Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla localizzazione delle proteine e sulle dinamiche negli organismi fotosintetici. Combinando il metodo di fotobleaching con il microscopio a super risoluzione, siamo in grado di rilevare la dinamica proteica degli organismi fotosintetici in un dettaglio notevole. Questo metodo non solo fornisce informazioni sulla dinamica proteica del proclorococco.
Può anche essere applicato a molti altri organismi contenenti radio-re-dop-sing e batterioclorofilla. A dimostrare questa procedura sarà Yanxin Liu, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per iniziare, aggiungere cinque millilitri di mezzo Pro99 a base di acqua di mare a un pallone da coltura e inocularlo con un millilitro di Prochlorococcus MED4.
Far crescere il Prochlorococcus a 23 gradi Celsius sotto una luce con un'intensità di 35 fotoni di micromoli per metro quadrato. Dopo cinque giorni, raccogliere un millilitro della coltura in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di formaldeide appena preparata al tubo per fissare la coltura.
Incubare al buio a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi, fai girare il campione a 13.500 volte G per un minuto. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in 100 microlitri di mezzo Pro99.
Conservare il campione a quattro gradi Celsius al buio fino a quando non è pronto per eseguire l'immunosottenzione. In primo luogo, vortice il flaconcino di perline di polistirolo. Utilizzando il 50% di etanolo, preparare una diluizione uno-a-20.000 come liquame funzionante.
Accendere la piastra calda e impostare la temperatura su 120 gradi Celsius. Quindi, posizionare i coprisparsi sulla piastra calda. Caricare 100 microlitri del liquame di lavoro su ogni coverlip e incubare i coprispavimenti sulla piastra calda per 10 minuti.
Quindi trasferire con cura le coverlips alle piastre di Petri lato perline verso l'alto per la conservazione a temperatura ambiente. Quando sei pronto a rivestire le copertine, recuperane una, assicurandoti che sia lato perline verso l'alto. Aggiungere 100 microlitri di una soluzione di milligrammo per millilitro poli-L-lisina al centro del coperchio e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Successivamente, utilizzare una pipetta per aspirare con cura qualsiasi poli-L-lisina non attaccata e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitri. Conservare questa poli-L-lisina a quattro gradi Celsius per un uso successivo. Risciacquare il coperchio con 10 millilitri di acqua ultra filtrata in una piastra di Petri di 60 millimetri e quindi asciugarlo brevemente con un tovagliolo di carta.
Trasferire il coverslip rivestito su una nuova piastra di Petri con Parafilm nella parte inferiore, che verrà utilizzata come piatto di colorazione. Caricare 100 microlitri del campione fisso sul coperchio e lasciarlo riposare per 30 minuti per consentire l'attacco cellulare. Quindi, utilizzare un tovagliolo di carta per assorbire la soluzione rimanente e quindi trasferire il coperchio in un pozzo in una piastra da 12 po 'per il lavaggio.
Aggiungere un millilitro di tampone PBS al pozzo per lavare il coverslip. Quindi rimuovere il PBS e aggiungere un millilitro di PBS fresco per lavare il coverslip una seconda volta. Utilizzare una pipetta per rimuovere il PBS e sostituirlo con un millilitro di tampone di permeabilizzazione appena preparato.
Incubare il piatto di lavaggio a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi rimuovere il buffer di permeabilizzazione. Iniziare il processo di lavaggio aggiungendo un millilitro di tampone PBS fresco.
Posizionare il piatto di lavaggio su uno shaker per agitare delicatamente il piatto per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il PBS e ripetere il processo di lavaggio tre volte. Trasferire la coverslip lavata sul piatto di colorazione.
Aggiungere 50 microlitri di buffer di blocco sulla parte superiore del coverslip. Posizionare l'intero piatto di colorazione sul ghiaccio e quindi spostarlo sotto la fonte di luce allo xeno per il fotobleaching per almeno 60 minuti. Dopo il fotobleaching e il blocco, utilizzare il bordo di un tovagliolo di carta per rimuovere il buffer di blocco.
In primo luogo, diluire un microlitro di anticorpo anti-FtsZ in 99 microlitri di tampone di blocco. Posizionare 50 microlitri dell'anticorpo primario diluito sul coperchio e incubarlo a temperatura ambiente per 30 minuti. Trasferire la coverlip in un pozzo del piatto di lavaggio.
