Gli autori desiderano ringraziare il sostegno finanziario per questo lavoro fornita dalla US Army ERDC Genio Militare 6.1 Programma di Ricerca di Base e il Centro per la ERDC Diretto Research Program. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il personale e le strutture della ERDC Geotecnica e calcestruzzo e Materiali Filiale di strutturale Laboratorio per sostenere il lavoro sperimentale. Il permesso di pubblicare è stato concesso dal Direttore del Laboratorio, Geotecnica e Strutture.

1. Fish Scale Preparazione del campione Per questo studio, le scale sono stati ottenuti dal Centro Ricerca e Sviluppo (ERDC) Laboratorio Ambientale a metà lunghezza (29 esima colonna caudale) Ingegneri dell&#39;Esercito degli Stati Uniti da una gar lungo circa 600 mm (A. spatola). Le scaglie di pesce sono stati ottenuti secondo l&#39;Istituto ERDC e la Nazionale della Salute (NIH) le linee guida per la cura degli animali. <ol><li> Materiale Registrare la posizione spaziale sul pesce della bilancia ottenuti per lo studio. Assicurati di aderire all&#39;organizzazione appropriata o linee guida governative per ottenere campioni biologici come gli NIH linee guida per la cura degli animali. Conservare la bilancia in un mezzo adeguato come soluzione salina tamponata con fosfato per preservare l&#39;idratazione e mantenere contenuto minerale quando vengono rimossi dal pesce. Evitare lo stoccaggio prolungato che può provocare la perdita di minerali, che possono influenzare i dati nanoindentazione. Utilizzare un supporto di spazzola di setola e tweezers di rimuovere qualsiasi tessuto molle dalle scale principali. </li><li> Specimen di montaggio e di sezionamento Esaminando una sezione trasversale di asse corto della scala di pesci (Figura 1) con FTIR e nanoindentazione richiede in primo montaggio della scala in un mezzo rigido come un bicomponente costituito da una resina e l&#39;indurente. Impiego universale RT epossidici indurimento con basse temperature di picco come il commercio epossidica generico usato in questo studio che aveva una temperatura massima inferiore a 55 ° C. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1.jpg" /> Immagini Figura 1. X-ray CT di A. scala spatola raffigurante la sezione trasversale asse corto esaminati in questo studio di A. spatola utilizzando nanoindentazione e FTIR [A (anteriore), P (posteriore), D (dorsale), V (ventrale)]. &lt;/ P&gt; <ol start="2"><li><ol><li> Tenere la scala di pesci in uno stampo campione di 32 mm di diametro con un porta-campioni in plastica disponibile in commercio. Ciò mantiene il campione orientato correttamente durante il montaggio nella resina epossidica. </li><li> Una volta che il campione è nello stampo, versare la resina epossidica non catalizzata sul campione e quindi consentire la resina per curare secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Dopo la resina epossidica è guarito, sezione del campione montato usando una lama di diamante ad alta precisione troncatrice sulla linea mediana del campione. </li><li> Sottoporre ad ultrasuoni in acqua distillata per 15 minuti per rimuovere eventuali detriti dal campione. </li></ol></li><li> Lucidatura per Nanoindentazione e FTIR Per ottenere una superficie piana liscia per nanoindentazione come illustrato nella Figura 2, la seguente procedura di lucidatura e parametri sono basa sia sulle discussioni con la fabbricazione lucidatrice e campioni di prova. Tuttavia, i parametri possono essere necessario regolare per diversi biomateriali sulla base delle rispostecome i tassi di rimozione del materiale. Ultrasuoni di campioni in un bagno di acqua distillata tra i passaggi di lucidatura è fondamentale per garantire particelle da una grossa lucidatura passaggio non vengono introdotti in un più fine di lucidatura successiva fase. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2.jpg" /> Figura 2. Immagine di un lucido asse corto sezione trasversale A. scala spatola montato in resina epossidica. <ol start="4"><li><ol><li> Smalto Coarse con un pad 15 micron SiC e l&#39;acqua come lubrificante fino a quando il campione è aereo utilizzando la lucidatura forza automatica della testa, del 7 lbf e la velocità di 200 giri al minuto (rpm). </li><li> Sonicare il campione in un bagno di acqua distillata per 15 min. </li><li> Smalto intermedio con un pad 6 micron SiC con lubrificante acqua ad una velocità di copiatura di 130 giri al minuto e una forza di 7 lbf per5 min. </li><li> Sonicare campione in un bagno di acqua distillata per 15 min. </li><li> Lucidare con 1 micron SiC pad utilizzando lubrificante acqua ad una velocità di copiatura di 130 rpm ed una forza di 7 lbf per 5 min. </li><li> Sonicare il campione in un bagno di acqua distillata per 15 min. </li><li> Lucidatura finale con un nm sospensione di silice colloidale 50 con idoneo tampone di lucidatura come una alta densità, non tessuto, bassa pelo poliuretano poroso che un produttore suggerisce sospensioni per 50 nm. Smalto ad una velocità di 130 rpm con una forza di 7 lbf per 5 min. </li><li> Sonicare il campione in un bagno di acqua distillata per 15 min. </li></ol></li></ol> 2. Test Nanoindentazione <ol><li> Calibrare il sistema nanoindentazione prima di ogni partita di test per la produce linee guida. La calibrazione dovrebbe includere determinare la funzione zona del sistema per la punta Berkovich e rigidità del telaio. Inoltre, eseguire una calibrazione microscopio a penetratore in questa faseper garantire i trattini sono correlati alle posizioni microscopio scelti. </li><li> Caricare il campione nel Nanoindenter e usa i controlli microscopio ottico sul Nanoindenter per portare il campione a fuoco. </li><li> Utilizzare i controlli software per spostare il campione per la posizione del primo trattino. Idealmente, questo è di circa 10 micron di resina epossidica dal bordo dello strato ganoine lungo la linea centrale della sezione trasversale della bilancia. </li><li> Eseguire quattro file parallele di trattini distanziati 15 micron a parte per ottenere un dato statisticamente significativi impostati a partire da questa posizione. Impostare il Nanoindenter ad un carico massimo di 5 mn, carico e scarico dei tassi di 0,1 mN / sec, un tempo di attesa di 30 sec, e una distanza minima trattino 5 micron per ogni riga. La fila di trattini dovrebbe essere impostato per lanciare ortogonale alla superficie ganoine, e un numero sufficiente di trattini deve essere specificato per viaggiare in tutta sezione trasversale della bilancia durante l&#39;attraversamento di circa 10 micron in Epoxy passato lo strato osseo. </li><li> Quando il batch è completato, hanno il Nanoindenter creare rientri fiduciali con un carico massimo di 100 mN al primo e ultimo trattino, che dovrebbe essere nella resina epossidica prima che lo strato ganoine e dopo lo strato osso, rispettivamente. Questi sono correlati ai punti di inizio e fine per ogni riga di trattini. </li><li> Dopo nanoindentazione, posizionare il campione torna in soluzione PBS per evitare ulteriori disidratazione. </li><li> Utilizzare il software nanoindentazione per determinare il modulo