Questo lavoro è stato sostenuto da premi da HHMI 56006760 a JDV, il National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) a DMAW, e dal Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) e del NIH (GM45735, GM45735S1 e GM096445) a LP. GM45735S1 è stato emesso dal NIH nell&#39;ambito del Recovery and Reinvestment Act del 2009. I microscopi utilizzati per questi studi sono stati finanziati in parte attraverso un NIH / NCI concessione (5 P30 CA13696).

1. Trasformazione di cellule di lievito con i biosensori <ol><li> Trasforma il ceppo di lievito desiderato con cuscinetto plasmide mito-roGFP o mitGO-ATeam2 con il metodo acetato di litio 27. </li><li> Per confermare la trasformazione con il biosensore plasmide-borne e per evitare la perdita del plasmide, selezionare e mantenere trasformanti sul appropriato terreno selettivo completo sintetico (SC-Ura di mito-roGFP, o SC-Leu per mitGo-ATeam2). Se la sonda fluorescente è stato subclonato in un plasmide diversa da quelle qui descritte, utilizzare il terreno selettivo appropriato. Visualizza trasformanti mediante microscopia a fluorescenza per confermare che essi esprimono il biosensore fluorescente ed esporre normale morfologia mitocondriale. </li></ol> 2. Crescita delle cellule e preparazione per l&#39;imaging Funzione delle cellule e la risposta al trattamento farmacologico sono altamente dipendenti dalla densità cellulare e l&#39;attività metabolica. I migliori risultati si ottengono quando le cellulestanno dividendo attivamente (fase mid-log, ~ 0,5-1 x 10 7 cellule / ml). Il modo più affidabile per generare metà log fase culture di densità costante è per inoculare da una fase stazionaria di pre-cultura. <ol><li> Preparare una fase stazionaria di pre-cultura: scegliere una singola colonia di cellule trasformate da un piatto e inoculare i terreni liquidi selettivi (5 ml in una provetta a fondo conico 50). Crescere a 30 ° C con agitazione a 225 rpm finché la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) ha raggiunto un plateau (24-48). </li><li> Preparare una cultura fase mid-log per l&#39;osservazione: utilizzare l&#39;appropriato volume di pre-cultura per inoculare 5 ml di terreno selettivo in una provetta a fondo conico 50. YPD media è autofluorescente e non deve essere usato per questi studi. Usa, glucosio basato, dropout (SC-Ura) mezzi completi sintetici. Crescere le cellule a 30 ° C, agitando a 225 giri al minuto, per 4-16 ore, fino a raggiungere fase di mid-log (~ 0,5-1 x 10 7 cellule / ml). Densità cellulare può essere determinatamisurando OD 600; calibrare lo spettrofotometro per determinare il corretto OD 600 lettura. Sul nostro Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), metà fase log corrisponde ad un OD 600 di 0,1-0,3. </li></ol> Mito-roGFP1 sensi fluttuazioni del organello in risposta ai cambiamenti metabolici. Per esempio, in questo saggio mitocondriali modifiche dello stato redox quando il lievito crescere su fonti di carbonio fermentabili (ad esempio glucosio, come in SC media) rispetto a fonti di carbonio non fermentescibili (ad esempio glicerolo, come in SGlyc media), e anche in diverse partite della stessa media. Pertanto, utilizzare lo stesso lotto di terreno, per tutti gli esperimenti. <ol start="3"><li> Cellule sono pronte per la concentrazione (vedi punto 2.4) e l&#39;imaging se nessun trattamento è in corso. Se le cellule vengono trattate, incubare le cellule con il trattamento desiderato e proseguire alla fase successiva. </li><li> Concentrare 1 ml di coltura mediante centrifugazione a 