Per iniziare il lavaggio, aggiungere un millilitro di PBS. Quindi trasferire il piatto di lavaggio su uno shaker e scuoterlo delicatamente per cinque minuti. Rimuovere il PBS e ripetere l'intero processo di lavaggio tre volte.
Successivamente, trasferire il coverslip al piatto di colorazione. Posizionare 50 microlitri dell'anticorpo secondario diluito sul coperchio e incubarlo al buio e a temperatura ambiente per 30 minuti. Trasferire il coperchio sul piatto di lavaggio.
Per iniziare il lavaggio, aggiungere un millilitro di PBS. Avvolgere la piastra di lavaggio in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce. Trasferire la piastra allo shaker e scuoterla delicatamente per cinque minuti.
Rimuovere il PBS e ripetere l'intero processo di lavaggio tre volte. Immediatamente prima dell'imaging STORM, preparare un millilitro di buffer di imaging come delineato nel protocollo di testo. Caricare la coverslip nella camera di carico.
Aggiungere il tampone di imaging appena preparato, essendo delicato per evitare di lavare via le cellule cianobatteriche. Successivamente, posizionare una coverlip rettangolare sopra il buffer di imaging per evitare che reagisca con l'ossigeno nell'aria. Accendere la fotocamera, la luce LED e il laser e aprire il software STORM.
Aggiungere mezza goccia di olio ad immersione sopra l'obiettivo. Caricare la camera, assicurandosi che l'obiettivo si biliti con il coverslip. Ed esaminate il segnale con un laser da 750 nanometri.
Identificare un'area campione contenente sia celle che marcatori fiduciari. Quindi avviare il software per la correzione della deriva del campione. Acquisire un'immagine wide-filed come riferimento, con il guadagno di moltiplicazione elettronica della fotocamera a 300 e un tempo di esposizione di 30 millisecondi.
Aumentare l'intensità del laser di eccitazione di 750 nanometri a circa 4,5 kilowatt per centimetro quadrato. Una volta che i fluorofori sono transizione in un modello lampeggiante sparso, acquisisci un'immagine a super risoluzione raccogliendo 10.000 fotogrammi a 33 hertz. Quindi ricostruire le immagini a super-risoluzione dai dati non elaborati come delineato nel protocollo di testo.
In questo studio, STORM viene utilizzato per ottenere immagini a super risoluzione attivando stocasticamente singoli fluorofori foto commutabili. La posizione di ogni fluoroforo viene registrata e un'immagine a super risoluzione viene quindi costruita in base a queste posizioni. Mentre gli spettri di assorbimento del Prochlorococcus raggiunge picchi a 447 e 680 nanometri e ha un assorbimento minimo superiore a 700 nanometri, le cellule Prochlorococcus MED4 emettono ancora un'alta autofluorescenza se esposte a un'intensità estremamente elevata del laser da 750 nanometri, che è necessario per l'imaging STORM.
Dopo aver usato il metodo di fotobleaching qui descritto per 30 minuti, si vede diminuire l'autofluorescenza delle cellule, anche se vengono ancora rilevate diverse cellule con autofluorescenza. Allungando il fotobleaching a 60 minuti, la maggior parte delle cellule perde l'autofluorescenza. Questi risultati indicano che il metodo di fotobleaching sviluppato è in grado di ridurre notevolmente l'autofluorescenza degli organismi fotosintetici.
Dopo il fotobleaching, STORM viene utilizzato per visualizzare la proteina della divisione cellulare, FtsZ, nelle cellule. Usando STORM, viene rivelata una morfologia dettagliata dell'anello FtsZ. Ruotando le immagini 3D STORM, sono stati identificati quattro diversi tipi di morfologie, ammassi, un anello incompleto, un anello completo e doppi anelli.
È importante ricordare che l'intensità della luce e la durata del fotobleach possono differire per diversi organismi. Dopo il suo sviluppo, questo metodo apre la strada ai ricercatori che vogliono studiare in dettaglio l'organizzazione delle proteine e la potenziale funzione nelle cellule fotosintetiche.