e durezza basato sul metodo Oliver-Pharr 13 se desidera una risposta indipendente dal tempo si osserva. In caso contrario, la presa in tempo potrebbe dover essere estesa a superare lo scorrimento osservata da scarico troppo in fretta. </li></ol> 3. Risolta spazialmente ATR-FTIR Spettroscopia L&#39;uso di una diapositiva-on accessorio ATR attaccato ad un microscopio FTIR è un metodo suggerito per raccogliere risolta spazialmente trasformata di Fourier (FTIR) spettri dei layers in un campione della scala di pesci. L&#39;accessorio ATR consente raccolta di spettri di alta qualità con molto piccolo (~ 10 micron 2) risoluzione spaziale, che non è raggiungibile con qualsiasi altra tecnica FTIR. Lo stesso campione lucidato (Figura 2) preparato per esperimenti nanoindentazione è stato usato in questi esperimenti. <ol><li> Scegliere un campione con una superficie e dimensioni appropriate per il microscopio FTIR utilizzata per l&#39;analisi di spettri di garantire elevata qualità è ottenuta da ATR-FTIR spettromicroscopia. </li><li> Preparare il microscopio FTIR per raccogliere i dati. FTIR microspettroscopia richiede calibrazione del segnale FTIR alle stesse condizioni di campionamento come verrà utilizzato per misurare il campione. Tipicamente, questo include raffreddamento del rivelatore e lasciando il tempo che si stabilizzi e raccogliendo tutti sfondo spettri spettri campione e nelle stesse condizioni ambientali. Questo può essere particolarmente importante, perché CO 2 e vapore acqueo in aria può dincidere ramatically spettri FTIR. E &#39;anche importante assicurare che l&#39;ottica dello strumento sono allineati. </li><li> Raccogliere un adeguato spettro di fondo per sottrarre il campione contro. Per questi esperimenti, un lucido, oro rivestite con microscopio è stato utilizzato come sfondo per FTIR spettromicroscopia. </li><li> Utilizzando un obiettivo adeguato, concentrarsi sul campione e selezionare un&#39;area di interesse per l&#39;analisi. </li><li> Una volta che una zona di interesse viene trovato, collegare l&#39;accessorio ATR all&#39;obiettivo microscopio FTIR, sollevare il campione in modo rende intimo contatto con l&#39;elemento di riflessione interna ATR, e raccogliere un campione spettro. </li><li> Dopo aver raccolto gli spettri FTIR, eseguire la necessaria elaborazione di dati standard richiesti. </li></ol> 4. Raggi X Tomografia Computerizzata (TC) <ol><li> Ottenere e preparare scala come discusso nella sezione 1.1 </li><li> Impostazione scanner <ol><li> Warm-up la sorgente di raggi X in base alle specifiche del produttore. </li><li> Set X-ray tensione e la corrente a 50 kV e 160 μA, rispettivamente. </li><li> Impostare il tempo di esposizione a 1.450 msec. </li><li> Selezionare un filtro di 1,0 millimetri di alluminio. </li><li> Prima del caricamento del campione, effettuare una correzione flat-field quando la sorgente di raggi X è spento (in campo scuro) e (campo chiaro). </li></ol></li><li> Inserire e carico dei campioni Bilance devono essere montati in modo in modo che non si spostano o spostare tutta la lunghezza della scansione. Questi campioni possono anche essere montati con materiali che sono quasi trasparenti ai raggi X. Una combinazione di polistirolo e Parafilm può essere utilizzato per fissare la scala alla fase CT. <ol><li> Rigidamente montare il campione in modo che la dimensione più lunga è parallela al rivelatore. </li><li> Fissare il campione montato sul palco scanner. </li><li> Posizionare il campione in modo che sia al centro di rotazione durante la scansione. </li><li> Selezionare la risoluzione più alta che consente all&#39;intera scala sia nel campo di vista (FOV), in questo caso7.5 micron. </li></ol></li><li> Impostazioni di acquisizione Eseguire scansioni in questo studio con un passo di rotazione di 0,25 ° e un valore di media fotogrammi 15. Se risoluzioni inferiori sono accettabili, aumentare la dimensione del passo e / o diminuire il telaio media per ridurre il tempo di scansione totale. </li><li> Parametri di ricostruzione Una volta ottenuto un insieme di dati, ricostruire le immagini di proiezione a raggi X per creare un set di dati contenente immagini in sezione trasversale. Selezionare le impostazioni predefinite del software NRecon di SkyScan tranne per quanto segue. <ol><li> Cambiare la correzione Anello Artefatto a 20. </li><li> Cambiare la correzione del fascio Hardening al 25%. </li><li> Regolare il CS statico Rotazione per rendere livello di immagine della sezione trasversale. </li></ol></li><li> Image Processing Utilizzare il software di Skyscan CTAN per ottenere l&#39;immagine in scala di grigi 3D finale. Regolare l&#39;intervallo della scala di grigi ad un livello adeguato per rimuovere gli artefatti dal polistirolo e Parafilm. </li></ol> I campioni preparati da lucidatura per nanoindentazione e micro-/nano-structure caratterizzazione sono stati esaminati con microscopia elettronica a scansione (SEM). Modalità basso vuoto è stato utilizzato per minimizzare la disidratazione dei campioni e la necessità di applicazione di rivestimenti conduttivi. Analisi chimica locale è stata eseguita su campioni lucidati in combinazione con SEM immagini utilizzando la spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX). Analisi EDX sono state eseguite sulla stessa riga / griglia che è stato analizzato mediante nanoindentazione per fornire correlazioni tra proprietà chimiche e meccaniche. Superfici appena fratturate sono stati esaminati anche dal SEM per fornire una migliore informazione sulla morfologia e l&#39;orientamento delle strutture biomineralized presenti nelle squame di pesce. Per migliorare la risoluzione per l&#39;osservazione della struttura nano-scala su superfici fratturate, i campioni sono stati farfugliare rivestiti con oro (Au) e ripreso in modalità alto vuoto. Il seguentefornisce ulteriori dettagli sulle procedure utilizzate. <ol><li> SEM Imaging di superfici lucide <ol><li> Mettere campione lucido nella camera SEM e pompare camera in modalità basso vuoto con pressione della camera di 0,1-0,5 mbar. </li><li> Regolare la distanza di lavoro di circa 5,0 millimetri. </li><li> Attivare alta tensione (HV) e passare alla regione di interesse sul campione che comprende la zona di transizione tra ganoine e ossee sottolivelli o di altri settori di interesse. </li><li> Ottenere immagini a 15 HV kV e corrente del fascio di circa 3,9 nA. </li><li> Mettere a fuoco l&#39;immagine ed eseguire tutte allineamenti necessarie rettifiche stigmation. </li><li> Cattura immagini da almeno tre regioni di interesse a ingrandimenti rilevanti (tipicamente 250X a 10.000 X) utilizzando il basso vuoto elettroni retrodiffusi (BSE) rivelatore per aiutare nella identificazione dei cambiamenti nel contenuto biominerale e la densità (cioè, denso osso contro osso poroso ). </li></ol></li><li> SEM Imaging di Fractured superfici <ol><li> Fissare esemplare appena fratturate per un mozzicone di 90 ° SEM usando nastro biadesivo carbonio con superficie di frattura rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Polverizzazione catodica cappotto con