6000 xg per 15 sec erisospensione del pellet cellulare in 20 l di media. Queste condizioni massimizzare il numero di cellule distinguibili nel campo di vista. </li><li> Applicare 2 ml delle cellule risospese ad una diapositiva. Coprire con un vetrino coprioggetto (n. 1.5, preferibilmente ad alte prestazioni 170 ± 5 micron di spessore), e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente o valap (vedi Reagenti). Per sigillare con valap, fondere una piccola quantità su una spatola metallica tenendolo su un becco Bunsen, poi diffondere una piccola quantità lungo i bordi del coprioggetto. </li><li> Mantenere le cellule a 30 ° C durante l&#39;imaging. Un riscaldatore obiettivo sul 100x obiettivo a immersione in olio utilizzato per l&#39;imaging funziona bene per questa applicazione. In queste condizioni, la morfologia mitocondriale, stato redox e livelli di ATP rimangono invariati durante l&#39;imaging per 10-15 min. </li></ol> 3. Setup Imaging <ol><li> Impostazione per l&#39;imaging mito-roGFP1 su un ampio campo di microscopio a fluorescenza I passi qui sono su misura per il AxioObserver.Z1 microscopio dotato di un LED sorgente di eccitazione Colibri, un grande campo Orca ER fotocamera e software di acquisizione AxioVision. Fotodecolorazione di entrambi i canali e le foto conversione di ossidati mito-roGFP1 è ridotto in modo significativo utilizzando l&#39;illuminazione a LED rispetto a vapori di mercurio illuminazione lampada (vedi sotto). Per massimizzare il segnale e la risoluzione, utilizzare la più alta apertura numerica possibile l&#39;obiettivo, e l&#39;ingrandimento più basso che fornisce sufficiente risoluzione spaziale. Inoltre, per i mito-roGFP di imaging, verificare che l&#39;obiettivo trasmette bene a 365 nm. Il 100x/1.3NA CE PlanNeofluar obiettivo (Zeiss) funziona bene per questa applicazione. Configurare il software di acquisizione per catturare le specie di mito-roGFP1 ossidato e ridotto. Usiamo le seguenti condizioni. <ol><li> Configurare il canale per ossidato mito-roGFP utilizzare eccitazione a 365 nm (100% di energia LED) e un filtro di emissione adatto per GFP, come il 38 HE filtra set (Zeiss), con la excitatio inclusofiltro n rimossa dal cubo. Rimozione del filtro di eccitazione consente di eccitazione a 365 nm entrambi e 470 nm, senza la necessità di cambiare i filtri, aumentando così risoluzione temporale realizzabile. </li><li> Configurare il canale per ridotta mito-roGFP utilizzare eccitazione a 470 nm (100% di potenza del LED) e, come già detto, lo stesso cubo filtro per le emissioni utilizzato per la ossidato mito-roGFP. Impostare la fotocamera in binning 1x1 per ottimizzare la risoluzione spaziale. </li><li> Impostare il software per l&#39;acquisizione pila az composta da 11 fette con spaziatura 0,5 micron, la raccolta di entrambi i canali in ogni posizione z. Questa modalità di acquisizione è più lenta di acquisire ogni pila z a turno, ma impedisce artefatti derivanti dal movimento mitocondriale tra acquisizione dei canali ossidato e ridotto. </li><li> Immagini diverse celle per determinare un tempo di esposizione appropriato, producendo un segnale forte ma non saturante. È importante mantenere il rapporto di tempi di esposizione per ossidata e ridotta mito-roGFP1 per tutti esperimentos. Per esempio, se i tempi di esposizione per ossidati e ridotti mito-roGFP1 sono 300 e 100 msec, allora il tempo di esposizione per ossidato mito-roGFP1 dovrebbe essere di 3 volte che per ridurre mito-roGFP per tutti gli esperimenti. </li></ol></li><li> Impostazione per