We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at&#160;University of California Berkeley&#160;for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article. 
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.

1 Manuale Sottratto modello di generazione Nota: I dettagli della metodologia descritti di seguito sono specifici per Chimera, ma altri pacchetti software possono essere utilizzati al posto. Utilizzare questo approccio quando l&#39;unico obiettivo è quello di creare un modello geometrico (ad esempio, un modello di palla e bastone) al fine di effettuare misurazioni geometriche, invece di visualizzare la forma del volume degli oggetti. <ol><li> Importare il volume di dati in un programma adatto per manuale generazione del modello astratto. <ol><li> Selezionare File&gt; Apri Mappa per tirare su la finestra di dialogo Apri file. Selezionare il percorso del file della mappa desiderata. </li><li> Sollevare il Volume Viewer (Strumenti&gt; Dati Volume&gt; Volume Viewer) e selezionare Funzioni&gt; Stile di visualizzazione per visualizzare i dati con diversi stili di rendering. </li><li> Regolare la soglia per il display trascinando la barra verticale a istogramma in Volume Viewerfinestra. </li></ol></li><li> Navigare attraverso il volume 3D (ad esempio, fetta dopo fetta) per selezionare un&#39;area di interesse per la segmentazione e ritagliare un sub-volume più piccolo, se necessario. <ol><li> Nella finestra di dialogo Volume Viewer, fare clic su Asse, quindi selezionare X, Y, o Z. </li><li> Nella finestra di dialogo Volume Viewer, selezionare Funzioni&gt; Aerei. Clicca One per impostare Profondità per visualizzare il piano corrispondente al numero nella casella di sinistra, e fare clic su Tutti per visualizzare tutti i piani. </li><li> Nella finestra di dialogo Volume Viewer, selezionare Funzioni&gt; selezione Subregione. <ol><li> Fare clic e trascinare per creare un rettangolo intorno alla regione di interesse. </li></ol></li></ol></li><li> Posizionare i marcatori lungo la caratteristica di interesse e collegarli con linker, se del caso (spesso fatto automaticamente dal programma) fino a quando il modello è completo. <ol><li> Dalla barra dei menu Volume Viewer, selezionare Strumenti&gt;Finestra Tracer Volume per aprire la finestra di dialogo Volume Tracer. Nella finestra di dialogo Tracer Volume, selezionare File&gt; Nuovo Marker Set. </li><li> Nella finestra di dialogo Tracer volume, controllare Mouse&gt; Luogo marcatori su di alta qualità, segnaposto su piani dati, spostare e ridimensionare i marcatori, Link nuovo marker marker selezionato, e Link marcatori consecutivamente selezionato. </li><li> Fare clic sul campione Marker colori, e selezionare un colore. Ripetere questo passaggio per collegamento colore. </li><li> Inserisci raggi per i marcatori e gli elementi di collegamento di creazione del modello. </li><li> Nella finestra Tracer Volume, selezionare Posizionare i marcatori con il pulsante [destro] del mouse, e inserire raggi per i marcatori e link. </li><li> Fare clic destro sui dati del volume per cominciare, che stabilisce i marcatori. I marcatori saranno collegati automaticamente. </li><li> Nella finestra di dialogo Tracer Volume, selezionare File&gt; Salva set marcatore corrente, quindi File&gt; Chiudi set marcatore. </li></ol></li&gt; <li> Aprire un nuovo set marcatore (punto 1.3.1) per iniziare a costruire un modello in una seconda funzione desiderata di interesse. Utilizzare colori tra le serie marcatori a contrasto per sottolineare le differenze nelle caratteristiche. </li></ol> 2 Tracciamento Manuale di caratteristiche di interesse Nota: I dettagli della metodologia descritti di seguito sono specifici per Amira, ma altri pacchetti software