Au per fornire uno strato conduttivo spessore sub-nm sulla superficie di frattura. </li><li> Mettere campione nella camera SEM e pompare camera in modalità ad alto vuoto. </li><li> Regolare la distanza di lavoro compreso tra 3.0 e 5.0 mm. </li><li> Attivare HV e passare alla regioni di interesse sul campione. Principali aree di interesse in questo caso sono stati la struttura presente negli strati ganoine e ossee. </li><li> Ottenere immagini tra il 5 kV e 15 kV HV e corrente del fascio inferiore di 0,24 nA per migliorare la risoluzione. </li><li> Inizialmente messa a fuoco del campione ed eseguire allineamenti preliminari. </li><li> Aumenta l&#39;ingrandimento a più di 5.000 X e passare da normale lente di emissione di campo in immersione / ultra-high (UHR) Lenti risoluzione. </li><li> Eseguire UHR allineamenti e rettifiche stigmation. </li><li> Cattura immagini da almeno tre regioni of interesse a ingrandimenti rilevanti (tipicamente 5.000 X 250.000 X) utilizzando il tramite rilevatore lente (TLD) operante a (SE) elettroni secondari. </li></ol></li><li> Analisi EDX di superfici lucide (eseguita in collaborazione con l&#39;imaging SEM). Questi parametri sono materiale dipendente e dovranno essere regolato in modo che il volume di interazione EDX è di dimensioni simili al volume interazione nanoindentazione come discusso da Moser 14. <ol><li> Passare alla regione di interesse sul campione lucido che include griglia nanoindentazione indicato da punti di riferimento alla fine di ogni riga di trattini. </li><li> Assicurarsi HV è almeno 15 kV, la corrente del fascio è di almeno 3,9 nA, e distanza di lavoro è superiore a 5,0 mm. </li><li> Cattura immagine BSE regione da analizzare utilizzando EDX. </li><li> Utilizzando il software di analisi EDX, ottenere la stessa immagine per aiutare a localizzare aree effettuare analisi chimica lungo la linea di trattini. </li><li> Utilizzando il &quot;Analisi Line&quot; tecnica, pozione di una linea per eseguire analisi chimiche lungo la linea di interesse dei trattini a partire dal primo trattino e termina all&#39;ultimo trattino. </li><li> Specificare il numero di punti di analisi da posizionare lungo la linea. È preferibile utilizzare lo stesso numero di punti di analisi e trattini che sono presenti per fornire una correlazione spaziale diretta tra composizione chimica e proprietà meccaniche. </li><li> Quando la linea viene posizionato e punti specificato correttamente, avviare l&#39;analisi linea utilizzando il software EDX. </li><li> Quando l&#39;analisi linea è completata, identificare gli elementi di interesse per essere quantificati dal punto di spettri ottenuti lungo la linea indicata sulla superficie lucida del campione. </li><li> Una volta che gli elementi di interesse siano identificati, effettuare una calibrazione sfondo per tenere conto di radiazioni Bremsstrahlung e altri effetti. </li><li> Scegliere l&#39;opzione analisi deconvoluzione del software per ottenere analisi quantitative su ogni punto lungo la linea indicata per quantificareficare la composizione chimica in ogni punto. </li><li> Salvare i risultati dell&#39;analisi chimica quantitativa con l&#39;immagine della linea specificato che è stata analizzata per aiutare nella correlazione spaziale con proprietà meccaniche misurate utilizzando nanoindentazione. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Allison, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+structure+of+the+biological+multilayered+material+system,+Atractosteus+spatula+scales.">Mechanical properties and structure of the biological multilayered material system, Atractosteus spatula scales.</a> Acta Biomater. 9, 5289-5296 (2013).</li><li>Bruet, B. J. F., Song, J., Boyce, M. C., Ortiz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+design+principles+of+ancient+fish+armour.">Materials design principles of ancient fish armour.</a> Nat. Mater. 7, 748-756 (2008).</li><li>Lin, Y. S., Wei, C. T., Olevsky, E. A., Meyers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+the+laminate+structure+of+Arapaima+gigas+scales.">Mechanical properties and the laminate structure of Arapaima gigas scales.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 4, 1145-1156 (2011).</li><li>Marino Cugno Garrano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanical+behavior+of+scales+from+Cyprinus+carpio.">On the mechanical behavior of scales from Cyprinus carpio.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 7, 17-29 (2012).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microstructural+studies+of+the+armor+of+the+marine+threespine+stickleback+(Gasterosteus+aculeatus).">Quantitative microstructural studies of the armor of the marine threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus).</a> J. Struct. Biol. 171, 318-331 (2010).</li><li>Wang, L., Song, J., Ortiz, C., Boyce, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+design+of+a+multilayered+biological+exoskeleton.">Anisotropic design of a multilayered biological exoskeleton.</a> J. Mater. Res. 24, 3477-3494 (2009).</li><li>Ikoma, T., Kobayashi, H., Tanaka, J., Walsh, D., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure,+mechanical,+and+biomimeetic+properties+of+fish+scales+from+Pagrus+major.">Microstructure, mechanical, and biomimeetic properties of fish scales from Pagrus major.</a> 142, 327-333 (2003).</li><li>O'Connell, M. T., Shepherd, T. D., O'Connell, A. M. U., Myers, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+declines+in+two+apex+predators,+bull+sharks+(Carcharhinus+leucas)+and+alligator+gar+(Atractosteus+spatula),+in+Lake+Pontchartrain,+an+Oligohaline+estuary+in+southeastern+Louisiana.">Long-term declines in two apex predators, bull sharks (Carcharhinus leucas) and alligator gar (Atractosteus spatula), in Lake Pontchartrain, an Oligohaline estuary in southeastern Louisiana.</a> Estuar. Coast. 30, 567-574 (2007).</li><li>Long Jr, J. H., Hale, M. E., McHenry, M. J., Westneat, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+fish+skin:+flexural+stiffness+and+steady+swimming+of+longnose+gar+Lepisosteus+osseus.">Functions of fish skin: flexural stiffness and steady swimming of longnose gar Lepisosteus osseus.</a> J. Exp. Biol. 199, 2139-2151 (1996).</li><li>Page, L. M., Burr, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A field guide to freshwater fishes. The Peterson field guide series. , (1991).</li><li>Thompson, K. S., McCune, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+scales+in+Lepisosteus+as+a+model+for+scale+formation+in+fossil+fishes.">Development of the scales in Lepisosteus as a model for scale formation in fossil fishes.</a> J. Linn. Soc. Longdon, Zool. 82, 73-86 (1984).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+fracture+resistance+of+alligator+gar+(Atractosteus+spatula)+armored+fish+scales.">Structure and fracture resistance of alligator gar (Atractosteus spatula) armored fish scales.</a> Acta. Biomater. 9, 5876-5889 (2013).