Abbiamo presentato il primo modello di coltura cellulare per l'infezione da Poliomavirus cellulare di Merkel. Il protocollo include l'isolamento dei fibroblasti dermici, la preparazione dell'infezione da virus MCPyV, la colorazione immunofluorescente e l'ibridazione fluorescente in situ. Questo protocollo consente di studiare il ciclo infettivo MCPyV e le interazioni con le cellule ospiti evitando artefatti associati all'espressione troppo dei geni virali.
Per iniziare, usa un paio di forbici per tagliare il grasso e il tessuto sottocutaneo dal prepuzio neonatale umano. Tagliare il campione della pelle a metà o in quarti. Posizionare il tessuto in 5 millilitri da 10 milligrammi per millilitro dis-based II NPBS, integrato con antibiotico-antimicotico.
Incubare a 4 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare le forcep di microdisezione per separare accuratamente l'epidermide dagli strati dermici in un piatto di 10 centimetri. Trasferire il tessuto dermico risultante in un tubo conico da 15 millilitri contenente 5 millilitri da 2 milligrammi per millilitro collagenasi di tipo IV in mezzo privo di FBS integrato con antibiotico-anitmicotico.
Incubare il campione a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% con scuotimenti periodici per quattro o sei ore, fino a quando rimangono solo pochi aggregati di tessuto macroscopico. Successivamente, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per pipettare vigorosamente la soluzione del campione su e giù 10 volte, rilasciando singole cellule dal derma. Centrifuga a 180 g per cinque minuti e scarta il supernatante.
Placcare le cellule dissociate in mezzo DMEM integrato. Nel tardo pomeriggio o sera, semina 6 milioni di cellule 293TT28 in un piatto di 10 centimetri contenente mezzo DMEM integrato. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.
La mattina seguente, assicurarsi che le cellule siano circa il 50% confluenti, quindi trasfetto le cellule con 66 microlitri di reagente di trasfezione, 12 microgrammi di MCPyV ligato isolare R17B DNA, 8,4 microgrammi di pMtB plasmide di espressione ST e 9,6 microgrammi di PADL plasmide di espressione LT. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, quando le cellule trasfette sono quasi confluenti, tripinare le cellule e trasferirle in un piatto di 15 centimetri per una continua espansione.
Quando quel piatto diventa quasi confluente, trasferisci le cellule in tre nuovi piatti da 15 centimetri. Quando questi nuovi piatti diventano quasi confluenti, raccogli le cellule come delineato nel protocollo di testo. Centrifuga a 180 g a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi rimuovere il supernatante e aggiungere un volume di cellule di magnesio DPBS. Aggiungere 25 solfati di ammonio micromolare, seguiti dallo 0,5% di Triton X-100, dallo 0,1% di benzonasi e dallo 0,1% di una DNASI dipendente dall'ATP. Mescolare bene e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno dopo, raffreddare la miscela sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi, aggiungere 0,17 volume di cloruro di sodio. Mescolare e incubare sul ghiaccio per altri 15 minuti.
Centrifuga a 12 mila g a 4 gradi Celsius per 10 minuti. Se il supernatante non è chiaro, invertire delicatamente il tubo e ripetere la centrifugazione. Successivamente, trasferire il supernatante su un nuovo tubo.
Resuspend il pellet in 1 volume di DPBS integrato con 0,8 moli di cloruro di sodio. Centrifuga a 12 mila g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Se il supernatante non è chiaro, invertire delicatamente il tubo e ripetere la centrifugazione.
Unire nuovamente i due supernatanti e centrifuga a 12 mila g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, utilizzare una pipetta per depositare gradienti di iodixanolo in tubi di poliallomero a parete sottile da cinque millilitri come delineato nel protocollo di testo. Caricare 3 millilitri del supernatante contenente virus chiarificato sopra il gradiente di iodixanolo preparato.
Centrifuga con rotore SW 55 Ti a 234 mila g e a 16 gradi Celsius per 3,5 ore, assicurandosi di rallentare l'accelerazione e la decelerazione. Al termine dell'ultracentrifugazione, raccogliere 12 frazioni in tubi siliconizzati. Dopo aver mantenuto e staccato le cellule, a 10 millilitri di DMEM integrato e F12 medio al piatto.
Trasferire la soluzione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Centrifuga a 180 g per due minuti. Scartare il supernatante e sospendere nuovamente le cellule in mezzo DMEM e F12 integrato a una densità cellulare compresa tra 20 mila e 40 mila cellule per millilitro.
Quindi, seme 200 o 400 microlitri della sospensione cellulare integrati con 1 milligrammo per millilitro di collagenasi di tipo IV in ogni pozzo di una piastra di 24 o 96 pozzetti, rispettivamente. Rimuovere il materiale di viron MCPyV dal congelatore meno 80 gradi Celsius e posizionare sul ghiaccio per scongelarsi. Aggiungere 1 miliardo di equivalenti di genoma virale di virioni MCPyV per un microlitro di iodixanolo per ogni 2500-5000 cellule da infettare.