l&#39;imaging mitGO-ATeam2 su un microscopio confocale spettrale Per quantificare i livelli di ATP utilizzando mitGO-ATeam2, la fluorescenza di GFP (emissione di massimo 510 nm) deve essere distinto da quello di OFP (emissione massima 560 nm). Ci sono fluorescenza set di filtri che risolvono la fluorescenza emessa da questi fluorofori. Tuttavia, troviamo che un rivelatore spettrale, disponibile su microscopi a scansione confocale molti laser, funziona meglio per questa applicazione. Un rivelatore spettrale separa l&#39;emissione di fluorescenza in molti componenti (tipicamente 32 o più) secondo la lunghezza d&#39;onda. Diverse bande di lunghezza d&#39;onda adiacenti possono essere combinati in un canale dell&#39;immagine. Le lunghezze d&#39;onda per essere combinati sono selezionati empiricamente in modo da massimizzare il segnale da GFP e OFP, evitando di crossover di segnale che potrebbero confondere la misura FRET. Usare la massima apertura numerica della lente disponibile. Usiamo un 100x/1.49 o 60x/1.49 obiettivo Apo-TIRF. Usiamo la Nikon A1R microscopio confocale in esecuzione il software NIS Elements. Configurare il software di acquisizione per catturare le specie mitGO-ATeam2 ATP-bound e ATP-non legato. Usiamo le seguenti condizioni. <ol><li> Impostare pinhole a 1.0 unità di Airy (AU), che sul nostro sistema corrisponde alla risoluzione az di circa 0,42 micron. </li><li> Impostare scansione zoom per avvicinarsi al limite di campionamento di Nyquist, che consentirà di massimizzare l&#39;informazione territoriale nella immagine. Sul nostro sistema la dimensione dei pixel è 0,12 micron. </li><li> Poiché i mitocondri possono muoversi durante l&#39;imaging, può essere utile per aumentare la velocità di imaging da ritaglio il campo a 512 x 256 pixel. Il tempo totale richiesto per immagine di un frame nel nostro sistema è di 1,0 sec, compresa una media di scansione 2 volte. A seconda della risoluzione spaziale desiderata, il campo può essere ulteriormente tagliata per aumene risoluzione temporale. </li><li> Excite a 488 nm, e raccogliere emissione 500-520 nm per GFP, e 550-580 nm per OFP. Valori ottimali effettivi possono variare le caratteristiche del sistema di imaging. </li><li> La potenza del laser ottimale per il nostro sistema è compresa tra 6,0 e 6,4%. La potenza del laser ottimale varia per ogni sistema di microscopio, ma sarà idealmente essere la più bassa possibile, pur producendo un&#39;immagine interpretabile. Utilizzare un misuratore di potenza interno o esterno per monitorare l&#39;andamento del potere del laser, che si verificano normalmente nel corso del tempo in un sistema ottico. </li><li> Regolare il guadagno del rivelatore e l&#39;intensità della luce di illuminazione per massimizzare l&#39;intervallo di valori di pixel rilevato ma evitare di saturare il segnale, per altrettanti possibile di cellule. Non analizzare eventuali cellule contenenti più del 1% pixel saturi. Immagine tutti i campioni con lo stesso obiettivo, potenza del laser, scansione zoom, dimensione dei pixel, guadagno e offset. </li></ol></li></ol> 4. Acquisizione di immagini <ol><li> Individuare il pla focale<html> ne di cellule di interesse con luce trasmessa per minimizzare la sbianca sonda fluorescente. </li><li> Dopo aver individuato una o più celle di interesse, raccogliere una serie z attraverso tutta la profondità di una tipica cellula (circa 7 micron) utilizzando una dimensione di passo di 0,5 micron. </li><li> Immagine altre cellule di interesse sulla diapositiva, ma non una immagine singola