</li><li>Moser, R. D., Allison, P. G., Chandler, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Impact+Damage+in+Ultra-High+Performance+Concrete+Using+Spatially+Correlated+Nanoindentation/SEM/EDX.">Characterization of Impact Damage in Ultra-High Performance Concrete Using Spatially Correlated Nanoindentation/SEM/EDX.</a> J. Mater. Eng. Perf. 22, 1-7 (2013).</li><li>Oliver, W. C., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+technique+for+determining+hardness+and+elastic+modulus+using+load+and+displacement+sensing+indentation+experiments.">An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments.</a> J Mater Res. 7, 1564-1583 (1992).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent Technologies Nano Indenter G200 User's Guide. , (2012).</li><li>Ulm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+indentation+techniques+for+hydrated+nanocomposites:+concrete,+bone,+and+shale.">Statistical indentation techniques for hydrated nanocomposites: concrete, bone, and shale.</a> J. Amer. Cer. Soc. 90, 2677-2692 (2007).</li><li>Randall, N. X., Vandamme, M., Ulm, F. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+analysis+as+a+two-dimensional+tool+for+mapping+the+mechanical+properties+of+complex+surfaces.">Nanoindentation analysis as a two-dimensional tool for mapping the mechanical properties of complex surfaces.</a> J. Mater. Res. 24, 679-690 (2009).</li><li>Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+of+Biological+and+Biomimetic+Materials.">Nanoindentation of Biological and Biomimetic Materials.</a> Exper. Tech. 37, 73-87 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Da un punto di vista sperimentale, i ricercatori devono ricordare che quando si lavora con materiali naturali biologici come squame di pesce mineralizzate, riportando la posizione spaziale della scala sul pesce è fondamentale poiché la ricerca preliminare ha dimostrato proprietà meccaniche di scaglie di pesce mineralizzate sono dipendenti dove le scale erano situati sul pesce 4. Proprietà meccaniche dei materiali biologici mineralizzati ha anche dimostrato di essere dipendente dallo stato di idratazione dei campioni 4. Questo limita l&#39;utilità di questa tecnica quando si cerca di confrontare campioni freschi che sono stati adeguatamente idratato ai risultati pubblicati in letteratura, che utilizzano i campioni fossilizzati secco. Pertanto, i tempi di prova prolungati devono essere evitati per minimizzare gli effetti della disidratazione sulle proprietà meccaniche di un campione durante nanoindentazione. Materiale studi pilota specifici sono raccomandati per garantire l&#39;esperienzaruntime mento è sufficiente minimale per non modificare il comportamento meccanico del materiale. Nanoindentazione cellulare bagnato sarebbe un metodo preferito per mantenere uno stato di idratazione costante del materiale, se l&#39;apparecchiatura di prova lo consente. Il metodo nanoindentazione utilizzato in questo studio, che ha calcolato il modulo di elasticità della curva di scarico assume il materiale si comporta come un materiale isotropo elastico lineare. La tecnica può essere utilizzato con una varietà di punte penetratore. Tuttavia, la punta Berkovich tre lati con un semiangolo di 65.35 ° stato utilizzato in questo studio. Ha alternative come l&#39;angolo del cubo (mezzo angolo = 35.36 °) sono adatti per il procedimento presentata in questo manoscritto, ma dal momento che la punta angolo del cubo è più acuto che le crepe punta Berkovich possono essere generati nel campione al più carichi inferiori rispetto a la punta Berkovich. La lucidatura è un passo essenziale per ottenere una superficie liscia e piatta con un tensioattivo minimizzatae rugosità per non influenzare i risultati nanoindentazione. Le fasi di lucidatura presentati in questo manoscritto sono un procedimento suggerito che potrebbe essere necessario modificare a seconda del tipo di lucidatrice utilizzato. Tuttavia, il passaggio fondamentale per garantire che i dati nanoindentazione precisa è che la rugosità superficiale è ridotta al minimo, e per questo particolare materiale a 50 nm tocco finale è stato richiesto di ottenere una superficie piana e liscia in profondità di rientro essere rilevati. La spaziatura dei trattini assicura anche dati nanoindentazione accurato che non sia influenzata dalla deformazione materiale che si verificano da trattini precedenti. Il manuale utente Nanoindenter per le apparecchiature in questo studio ha suggerito che spaziatura del rientro dovrebbe essere almeno di 20-30x la massima profondità di penetrazione per Berkovich penetratori 15. Per materiali alternativi, lo spazio di indentazione richiesta dovrà essere determinato sulla base del carico applicato e la profondità massima indentazione come discusso precedentemente all&#39;apertoletteratura 16,17. Inoltre, il tempo di attesa per questo materiale è stato scelto per superare qualsiasi scorrimento osservato per le diverse fasi materiali sondato consentendo Oliver-Pharr metodo di analisi del software Nanoindenter da utilizzare. Tuttavia, come discusso da Oyen 18 metodi di analisi alternativi sono disponibili per i materiali biologici quando le risposte di materiale tempo-dipendenti non possono essere superati con tempi di attesa adeguati. Per ottenere risultati ad alta risoluzione da X-Ray CT, diverse impostazioni devono essere ottimizzate. Questo documento descrive un insieme molto specifico di parametri per l&#39;utilizzo su una scala di pesce con una taglia unica e spessore stratificato. Con varie dimensioni del campione, dovranno essere regolati per ottenere un set di dati di alta qualità queste impostazioni. Il processo di selezione di ciascun parametro deve essere chiaramente definita nel manuale utente fornito con la macchina in uso. Impostazioni di scansione (tensione, corrente, l&#39;esposizione, selezione del filtro) e le impostazioni di ricostruzione(artefatti anello, raggio indurimento) possono avere bisogno di essere modificati per ospitare una varietà di altre dimensioni del campione e geometrie. X-ray CT fornita un&#39;immagine della morfologia intera scala individuare uno strato ganoine copre uno strato ossea del materiale solo se le scale non si sovrappongono. La CT immagini a raggi X identificato anche che lo strato ganoine consisteva di spessore non uniforme su tutta la scala, e fosse anche esposti che mancavano strato ganoine tutto. È interessante notare che i dati nanoindentazione spazialmente correlati all&#39;analisi chimica SEM / EDX identificarono una transizione discreta netta tra i 2 strati invece di una transizione più graduale osservata per le scaglie di pesce mineralizzate del P. senagalus (in Bruet et al. 2). Una combinazione di nanoindentazione, FTIR, EDX e SEM ottenute proprietà meccaniche, analisi chimica e le informazioni strutturali per confermarelo strato esterno come ganoine con smalto-come morfologia e la chimica. Inoltre, queste tecniche hanno confermato lo strato interno come strato di materiale osseo. In conclusione, i metodi descritti in questo studio hanno identificato la procedura ed i risultati corrispondenti ad esaminare la scala di pesci mineralizzato di A. spatola dalla struttura bulk fino alla nanostruttura e composizione chimica.

