La microTC non è stata ampiamente applicata agli invertebrati marini a causa della loro diversità morfologica. Il nostro metodo consente un facile montaggio di campioni a qualsiasi angolazione adatta alla sua morfologia. Può essere eseguito con materiali comuni, come acqua, argilla e tubi e, se applicabile, a campioni con una varietà di forme, da un verme lungo a una palla rotonda.
A dimostrare la procedura sarà Akiteru Maeno, tecnico del National Institute of Genetics, Giappone. Per iniziare, preparare lo 0,5% di agarosio sciogliendo 500 milligrammi di agarosio in 100 millilitri di acqua distillata in un pallone conico da 250 millilitri e posizionare il pallone in un forno a microonde alla potenza di 800 watt per riscaldare circa uno o tre minuti. Raffreddare il pallone a temperatura ambiente.
Per montare campioni di grandi dimensioni che non si adattano a una punta blu micropipetta da 1000 microlitri, come A.equina, posizionare prima il campione macchiato in un piatto da 60 millimetri con acqua distillata per lavare via l'eccessiva soluzione di colorazione dalla superficie. In un tubo da 50 millilitri versare delicatamente cinque millilitri dello 0,5% di agarosio senza fare bolle. Posizionare il tubo sul ghiaccio per indurire l'agarosio.
Quindi aggiungere 20 millilitri dello 0,5% di agarosio al tubo, posizionare sul ghiaccio fino a quando l'agarosio inizia a indurirsi e utilizzare le forcette per posizionare il campione all'interno dell'agarosio. Regolare la posizione del campione in modo che il suo asse del corpo sia verticale. Indurire l'agarosio sul ghiaccio.
Posizionare l'argilla sullo stadio di montaggio del microCT e impostare il tubo da 50 millilitri sull'argilla. Per montare piccoli campioni che si adattano a una punta blu micropipetta da 1000 microlitri, come Harmothoe sp. e X.japonica, decantare il campione macchiato in un piatto da 60 millimetri senza utilizzare le forcep.
Con le pinzette ad anello, trasferire delicatamente i campioni in un altro piatto da 60 millimetri riempito con acqua distillata per lavare via l'eccessiva soluzione di colorazione dalla superficie. Successivamente, redigere 100 microlitri dello 0,5% di agarosio in una punta blu micropipetta da 1000 microlitri e posizionarlo sul ghiaccio per indurirlo. Quando si maneggia Harmothoe sp.
aggiungere 1000 microlitri dello 0,5% di agarosio nella spina di agarosio nella punta. Utilizzare le pinzette ad anello per trasferire delicatamente Harmothoe sp.
Con un ago petiolato o una pinzetta di precisione, regolare la posizione e l'orientamento dell'Harmothoe sp. Assicurarsi che non siano presenti bolle, quindi posizionare la punta sul ghiaccio per indurire l'agarosio.
Quando si maneggiano campioni fragili come X.japonica, utilizzare una micropipetta per aggiungere 1000 microlitri di acqua distillata nella punta blu con il tappo di agarosio indurito. Posizionare la X.Japonica nell'acqua distillata in modo che sia stabile tra le pareti della punta. Per campioni più piccoli, è possibile utilizzare una punta gialla micropipetta da 200 microliter.
In questo caso, utilizzare 30 microlitri di agarosio per la spina e aggiungere 200 microlitri di agarosio o acqua distillata. Quindi, tagliare la punta da una nuova punta blu micropipetta da 1000 microliter e inserire la punta della punta collegata nella nuova punta. Posizionare l'argilla sullo stadio di montaggio del microCT e impostare le punte con il campione all'interno sull'argilla.
Subito dopo aver montato i campioni, accendere il fascio di raggi X a 80 kilovolt e 100 microampe. Osservando l'immagine di trasmissione a raggi X, spostare lo stadio in modo che l'intero campione possa essere visto facendo clic sui pulsanti dell'asse x e z e regolando manualmente la manopola dell'asse y sullo stadio di montaggio. Regolare le condizioni di contrasto dell'immagine in modo da poter osservare le strutture interne.
Regolare l'orientamento del campione modificando l'angolo del tubo nell'argilla. Ruotare il palco di 90 gradi impostando l'asse di rotazione su 90 e facendo clic sul pulsante Movimento relativo. Eseguire la stessa manovra quattro volte per completare una rotazione completa.
Spegnere manualmente il fascio di raggi X ogni volta che la porta del campione viene aperta, a meno che il sistema non la s spenta automaticamente. Ora fare clic sul pulsante dell'asse Z e regolare manualmente la manopola dell'asse y per spostare la fase di montaggio in modo che il campione si trova al centro della vista. Ruotare il palco di 90 gradi e regolare nuovamente il campione al centro.
Ruotare lo stage di 90 gradi altre tre volte e regolare in base alle esigenze per assicurarsi che il campione si trova al centro della vista da tutte le direzioni. Quindi, fare clic sul pulsante dell'asse X per spostare lo stadio lungo l'asse X verso la sorgente del fascio di raggi X per ingrandire il campione e regolare in base alle esigenze in modo che si adatti solo alla vista. Ruotare il palco e regolare in base alle esigenze per assicurarsi che il campione rientri nella vista da tutte le direzioni.
Regolare le condizioni di scansione e quindi iniziare la scansione. In questo esperimento, l'imaging microCT è stato eseguito su Actinia equina, Harmothoe sp.
La colorazione ha migliorato con successo il contrasto delle strutture interne in tutti i campioni, consentendo osservazioni di tessuti molli interni. Questo metodo è applicabile a campioni fragili anche con danni esterni, come si può vedere dall'esemplare X.japonica con epidermide gravemente danneggiata. Un singolo set di dati ad alta risoluzione di un intero campione è stato ricostruito per Harmothoe sp.
e X.japonica da scansioni multiple eseguite su parti diverse ma sovrapposte del campione. Assicurarsi di impostare il campione nel tubo o nella punta e montare il tubo o la punta nel microCT in modo che non si muova durante la scansione. I dati ottenuti da questa procedura possono essere utilizzati per ricostruzioni di immagini 3D, consentendo al ricercatore di comprendere appieno la morfologia interna ed esterna del campione.
Tutti i sistemi microCT utilizzano raggi X, ma le specifiche possono essere diverse da un sistema all'altro, quindi assicurati di seguire da vicino le istruzioni di ogni sistema.