possono essere utilizzati al posto. Utilizzare questo approccio quando la densità di popolazione è relativamente piccola e quando la precisione di estrazione di caratteristiche è fondamentale, in quanto tracciamento manuale è un approccio che richiede tempo. <ol><li> Dati Volume delle importazioni in un programma con opzioni di analisi manuale. Software con questa capacità generalmente offrono almeno uno strumento pennello di base. <ol><li> Per grandi volumi o tomografie (ad esempio, 16 bit 2.048 x 2.048 o superiore .rec o .mrc tomogrammi generato in IMOD): Selezionare Open Data&gt; clic destro su filename.rec&gt; Formato ...&gt; selezionare Raw come LargeDiskData </i&gt;&gt; Ok&gt; Carica. Selezionare Parametri dati appropriati crudo di informazioni di intestazione&gt; Ok. Alterna e Salva con nome di un nuovo <a href="http://filename.am/">filename.am</a> file per l&#39;uso nei seguenti passaggi. </li><li> Per i più piccoli file di immagine 3D dello stack (ad esempio, tif 3D o .mrc o .rec): Open Data&gt; Selezionare filename.tif o filename.mrc. Toggle e fare clic destro&gt; Salva con nome <a href="http://filename.am/">filename.am</a> . Se un errore viene generato o il programma non risponde, il file potrebbe essere troppo grande e può essere aperto seguendo passo 2.1.1. </li></ol></li><li> Navigare attraverso le fette di selezionare un sotto-volume 3D per la segmentazione, e poi ritagliare per questa area di interesse. <ol><li> Nella finestra Visualizzatore 3D, selezionare Orthoslice per aprire file di immagine. Utilizzare cursore in basso per navigare attraverso le fette. </li><li> Per ritagliare dati di grandi dimensioni aperti come LargeDiskData, ginocchiera nome del file nella finestra Pool&gt; Tasto destro del mouse&gt; LatticeAccess. Enter dimensioni casella desiderata&gt; Applica. Salvare nuovo file. </li></ol></li><li> Crea file di segmentazione. <ol><li> Spostare il file nella finestra Pool&gt; tasto destro&gt; Etichettatura&gt; labelField. Verrà creato un nuovo file e caricato automaticamente nella scheda Segmentazione Editor. </li></ol></li><li> Tracciare il confine del primo lungometraggio di interesse, quindi riempire la traccia a mano o utilizzando un comando specifico per il software utilizzato. Seguire la caratteristica di interesse attraverso tutte le sezioni e ripetere la segmentazione tracciamento manuale. Utilizzare i seguenti comandi quando si utilizza Amira: <ol><li> Per utilizzare lo strumento Pennello, modificare la dimensione del pennello come desiderato, quindi utilizzare il puntatore del mouse per tracciare il confine della caratteristica di interesse. </li><li> Riempire l&#39;area tracciata con scorciatoia &quot;f&quot;. Aggiungere la selezione facendo clic sul pulsante con il segno più, o la scorciatoia &quot;a&quot;. Se necessario, premere il tasto &quot;u&quot; per annullare, e &quot;s&quot; per sottrarre o cancellare. </li></ol&gt; </li><li> Generare un rendering di superficie per visualizzazione e qualitativa di base o l&#39;analisi quantitativa per software di istruzioni manuale d&#39;uso. <ol><li> Nella scheda Oggetto Pool, passare il nome del file-labels.am nella finestra Pool&gt; Tasto destro del mouse&gt; SurfaceGen. </li><li> Selezionare le proprietà della superficie desiderata&gt; Applica. Un nuovo filename.surf file verrà creato nella Pool. </li><li> Per visualizzare il volume segmentato, ginocchiera filename.surf nella finestra Pool&gt; Tasto destro del mouse&gt; SurfaceView. </li><li> Utilizzare gli strumenti nella finestra 3DViewer per spostare, ruotare e ingrandire il volume 3D. </li></ol></li><li> Estrarre le densità esatta e determinare le misurazioni come volume o di superficie. Esporta in altri programmi per più avanzate di