I ricercatori stanno studiando biomateriali strutturali e stanno cercando di chiarire i principi di progettazione, che forniscono biomateriali strutturali con migliori proprietà meccaniche come molto più elevata tenacità e resistenza rispetto ai loro singoli costituenti. Le indagini sui principi di progettazione di scaglie di pesce blindati per Pagrus principale 7, Polypterus senagalus 2,6, Arapaima gigas 3, Cyprinus carpio 4, e Atractosteus spatola 1 hanno dimostrato la necessità di ampliare l&#39;applicazione di metodi sperimentali esistenti per studiare le risposte strutturali e caratteristiche microstrutturali, poiché procedure dettagliate standard non sono disponibili per questi tipi di materiali ed esperimenti. Tra le diverse scale di pesci corazzati discussi, A. spatola è un predatore storicamente apice della centrale US 8 ed è una specie con elevatoscale mineralizzate ly. Gli scambi specie massa muscolare per la massa della pelle per ottenere un migliore sistema predatore di difesa rispetto al pesce di dimensioni comparabili menzionato in precedenza 9. Secondo la pagina e Burr 10, A. spatola è il terzo più grande pesce d&#39;acqua dolce in Nord America con lo storione bianco (Acipenser transmontanus) e lo storione atlantico (Acipenser oxyrhynchus) essendo specie più grandi. Le scaglie di pesce altamente mineralizzate di A. spatola solo recentemente sono stati studiati. Thompson e McCune 11 suggerito che la morfologia delle scale gar hanno una composizione a tre strati costituito da uno strato ganoine esterno, uno strato osso diffusa, e strato di osso lamellare. La ricerca attuale sulla A. scale spatola non hanno distinto il livello di osso in diffusa o regioni osso lamellare, ma ha appena studiato la regione osso come un unico strato interno 1,12. In questo studio, le procedure per avestigating la microstruttura, nanostruttura, composizione chimica, e la distribuzione spaziale delle proprietà meccaniche delle scale di A. spatola sulla base dei risultati della spettroscopia FTIR, SEM, raggi X CT, e le tecniche di nanoindentazione sono presentati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epoxy resin</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">701-501512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epoxy hardener</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">703-501528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Samplkups</td>
			<td style="width:71px;">Buheler</td>
			<td style="width:119px;">20-8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SamplKlips I</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">20-4100-100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High precision cut-off saw</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">Isomet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraMet 2002 sonic cleaner</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">B2510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polisher</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">49-1750-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1200 grit (15-um) SiC paper</td>
			<td style="width:71px;">Struers</td>
			<td align="right" style="width:119px;">40400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4000 grit (6-um) SiC paper</td>
			<td style="width:71px;">Struers</td>
			<td align="right" style="width:119px;">40400014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50-nm colloidal silica</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">40-10075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chemomet polishing pad for 50-nm suspension</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">40-7918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanoindenter</td>
			<td style="width:71px;">MTS</td>
			<td style="width:119px;">G200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FTIR continuum microscope</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Nicollet</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-ray Computed Tomography</td>
			<td style="width:71px;">Skyscan</td>
			<td style="width:119px;">Skyscan 1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SEM</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">NovaNanoSEM 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EDX</td>
			<td style="width:71px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">AXS Xflash detector 4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sputter Coater</td>
			<td style="width:71px;">Denton</td>
			<td style="width:119px;">Desk II</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of multi-layered fish scales (atractosteus spatula) using nanoindentation, x-ray ct, ftir, and sem