Toccare delicatamente il lato del piatto e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. In primo luogo, fissare le celle sui coperchi scivolare con 4%PFA in PBS per 10 minuti, quindi lavare il coperchio scivola due volte con PBS e trattarle con etanolo al 70% a quattro gradi Celsius durante la notte per permeabilizzare le cellule. Il giorno successivo, sostituire l'etanolo con tampone di idratazione della sonda e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti per pre-ibridare i campioni.
30 minuti prima della fine dell'incubazione pre-ibridazione, diluire le sonde in soluzione di ibridazione della sonda a una diluizione 1:500 e incubare a 45 gradi Celsius. Al termine delle incubazioni, pipettare circa 10 microlitri della miscela di sonda diluita su uno scivolo al microscopio per ogni slittamento del coperchio. Posizionare ogni lato della cella di scorrimento del coperchio verso il basso sulla rispettiva goccia di mix di ibridazione.
Utilizzando una quantità liberale di cemento di gomma, sigillare i bordi e la parte posteriore di ogni coperchio scivolare sul suo scivolo. Impostare lo scivolo sul lato piatto di un blocco di calore e riscaldarlo a 94 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, trasferire lo scivolo in una camera umidificata e incubarli a 45 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno dopo, utilizzare le forceps per rimuovere con cura il cemento di gomma. Posizionare il coperchio scivolare il lato della cella verso l'alto nei pozzi di una piastra di 24 pozza e lavarli con tampone di lavaggio della sonda tre volte a temperatura ambiente. Aggiungere 200 microlitri di tampone di amplificazione a ciascun pozzo contenente un coperchio scivolare e incubare a temperatura ambiente per 30-60 minuti.
Nel frattempo, ricottura ciascuno dei due tornanti oligonucleotidi etichettati riconoscendo le sonde in tubi PCR separati riscaldandole a 94 gradi Celsius per 90 secondi, quindi raffreddandole a temperatura ambiente per 30 minuti. Mescolare le forcine insieme in tampone di amplificazione con una diluizione di 1:50. Successivamente, allungare la pellicola di paraffina sulla faccia aperta di un coperchio a piastra di 12 po 'per creare una superficie per la reazione di amplificazione.
Pipetta 50-100 goccioline di microliter della miscela di forcine sul film di paraffina per ogni slittamento di copertura. Utilizzando le forcep, rimuovere con cura ogni slittamento del coperchio dalla soluzione di pre-amplificazione e toccare il bordo per asciugare una porosa salvietta monouso. Posizionare ogni lato della cella di scorrimento del coperchio essiccato verso il basso su una goccia di amplificazione.
Trasferire il coperchio della piastra in una camera umidificata e incubare durante la notte a temperatura ambiente e al buio. Il giorno dopo, riportare la copertura scivola ai pozzi della piastra del pozzo 24. Aggiungere 5X SSCT contenente DAPI ad una concentrazione di 0,5 microgrammi per millilitro ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per un'ora.
Successivamente, lavare i campioni due volte con 5X SSCT a temperatura ambiente. Montare la copertura lavata scivola su vetrini al microscopio e utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita per analizzare le cellule e immaginirne i campioni. In questo studio, una popolazione quasi omogenea di fibroblasti dermici umani è isolata.
La colorazione immunofluorescente rivela che quasi il 100% delle cellule dermiche umane isolate sono macchiate positivamente per marcatori di fibroblasti dermici, vimentina e collagene, ma negative per il marcatore di cheratinocite del prepuzio umano K14. I virioni MCPyV vengono quindi generati e dopo aver visualizzato la banda di virioni MCPyV concentrati nel nucleo del gradiente, vengono raccolte 500 frazioni di microliter e viene eseguita MCPyV qPCR per identificare le frazioni di picco. Le immagini macchiate immunofluorescenti degli HDF infettati da MCPyV sono mostrate qui, dove le cellule che sono LT positive, VP1 positive o sia LT che VP1 positive sono considerate positive per l'infezione da MCPyV.
Oltre il 30% delle celle è LT positivo e oltre il 10% è positivo al VP1. I genomi MCPyV replicati nelle cellule infette vengono rilevati utilizzando sia l'HCR-DNA FISH che l'Immunofluorescent-HCR-DNA FISH. Mentre l'HCR-DNA FISH rivela la localizzazione del DNA MCPyV presente nella fabbrica di replicazione, i metodi Immunofluorescent-HCR-DNA FISH consentono il rilevamento simultaneo sia del DNA MCPyV che della co-localizzazione delle proteine LT nei centri di replicazione.
Per ottenere la migliore efficienza delle infezioni da virus, è molto importante che MCPyV sia concentrato ad almeno 2 x 10-8 ° genoma del virus per microlitro poiché l'iodoxanolo è tossico per le cellule. A seguito dell'infezione da MCPyV dei fibroblasti dermici, possono essere eseguite molte analisi biologiche molecolari, tra cui immunofluorescenza, immunoblocco, immunopositivizzazione e saggio a base di qPCR. Il sistema di infezione che abbiamo descritto consente ai ricercatori di studiare le fasi dell'infezione da MCPyV come il traffico nucleare e il packaging virale.
MCPyV è un virus BSL-2, ma poco si sa del suo potenziale di patologia nelle quantità raggiunte in un ambiente di laboratorio. Pertanto, i ricercatori dovrebbero prendere precauzioni per evitare l'esposizione al virus.