diapositiva per più di 15 min. Dopo 15 min sulla diapositiva, le cellule perdono la vitalità. </li></ol> 5. Analisi ATP mitocondriale livello è determinato misurando il rapporto dell&#39;emissione mitGO-ATeam2 a 560 nm a 510 nm che a 27 Lo stato redox della organello viene misurato come ridotto a ossidato (R / O) rapporto di mito-roGFP;. Ie emissione a 510 nm su di eccitazione a 470 nm divisa per emissione a 510 nm su di eccitazione a 365 nm. Prima di calcolare il rapporto, sottraiamo fondo e determinare un valore soglia per pixel appartenenti al fluorescente mitocondri. tenda &quot;&gt; dominio pubblico (ad es ImageJ 30) o disponibile in commercio (ad es Volocity, Perkin-Elmer) software può essere utilizzato per l&#39;analisi di mito-roGFP1 o mitGO-ATeam2. seconda del software utilizzato per l&#39;acquisizione delle immagini e di analisi, le immagini può prima devono essere convertiti in un altro formato, come TIFF, prima di aprire nel software di analisi. Se le immagini vengono convertite, è essenziale verificare che i valori dei pixel non vengono modificati durante la conversione. Analisi di Mito-roGFP1 dati, utilizzando entrambi i programmi è descritto di seguito. menu del programma e le opzioni da selezionare all&#39;interno di ciascun menu sono evidenziate in corsivo grassetto. 5.1 analisi ImageJ <ol><li> Aprire le immagini e il cambiamento di tipo a 32 bit: Immagine → Tipo → 32 bit. </li><li> Disegnare una regione di interesse (ROI) in una zona dove non ci sono le cellule. Calcolare l&#39;intensità media in questo ROI: Analizzare → Misura. </li><li> Sottrarre il fondo medio calcolato dalla pila: Processo → Matematica → Sottrai. </li><li> Utilizzando la sottratto z-stack, trovare la fetta centrale e la soglia di mitocondri: Immagine → Regola → Soglia e fare clic su Applica nella finestra di Threshold. Applica a tutte le sezioni della pila. Selezionare Imposta pixel di sfondo a NaN. </li><li> Creare il rapporto z pila: Processo → Calcolatrice Immagine dividere la pila ridotta dallo stack z ossidato per l&#39;analisi di mito-roGFP1. Dividere l&#39;immagine 560 nm (ATP bound) dai 510 nm di immagine (ATP legato) per l&#39;analisi mitGO-ATeam2. </li><li> Disegnare un ROI intorno alla zona di interesse. Scegliere Analizza → Strumenti → ROI Manager e fare clic su Aggiungi per registrare il ROI. Regioni multiple possono essere memorizzati nel gestore. In ROI Manager, selezionare tutte le ROI, quindi scegliere Mminerale → Multi-Misura per misurare tutte le fette di stack. Esportare i dati in un foglio di calcolo per l&#39;analisi. </li></ol> 5.2 analisi Volocity <ol><li> Importare le immagini in una libreria Volocity e creare una sequenza di immagini a 2 canali. </li><li> Disegnare una regione di interesse (ROI) in una zona dove non ci sono le cellule. Scegli: Strumenti → Rapporto. </li><li> Utilizzare Volocity per calcolare il fondo: ottenere da ROI. </li><li> Regolare la soglia per includere strutture mitocondriali. </li><li> Verificare la possibilità di applicare una LUT arcobaleno al canale rapporto. Il canale intensità modulata può produrre un&#39;immagine meno rumorosa per presenta-zione, ma non dovrebbe essere utilizzato per la quantificazione del rapporto medio. </li><li> Selezionare la scheda di misura, selezionare il canale di rapporto e disegnare un ROI intorno alla zona di interesse. Misurare il canale di rapporto, escludendo i valori zero. Regioni multipli possono essere selezionati e valutatiallo stesso tempo. Esportare i dati in un foglio di calcolo per l&#39;analisi. </li></ol>