L&#39;architettura gerarchica dei materiali biologici protettivi come bilance mineralizzate di pesce, gusci di gasteropodi, corno di montone, palchi, e gusci di tartaruga fornisce i principi di progettazione unici con potenzialità per guidare la progettazione di materiali e sistemi di protezione in futuro. Comprendere le relazioni struttura-proprietà di questi sistemi materiali alla microscala e nanoscala, dove inizia il fallimento è essenziale. Attualmente, le tecniche sperimentali come nanoindentazione, X-ray CT e SEM forniscono ai ricercatori un modo per correlare il comportamento meccanico di microstrutture gerarchici di questi sistemi materiali 1-6. Tuttavia, una procedura standard ben definito per la preparazione dei campioni di biomateriali mineralizzati non è attualmente disponibile. In questo studio, i metodi per sondare le proprietà meccaniche della scala multistrato di A. chimica spazialmente correlata, strutturale, e spatola con nanoindentazione, FTIR, SEM, con bagnoenergia dispersiva a raggi X (EDX) microanalisi, e X-ray CT sono presentati.

La Figura 3 mostra i risultati medi del spazialmente correlati nanoinidentation / SEM / EDX analisi condotta attraverso l&#39;asse longitudinale sezione trasversale di circa 800 micron breve. Nello strato ganoine circa 60 micron di spessore, il Nanoindenter calcolato un modulo media di 69,0 GPa e la durezza di 3.3 GPa. Il Nanoindenter determinato un modulo media di 14,3 GPa e la durezza di 0.5 GPa per lo strato di osso di circa 740 micron di spessore. EDX determinato carbonio, ossigeno, calcio e fosforo, che si trova in genere in scala mineralizzati. Tuttavia, gli strati ganoine e delle ossa contenute le differenze quantificabili in composizioni chimiche. Il picco di carbonio osservata nello strato ossea può essere attribuita a quella regione non essendo altamente mineralizzata, che si traduce in un leggero aumento del carbonio che ha causato anche la diminuzione osservata in luminosità globale dell&#39;immagine BSE. In particolare, lo strato ganoine &#39;; S significa rapporto di concentrazione atomico di Ca: P di 1.71 apparve simile a idrossiapatite con un rapporto teorico di 1.67. Ca media del livello osseo: rapporto P sceso a 1,51 con una diminuzione nella quantità di mineralizzazione dallo strato ganoine. FTIR spettri in Figura 4 per lo strato osso e strato ganoine identificato i principali gruppi funzionali come ammide, carbossilico, fosfato, e carbonile. In particolare, FTIR confermato l&#39;osservazione visiva delle firme idrossiapatite nei esterno (ganoine) strato di collagene e firme nel strato interno (osso). Picchi a 3,500-3,000 cm -1 a causa di NH stretching e NH flessione tra il 1550 e il 1500 centimetri -1 rappresentano gruppi ammidici nel livello dell&#39;osso. Picchi nella regione di numero d&#39;onda 1,470-1,365 cm -1 rappresentano ammidici sostituito gruppi alchilici. Inoltre, un gruppo C = O distintivo estende al 1641 centimetri -1 stata osservata sullo strato osso. Piselloks da 3,000-2,500 cm -1 rappresentano gruppi carbossilici. Spettri Sia l&#39;osso e ganoine strati &#39;prodotto un picco caratteristico vicino 1,079.33 cm -1 indicativi di stretching fosfato. X-ray CT immagini in Figura 5 cattura che lo strato ganoine non copre lo strato di osso in cui le scaglie si sovrappongono. Le luminose strati ganoine grigi indicano le fasi più dense, più dure, e più rigide mentre scuri strati di osso in grigio indicano le fasi meno dense e meno rigidi. Inoltre, il CT immagini a raggi X aiutato nell&#39;identificare la non uniformità di spessore dello strato ganoine. Infatti, pozzi chiari sono osservate vicino al centro del livello ganoine, che non coprono lo strato osso affatto. L&#39;immagine SEM di Figura 6A della superficie di frattura inciso con H 3 PO 4 rivelato nanostrutture organizzate in un modello a strati per lo strato ganoine. Questo nanorod-organizzatastruttura correlata agli firme idrossiapatite ottenuti dal FTIR per l&#39;area ganoine. Figura 6A illustra una tipica ingrandimento minore Micrografia SEM di una superficie di frattura e specificano il passaggio tra gli strati ganoine e ossee con la linea tratteggiata. Figura 6B ritrae l&#39;ingrandimento immagini superiori SEM della superficie di frattura dopo incisione ad H 3 PO 4. Dopo incisione, nanotubi orientati nello strato esterno ganoine sono chiaramente identificabili mentre una nanostruttura come fibra si osserva nello strato osso. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3.jpg" /> Figura 3. Modulus e dati durezza da nanoindentazione spazialmente correlati al SEM / EDX composizione chimica. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4.jpg" /> Figura 4. FTIR spettri raccolti dagli strati più esterni (ganoine) e interno (ossea). <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5.jpg" /> Figura 5. Raggi X immagini TC mostrano puntinatura sulla superficie esterna (ganoine) strato che copre l&#39;interno (ossea) strato. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6.jpg" /> Figura 6. (A) a basso ingrandimento Immagine SEM della superficie di frattura tipica, (B) immagini ingrandimento maggiore di nanotubi in esterno (ganoine) e fibre nel interno (bony) Strati .. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

