CRAF e queste interazioni svolgono un ruolo essenziale nel mediare la funzione di RAF sia nello sviluppo che nella malattia. Inoltre, questo test, combinato con saggi precedentemente stabiliti per misurare l'autoinibizione di RAF e l'interazione RAF-RAF, costituisce la base di un toolkit per sezionare i meccanismi di regolazione delle chinasi RAF in cellule vive.

bioluminescence-resonance-energy-transfer-bret-based-assay-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

640 Views.  Medical University of South Carolina. L'obiettivo principale della nostra ricerca è quello di scoprire nuove vulnerabilità nella via della chinasi Ras-MAPK attraverso lo studio delle mutazioni associate a malattie rare. Recentemente abbiamo sviluppato un altro test basato su BRET per misurare le attività autoinibitorie delle chinasi RAF nelle cellule vive. È importante sottolineare che questo test è stato essenziale per caratterizzare un gruppo di rare mutazioni germinali nel dominio ricco di cisteina BRAF, che ha dimostrato...

Video: Autore in primo piano: Integrazione di saggi basati su BRET e analisi di mutazioni rare per decifrare la regolazione della chinasi RAF nelle cellule vive

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot for germline mutations, which are shown to cause the developmental RASopathy, Noonan syndrome. All RAF kinases contain multiple phosphorylation-dependent binding sites for 14-3-3 regulatory proteins. The differential binding of 14-3-3 to these sites plays essential roles in the formation of active RAF dimers at the plasma membrane under signaling conditions and in maintaining RAF autoinhibition under quiescent conditions. Understanding how these interactions are regulated and how they can be modulated is critical for identifying new therapeutic approaches that target RAF function. Here, I describe a bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells. Specifically, this assay measures the interactions of CRAF fused to a Nano luciferase donor and 14-3-3 fused to a Halo tag acceptor, where the interaction of RAF and 14-3-3 results in donor-to-acceptor energy transfer and the generation of the BRET signal. The protocol further shows that this signal can be disrupted by mutations shown to prevent 14-3-3 binding to each of its high-affinity RAF docking sites. This protocol describes the procedures for seeding, transfecting, and replating the cells, along with detailed instructions for reading BRET emissions, performing data analysis, and confirming protein expression levels. In addition, example assay results, along with optimization and troubleshooting steps, are provided.

This protocol describes a BRET-based assay for measuring the interactions of the CRAF kinase with 14-3-3 proteins in live cells. The protocol outlines steps for preparing the cells, reading BRET emissions, and data analysis. An example result with identification of appropriate controls and troubleshooting for assay optimization is also presented.

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Transfection of 293FT Cells with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo Expression Constructs

To begin, take 293FT cells cultured in a 10 centimeter dish, and aspirate the media. Wash cells with five milliliters of PBS. Then add one milliliter of trypsin EDTA, and incubate for 3-5 minutes at 37 degrees Celsius to detach cells from the dish.After incubation, add nine milliliters of complete DMEM to the cells to neutralize the trypsin. Pipette up and down repeatedly to generate a homogenous single cell suspension, and transfer the cells to a 15 milliliter tube. Immediately transfer 20 microliters of cells to a 1.7 milliliter tube, and mix with 20 microliters of trypan blue stain.Count cells using either an automated cell counter or a hemocytometer. Transfer the appropriate volume of cells to a 50 milliliter tube, and dilute in complete DMEM. Add two milliliters of cell suspension to each well of a six-well plate.Incubate cells at 37 degrees Celsius and 10%carbon dioxide overnight. Prior to transfection, dilute nanoluciferase CRAF and 1433 zeta halo plasmids, along with a pCDNA3 empty vector in TE buffer. Label a set of sterile 1.7 milliliter tubes.Add 100 microliters of transfection media to each tube, along with the expression constructs. Now add two microliters of transfection reagent, and vortex gently to mix. Pulse spin the tubes briefly in a microcentrifuge, and then incubate the tubes at around 25 degrees Celsius for 15 minutes to allow transfection complexes to form.Afterwards, add transfection complexes to cells dropwise, and incubate at 37 degrees Celsius for 16-20 hours to express the halo and nanotagged proteins.

Trasfezione di cellule 293FT con costrutti di espressione pCMV5-NanoLuc-CRAF e pCMV5-14-3-3ζ-Halo

Preparing 293FT Cells Transfected with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo for BRET Emission Assay

To begin, label three sets of sterile 1.7-milliliter tubes and one set of sterile 15-milliliter conical bottom tubes. Prepare a swing bucket centrifuge with 15-milliliter tube inserts and pre-cool to four degrees Celsius. Take the six-well cell culture plate with transfected 293FT cells.Aspirate the media from the wells. Add 250 microliters of trypsin-EDTA and incubate at 37 degrees until cells begin to detach. Then add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each well and pipette vigorously to create a single-cell suspension.Transfer one milliliter of cell suspension to pre-labeled 15-milliliter tubes. Add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each of these tubes and invert five times to mix. Then immediately transfer 20 microliters of cell suspension to tube set one.Now centrifuge the 15 milliliter tubes for five minutes at 250 g in a pre-cooled centrifuge. Mix 20 microliters of trypan blue cell stain with cells in set one and count using a cell counter or hemocytometer. After removing the 15-milliliter tubes from the centrifuge, aspirate media from cell pellets and resuspend pellets in serum-free assay media to create a single-cell suspension.To reflate cells in 384-well and six-well plates, invert the 15-milliliter tubes several times for a homogenous cell suspension and transfer 500 microliters to 1.7 milliliter tubes in set two and set three. Add 0.5 microliters of DMSO to set two and 0.5 microliters of Halo 618 ligand to tube set three and mix well. Transfer the DMSO and ligand-positive cell suspensions to separate wells of reagent reservoirs.Use a multi-channel pipette to transfer 40 microliters of each suspension to the 384-well culture plate. Transfer the remaining cells to fresh six-well culture plates for subsequent western blot analysis and incubate both 384-well and six-well plates overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Take serum-free assay media prewarmed at 37 degrees Celsius.Dilute the thawed nanoluciferase substrate 1:100 in serum-free assay media and transfer it to a reagent reservoir. Using a multi-channel pipette, transfer 10 microliters of substrate mixture to each well of the 384-well culture plate. Gently rotate the plate for one minute.Insert the 384-well plate into a multi-mode plate reader and record the 460 and 618 nanometers emissions from all wells with cells. Calculate the raw BRET ratios for vehicle-positive and ligand-positive in milliBRET units using the given equation. Calculate the corrected BRET ratio by subtracting the vehicle-positive BRET ratio from that of the ligand-positive.The nano-CRAFS259A mutant reduces the BRET signal by approximately 45%and the nano-CRAFS621A mutant by around 25%The double mutant nearly eliminates the BRET signal.