<ol>
	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui, descriviamo i metodi da utilizzare mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 come biosensori per valutare mitocondriale stato redox e livelli di ATP in cellule di lievito vive. Troviamo che l&#39;espressione del plasmide-borne mito-roGFP1 o mitGO-Ateam risultati in quantitativa mira a mitocondri, senza alcun effetto evidente sulla morfologia o la distribuzione mitocondriale o sui tassi di crescita cellulari. 3 Mito-roGFP1 in grado di rilevare variazioni di stato redox mitocondriale da molto ossidato a stati fortemente ...

I mitocondri sono organelli essenziali per la produzione di ATP, la biosintesi di aminoacidi, acidi grassi, ferro eme, ammassi di zolfo e pirimidine. I mitocondri svolgono anche un ruolo fondamentale nell&#39;omeostasi del calcio e nella regolazione dell&#39;apoptosi. 1 crescenti prove link mitocondri di invecchiamento e malattie legate all&#39;età come il morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica, e la malattia di Huntington. 2 Mentre gli individui vivono tutta la loro vita con mutazioni nelle proteine ​​mitocondriali che sono associate con malattie neurodegenerative, i sintomi della malattia si verificano solo tardi nella vita. Questo indica che i cambiamenti avvengono nei mitocondri con l&#39;età che permettono malattia patologia ad emergere. Infatti, fitness mitocondriale è correlata con la salute generale delle cellule e la durata della vita nei lieviti e cellule di mammifero. 3,4 Qui, descriviamo come utilizzare biosensori fluorescenti geneticamente codificati, raziometriche per valutare due aspetti critici della Mitochondria in cellule di lievito vive: stato redox e livelli di ATP. Funzione mitocondriale in aerobico mobilitazione energia è ben stabilita. Stato redox mitocondriale è un prodotto di ossidanti e riducenti specie nel organello, compresi NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutatione / glutatione disolfuro (GSH / GSSG) e specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS). Sganciamento mitocondri o ipossia interessa l&#39;attività respiratoria mitocondriale e altera il rapporto di NAD + in NADH in organello. ROS, che sono prodotte dal trasferimento di elettroni inefficiente tra i complessi della catena di trasporto degli elettroni nella membrana mitocondriale interna, così come dalla deaminazione di amine tramite monoamino-ossidasi nella membrana mitocondriale esterna 5, lipidi danni, proteine ​​e acidi nucleici e hanno stato collegato a invecchiamento e le malattie neurodegenerative associate all&#39;età 6,7,8. ROS anche svolgere un ruolo nella trasduzione del segnale in mitochondria, attraverso l&#39;ossidazione di GSH. Ad esempio, NADH deidrogenasi contribuisce non solo alla produzione di ROS, ma anche è regolata attraverso le interazioni con il pool di glutatione 9,10. deidrogenasi α-chetoglutarato e aconitasi, componenti del ciclo TCA, mostrano un&#39;attività ridotta in ambienti ossidanti 11,12. Infatti, regolazione redox-dipendente di attività aconitasi è conservato dai batteri ai mammiferi 13,14. Pertanto, il monitoraggio dello stato redox e livelli di ATP di mitocondri è fondamentale per capire la loro funzione e il ruolo nella malattia di patologia. Metodi biochimici sono stati utilizzati per valutare lo stato redox o livelli di ATP di cellule intere o mitocondri isolati. I metodi utilizzati per valutare lo stato redox delle cellule intere o mitocondri isolati si basano sulla misurazione dei livelli della coppia redox GSH / GSSG 15. Il sistema luciferina-luciferasi viene comunemente utilizzato per misurare mitocondrialeLivelli di ATP nelle cellule intere sia permeabilizzate o mitocondri isolati. 16,17,18,19,20 In questo saggio, luciferasi lega alla ATP e catalizza l&#39;ossidazione di chemiluminescenza e dalla luciferina. 21 L&#39;intensità della luce emessa è proporzionale alla quantità di ATP nella miscela di reazione. 22 Questi metodi hanno rivelato informazioni fondamentali riguardanti la funzione mitocondriale, tra cui la constatazione che i pazienti con malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer, hanno livelli anormalmente bassi di ATP. 23 Tuttavia, essi non possono essere usati a vivere immagine, cellule intatte. Inoltre, metodi basati su analisi a cellule forniscono una media di stato redox o livelli di ATP in tutti i compartimenti della cellula. Misure in organelli isolati sono potenzialmente problematico perché mitocondriale stato redox o livelli di ATP possono cambiare durante il frazionamento subcellulare. Infine, recenti studi del nostro laboratorio e altri indicano chemitocondri all&#39;interno delle singole celle sono eterogenei in funzione, che a sua volta influenza la durata della vita delle cellule madre e figlia. 