Questo documento presenta i metodi utilizzati per sondare le proprietà meccaniche della scala multistrato di Atractosteus spatola (A. spatola) utilizzando nanoindentazione chimica spazialmente correlata, strutturale, e, trasformata di Fourier a raggi infrarossi (FTIR) spettroscopia, microscopia elettronica a scansione (SEM), e X- tomografia computerizzata a raggi (X-ray CT). I risultati sperimentali sono stati utilizzati per studiare i principi di progettazione di materiali biologici protettivi.

Caratterizzazione di Fish Scales Sovrapposizione (<em&gt; Atractosteus spatola</em&gt;) Usando Nanoindentazione, X-ray CT, FTIR e SEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

characterization-multi-layered-fish-scales-atractosteus-spatula-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

15.1K Views.  U.S. Army Engineer Research and Development Center.  Questo documento presenta i metodi utilizzati per sondare le proprietà meccaniche della scala multistrato di Atractosteus spatola (A. spatola) utilizzando nanoindentazione chimica spazialmente correlata, strutturale, e, trasformata di Fourier a raggi infrarossi (FTIR) spettroscopia, microscopia elettronica a scansione (SEM), e X- tomografia computerizzata a raggi (X-ray CT). I risultati sperimentali sono stati utilizzati per studiare i principi di progettazione...

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Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

Imaging bioluminescenza per la valutazione delle risposte immunitarie A seguito di impianto di tessuto cardiaco Composti (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Ricerca

Bioingegneria

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique where X-rays are elastically scattered by an inhomogeneous sample in the nm-range at small angles (typically 0.1 - 5&deg;) and wide angles (typically &gt; 5&deg;). This technique provides information about the shape, size, and distribution of macromolecules, characteristic distances of partially ordered materials, pore sizes, and surface-to-volume ratio. Small Angle X-ray Scattering (SAXS) is capable of delivering structural information of macromolecules between 1 and 200 nm, whereas Wide Angle X-ray Scattering (WAXS) can resolve even smaller Bragg spacing of samples between 0.33 nm and 0.49 nm based on the specific system setup and detector. The spacing is determined from Bragg's law and is dependent on the wavelength and incident angle.
In a SWAXS experiment, the materials can be solid or liquid and may contain solid, liquid or gaseous domains (so-called particles) of the same or another material in any combination. SWAXS applications are very broad and include colloids of all types: metals, composites, cement, oil, polymers, plastics, proteins, foods, and pharmaceuticals. For solid samples, the thickness is limited to approximately 5 mm.
Usage of a lab-based SWAXS instrument is detailed in this paper. With the available software (e.g., GNOM-ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg and EasySWAXS software) for the SWAXS system, an experiment can be conducted to determine certain parameters of interest for the given sample. One example of a biological macromolecule experiment is the analysis of 2 wt% lysozyme in a water-based aqueous buffer which can be chosen and prepared through numerous methods. The preparation of the sample follows the guidelines below in the Preparation of the Sample section. Through SWAXS experimentation, important structural parameters of lysozyme, e.g. the radius of gyration, can be analyzed.

The demonstration of the small and wide angle X-ray scattering (SWAXS) procedure has become instrumental in the study of biological macromolecules. Through the use of the instrumentation and procedures of specific angle methods and preparation, the experimental data from the SWAXS displays the atomic and nano-scale characterization of macromolecules.