3 Quindi, vi è la necessità di misurare i livelli di ATP mitocondriale e lo stato redox nelle cellule viventi con risoluzione sub-cellulare. I biosensori per la funzione mitocondriale descritti qui sono entrambi basati su GFP. GFP redox-sensibile (roGFP) 24,25 è una variante di GFP in cui superficie esposti cisteine ​​vengono aggiunti alla molecola. roGFP, come wild-type GFP, ha due picchi di eccitazione (a ~ 400 nm e 480 nm ~) e un picco di emissione a ~ 510 nm. Ossidazione dei residui di cisteina nei risultati roGFP in un aumento di eccitazione a 400 nm. Riduzione di quei cisteine ​​favorisce eccitazione a ~ 480 nm. Perciò, il rapporto di 510 nm di emissione di roGFP upon eccitazione a 480 nm e 400 nm rivela la quantità relativa di ridotta e ossidata roGFP, che riflette lo stato redox dell&#39;ambiente del fluoroforo. Due versioni di roGFP sono ampiamente utilizzati: roGFP1 e roGFP2. Entrambi contengono gli stessi inserimenti cisteina. roGFP1 è basato sulla GFP wild-type e roGFP2 si basa su S65T GFP, che ha più efficiente eccitazione a 480 nm e meno efficiente eccitazione a 400 nm rispetto al wtGFP 24. roGFP1 pH è meno sensibile rispetto roGFP2 e la sua gamma dinamica prosegue nel range ridotto. Così, roGFP1 può essere più utile per monitorare comparti più riducenti come i mitocondri e il citosol, e scomparti con pH variabile, come endosomi. roGFP2 offre segnale luminoso e, in alcuni studi, una più ampia gamma dinamica rispetto roGFP1 24,26. Studi in Arabidopsis thaliana indicano che il tempo necessario per rispondere alle variazioni di stato redox è simile per entrambi i sensori (t ½ per l&#39;ossidazione, 65 e 95 sec e t ½ per la riduzione, 272 e 206 sec, per roGFP1 e roGFP2, rispettivamente). 26 MitGO-ATeam2 è un mini-invasiva, affidabilesensore che misura ATP mitocondriale nella nascente lievito Saccharomyces cerevisiae. GO-Ateam è un trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sonda che consiste della subunità ε della F o F 1-ATP sintasi FRET sandwich tra donatore e accettore proteine ​​fluorescenti (GFP e arancio proteina fluorescente (OFP), rispettivamente). 27 legame di ATP ai risultati subunità ε nei cambiamenti conformazionali nella proteina che portano il FRET donatore in prossimità del accettore e il trasferimento di energia dal donatore accettore. Ci sono due varianti di GO-Ateam, GO-ATeam1 e GO-ATeam2. GO-ATeam2 ha una maggiore affinità per MgATP rispetto GO-ATeam1, rendendolo più adatto per misurare l&#39;tipicamente inferiore [ATP] nei mitocondri rispetto al citosol. 27 Per sondare stato redox mitocondriale, abbiamo costruito una proteina di fusione (mito-roGFP1) costituito roGFP1 fusa alla sequenza leader di un ATP9nd espressa da un&#39;espressione lievito centromero-based (basso numero di copie) plasmide sotto controllo del forte deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GPD) promotore (p416GPD, Addgene). Abbiamo usato roGFP1 per sondare lo stato redox dei mitocondri nel contesto di invecchiamento del modello fungo Saccharomyces cerevisiae. Troviamo che roGFP1 in grado di rilevare variazioni di stato redox mitocondriale che si verificano durante l&#39;invecchiamento e in risposta alla disponibilità di nutrienti, ma non ha alcun effetto negativo sulla apparente cellule di lievito. Vediamo anche la variabilità dello stato redox dei mitocondri all&#39;interno delle singole cellule di lievito viventi, un risultato che sottolinea l&#39;importanza di un biosensore con subcellulare risoluzione spaziale. MitGO-ATeam2 è una variante del GO-ATeam2, che ha la sequenza segnale mitocondriale di citocromo c ossidasi subunità VIII inserito al terminale amminico di GO-ATeam2 27. Abbiamo modificato la sonda mitGO-ATeam2 (gentilmente fornite dal laboratorio di H. Noji, Istituto of Ricerca Scientifica e Industriale, Università di Osaka, Giappone) per l&#39;uso nel lievito da subclonaggio esso, tramite Xba1 e siti HindIII, nel vettore di espressione di lievito pAG415GPD-CCDB (Addgene, Cambridge, MA, USA), che è un low-copia plasmide contenente il promotore costitutivo forte GPD. Abbiamo espresso mitGO-ATeam2 in lievito in erba, e troviamo, dalla controcolorazione con il colorante DAPI legame al DNA, che si localizza esclusivamente ai mitocondri, dove serve come una sonda efficace per misurare i cambiamenti fisiologici nei livelli di ATP mitocondriale. roGFP e GO-Ateam sono entrambi geneticamente codificati. Come risultato, essi possono essere introdotti e mantenuti stabilmente in cellule intatte, e forniscono informazioni su stato redox o livelli di ATP in singole, cellule viventi. Inoltre, entrambi i biosensori monitorare i cambiamenti di stato redox o livelli di ATP che si verificano in condizioni fisiologiche. 28 Entrambe le sonde sono anche ratiometrica. Come risultato, le misurazioni effettuate con queste sonde non risentono chaNGES nella concentrazione biosensore o l&#39;illuminazione del campione o spessore. Infine, entrambi i biosensori forniscono subcellulare risoluzione spaziale. Infatti, roGFP è stato preso di mira da mitocondri, ER, endosomi e perossisomi 24, e in grado di rilevare i cambiamenti di stato redox di ciascuno di questi organelli, in gran parte indipendenti di pH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