Piccole e Wide Angle X-Ray Scattering Studi di macromolecole biologiche in soluzione

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should mimic the human tissues they are aiming to replace; to provide the required anatomical shape, the materials must be able to sustain the mechanical forces they will experience when implanted at the defect site. Although the mechanical properties of tissue-engineered scaffolds are of great importance, many human tissues that undergo restoration with engineered materials have not been fully biomechanically characterized. Several compressive and tensile protocols are reported for evaluating materials, but with large variability it is difficult to compare results between studies. Further complicating the studies is the often destructive nature of mechanical testing. Whilst an understanding of tissue failure is important, it is also important to have knowledge of the elastic and viscoelastic properties under more physiological loading conditions.
This report aims to provide a minimally destructive protocol to evaluate the compressive and tensile properties of human soft tissues. As examples of this technique, the tensile testing of skin and the compressive testing of cartilage are described. These protocols can also be directly applied to synthetic materials to ensure that the mechanical properties are similar to the native tissue. Protocols to assess the mechanical properties of human native tissue will allow a benchmark by which to create suitable tissue-engineered substitutes.

Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.

Caratterizzazione biomeccanica di morbidi tessuti umani usando una indentazione e prove di trazione

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate structures&#160;while processing and histological observation provide limited information through cross-sectional imaging. Micro X-ray computed tomography (microCT) is an effective tool for obtaining three-dimensional information without damaging specimens. However, it shows limited efficiency in differentiating soft tissue parts. Use of contrast-enhancing agents, like phosphotungstic acid (PTA), can solve this problem by improving soft tissue contrast. We implemented microCT with PTA to investigate the human orbicularis retaining ligament (ORL), which is a delicate structure in the orbit area. In this method, harvested specimens are fixed in formalin, dehydrated in serial ethanol solutions, and stained with a PTA solution. After staining, microCT scanning, 3D reconstruction, and analysis are performed. Skin, ligaments, and muscles can be clearly visualized using this method. The specimen size and duration of staining are essential features of the method. The suitable specimen thickness was about 5&#8211;7 mm, above which the process was slowed, and the optimum duration was 5&#8211;7 days, below which an empty hole in the central area occasionally occurred. To maintain the location and direction of small pieces during cutting, sewing on the same region of each part is recommended. Furthermore, preliminary analyses of the anatomical structure are needed to correctly identify each piece. Parafilm can be used to prevent drying, but care should be taken to prevent specimen distortion. Our multidirectional observation showed that the ORL is composed of a multilayered meshwork of continuous plates, rather than thread-like fibers, as reported previously. These results suggest that microCT scanning with PTA is useful for examining specific compartments within complex structures of human tissue. It may be helpful in the analyses of cancer tissues, nerve tissues, and various organs, like the heart and liver.

Micro X-ray computed tomography is effective in obtaining three-dimensional information from undamaged human specimens but has limited success in observing soft tissues. The use of phosphotungstic acid contrast agent can resolve this issue. We implemented this contrast agent to examine human delicate fibromuscular tissues (the orbicularis retaining ligament).

Uso della micrografia computerizzata a raggi X con preparazione dell'acido fosfongstico per visualizzare il tessuto fibromuscolare umano

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Analisi CT quadridimensionale mediante registrazione sequenziale 3D-3D

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

3D Imaging of Soft-Tissue Samples using an X-ray Specific Staining Method and Nanoscopic Computed Tomography

We demonstrate a laboratory-based method combining X-ray microCT and nanoCT with a specific X-ray stain, which targets the cell cytoplasm. The described protocol is easy to apply, fast and suitable for larger soft-tissue samples. The presented methodology enables the characterization of crucial tissue structures in three dimensions and is demonstrated on a whole mouse kidney. The multiscale approach allows to image the entire mouse kidney and supports the selection of further volumes of interest, which are acquired with higher resolutions ranging into the nanometer range. Thereby, soft-tissue morphology with a similar detail level as the corresponding histological light microscopy images is reproduced. Deeper insights into the 3D configuration of tissue structures are achieved without impeding further investigations through histological methods.

A protocol for 3D visualization of microscopic tissue structures by using an X-ray specific staining method designed for X-ray computed tomography is presented.

Immagini 3D di campioni di tessuti molli utilizzando un metodo di colorazione specifico a raggi X e tomografia computerizzata nanoscopica

We demonstrate a laboratory-based method combining X-ray microCT and nanoCT with a specific X-ray stain, which targets the cell cytoplasm. The described ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Fabbricazione fantasma di alcol polivinile specifico per il paziente con ultrasuoni e contrasto a raggi X per la pianificazione della chirurgia del tumore al cervello

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

Flusso di lavoro sperimentale e di analisi dei dati per la nanoindentazione della materia soffice

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Viscoelastic Characterization of Soft Tissue-Mimicking Gelatin Phantoms using Indentation and Magnetic Resonance Elastography

Characterization of biomechanical properties of soft biological tissues is important to understand the tissue mechanics and explore the biomechanics-related mechanisms of disease, injury, and development. The mechanical testing method is the most straightforward way for tissue characterization and is considered as verification for in vivo measurement. Among the many ex vivo mechanical testing techniques, the indentation test provides a reliable way, especially for samples that are small, hard to fix, and viscoelastic such as brain tissue. Magnetic resonance elastography (MRE) is a clinically used method to measure the biomechanical properties of soft tissues. Based on shear wave propagation in soft tissues recorded using MRE, viscoelastic properties of soft tissues can be estimated in vivo based on wave equation. Here, the viscoelastic properties of gelatin phantoms with two different concentrations were measured by MRE and indentation. The protocols of phantom fabrication, testing, and modulus estimation have been presented.

This article presents a demonstration and summary of protocols of making gelatin phantoms that mimic soft tissues, and the corresponding viscoelastic characterization using indentation and magnetic resonance elastography.