I mitocondri hanno ruoli in molti processi cellulari, dal metabolismo energetico e l&#39;omeostasi del calcio per controllare di vita cellulare e morte cellulare programmata. Questi processi influenzano e sono influenzate dallo stato redox e della produzione di ATP dai mitocondri. Qui, descriviamo l&#39;uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati che possono rilevare mitocondriale stato redox e livelli di ATP a risoluzione sub-cellulare in cellule di lievito vive. Stato redox mitocondriale è misurata utilizzando redox-sensibili proteina fluorescente verde (roGFP), che si rivolge alla matrice mitocondriale. Mito-roGFP contiene cisteine ​​nelle posizioni 147 e 204 della GFP, che subiscono ossidazione e riduzione reversibile e ambiente-dipendente, che a sua volta altera lo spettro di eccitazione della proteina. MitGO-Ateam è un trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sonda in cui la subunità ε della F o F 1-ATP sintasi è inserita tra FRET donatore e accettore fluoproteine ​​centi. Legame di ATP ai risultati subunità ε nei cambiamenti conformazionali nella proteina che portano il donatore e accettore FRET in stretta vicinanza e per consentire il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza dal donatore al accettore.

Misurare stato redox mitocondriale con mito-roGFP Qui, dimostriamo che mito-roGFP1 ha la gamma dinamica per rilevare cambiamenti di stato redox mitocondriale da completamente ossidato a ridotto in cellule di lievito vive, senza influenzare la crescita delle cellule di lievito o la morfologia mitocondriale. In primo luogo, troviamo cellule che esprimono GFP mitocondri mirati e roGFP1 crescono a ritmi normali (Figura 1A). Il tasso di crescita massimo, misurato dalla massima pende...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Descriviamo l&#39;uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati, che si basano sulla GFP, per monitorare lo stato redox mitocondriale e livelli di ATP a risoluzione subcellulare in vita cellule di lievito.

Biosensori MIL Tale misura mitocondriale stato redox e ATP in cellule viventi di lievito

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.9K Views.  Columbia University. Descriviamo l'uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati, che si basano sulla GFP, per monitorare lo stato redox mitocondriale e livelli di ATP a risoluzione subcellulare in vita cellule di lievito.

Video: Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Ricerca

Bioingegneria

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Lifetime Imaging di fluorescenza di rotori molecolari nelle cellule viventi

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Manipolazione spazio-temporale di attività GTPasi Piccolo a livello subcellulare e su scala temporale di secondi nelle cellule viventi

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hollow microago-based sensore per Multiplexed transdermico elettrochimica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Rilevamento ottico di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolamento dei lipidi cellulari Goccioline: due tecniche di purificazione partire da cellule di lievito e placente umane

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Un protocollo per l&#39;utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Utilizzando biologia sintetica per Ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...