visualizzazione, l&#39;analisi e la simulazione. <ol><li> Sulla finestra 3DViewer, fare clic su Misura utensile&gt; Selezionare l&#39;opzione appropriata (lunghezza 2D e angolo 2D per misure su un unico piano 2D, 3D e lunghezza Angle 3Dper misurazioni su un volume 3D). </li><li> Clicca su superficie mesh per misurare la lunghezza desiderata, la distanza, e gli angoli. I valori saranno elencati nella finestra Proprietà. </li></ol></li></ol> 3. automatico segmentazione basata Density- Nota: I dettagli della metodologia descritti di seguito sono specifici per Amira, ma altri pacchetti software possono essere utilizzati al posto. <ol><li> Utilizzare questo approccio su insiemi di dati con qualsiasi varietà di contrasto, nitidezza, o affollamento di ritirare le densità di interesse. </li><li> Dati Volume delle importazioni in un programma dotato di soglia, bacchetta magica, o altri strumenti basati densità per la segmentazione automatica. Seguire i passaggi descritti in 2.1-2.1.2 nelle direzioni per il tracciamento manuale. </li><li> Navigare attraverso fette e selezionare l&#39;area per la segmentazione. Se necessario, ritagliare un sub-volume più piccolo 3D per la segmentazione. Seguire i passaggi descritti in 2.2-2.2.2 nelle direzioni per il tracciamento manuale. </li><li> Selezionare la densità diuna caratteristica di interesse, di solito facendo clic o mettendo un punto di marchio o di ancoraggio sulla funzione. Se permesso nel software, immettere un intervallo di numeri che comprende l&#39;intensità dei pixel della funzione e regolare questa tolleranza, se lo desideri. Densità appartenenti alla funzione saranno raccolti in base all&#39;intensità del valore del pixel o la tolleranza del ancoraggio. Utilizzare i seguenti comandi quando si utilizzano Amira. <ol><li> Utilizzare lo strumento Bacchetta magica per caratteristiche con margini distinguibili. <ol><li> Clicca sull&#39;area di interesse, quindi regolare i cursori in Display e mascheratura di catturare corretto intervallo di valori in modo che la funzione è completamente evidenziata. Aggiungere la selezione con collegamento &quot;a&quot;. </li></ol></li><li> Utilizzare lo strumento Soglia per caratteristiche senza margini chiaramente distinguibili. </li><li> Selezionare l&#39;icona Soglia. Regolare il dispositivo di scorrimento per regolare la densità nel raggio d&#39;azione auspicabile in modo che solo le caratteristiche di interesse sono mascherati. Fare clic sul pulsante Seleziona, quindi aggiungere la selezione di scelta rapida220; un &quot;. </li><li> Per segmento intero volume, selezionare Tutte le sezioni prima di aggiungere la selezione. </li><li> Per rimuovere il rumore, selezionare Segmentazione&gt; Rimuovi Isole e / o segmentazione&gt; etichette lisce. </li></ol></li><li> Generare una superficie per la visualizzazione e l&#39;analisi qualitativa, come descritto nella sezione tracciamento manuale 2.6-2.6.2. Se lo si desidera, l&#39;esportazione verso altri programmi per un&#39;adeguata visualizzazione 3D, analisi quantitative e simulazioni. </li></ol> 4 su misura automatizzata Segmentazione Nota: utilizzare questo metodo per creare script personalizzati per la segmentazione automatica, che richiede esperienza background in informatica, ma consente la possibilità di creare un modello preciso di densità da un grande volume. <ol><li> Strumenti (esempio specifico di segmentazione Shape-supervisionata in MATLAB 27) <ol><li> Immagine di pre-processing: Eseguire de-noising, rimozione dello sfondo e miglioramento delle immaginiutilizzando la seguente condotta: <ol><li> Caricare l&#39;immagine utilizzando il comando imread. <ol><li> Nella riga di comando, digitare: &gt;&gt; im = imread ($ percorso_immagine), dove $ percorso_immagine è la posizione dell&#39;immagine da analizzare. </li></ol></li><li> Dal Processing Toolbox Immagine, chiamare Wiener Filter utilizzando un rapporto di stima o conosciuto rumore-potenza del segnale (NSR). </li><li> Sull&#39;immagine elaborato in precedenza, chiamare la funzione di apertura dell&#39;immagine imopen per stimare il livello di sfondo, quindi destinare il risultato come una maschera diversa. <ol><li> Nella riga di comando, digitare:. &gt;&gt; Background = imopen (im, Strel ($ shape_string, $ size)), in questo modo, $ shape_string è uguale a &#39;disco&#39; la variabile $ dimensione è data dalla analizzatore cioè &gt;&gt; background = imopen (im, Strel (&#39;disco&#39;, 15)). </li></ol></li><li> Sottrarre l&#39;immagine filtrata con lo sfondo. <ol><li> Nella riga di comando, digitare: &gt;&gt; IM2 = im -sfondo </li></ol></li><li> A seconda della qualità dei risultati, eseguire la normalizzazione dell&#39;immagine con o senza metodo adattivo di Otsu 28, che può essere chiamato utilizzando la funzione imadjust dal Image Processing Toolbox. <ol><li> Nella riga di comando, digitare: &gt;&gt; IM3 = imadjust (IM2) </li></ol></li><li> Preparare le caratteristiche di interesse per la segmentazione, limitando le regioni di interesse da parte ritagliare l&#39;immagine normalizzata. <ol><li> Utilizzando il comando imtool, esplorare la regione di interesse che deve essere ritagliata e fornire le coordinate al comando: &gt;&gt; im3_crop = imcrop (IM3, [x1 y1 x2 y2]), in cui il vettore [x1 y1 x2 y2] corrisponde a la regione quadrata da ritagliare. </li></ol></li></ol></li><li> Forma di riconoscimento / classificazione supervisionata forma: Addestrare l&#39;algoritmo fornendo esempi specifici per ogni diversa categoria di oggetti (tracce lineari in un&#39;immagine 2D attraverso le caratteristiche di interesse). <ol><li> Verificare che VLFEAT 29 API viene installato correttamente e visitare il sito web di VLFEAT per la documentazione più approfondita. </li><li> Nella riga di comando, digitare: &gt;&gt; [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, K $, $ NLEAVES) dove $ K è il numero di cluster da utilizzare o il numero di classi dell&#39;osservatore vuole organizzare i dati in, e $ NLEAVES è il numero desiderato di cluster foglia cioè &gt;&gt; [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4.100) </li><li> Utilizzare le funzioni segmentati manualmente come input per VLFeat. NOTA: Questa libreria open source basato sul C si esibirà patching dei pixel, delle patch di clustering, e posizionamento centro del cluster in base al tipo di metodo scelto di lavorare meglio per i set di dati. Le opzioni disponibili variano da k-media per il clustering basato su approcci Texton 30, e l&#39;uscita è una matrice numerica che descrive le caratteristiche auspicate in base alla data esemplari. </li></ol></li></ol></li><li> Segmentazione: Utilizzare questa fully automatizzato, anche se computazionalmente costoso, approccio al segmento più classi di oggetti contemporaneamente, che verranno scritte come mappe separate per ulteriori visualizzazione e l&#39;analisi. <ol><li> Caricare l&#39;array numerico generato in precedenza (modello). </li><li> Chiamare la funzione di macchine di supporto vettoriale (SVM) in VLFeat, utilizzando il modello e l&#39;immagine da segmentato come ingresso. <ol><li> Nella riga di comando, digitare: &gt;&gt; [w, b] = vl_svmtrain (x, y, 0,1), dove x è l&#39;originale ritagliata immagine im2_crop e y è l&#39;immagine oggettiva, l&#39;immagine che è stata segmentato manualmente. Utilizzare &gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG (I, etichette) per colorare i risultati in base alle etichette generate dal raggruppamento. NOTA: Sulla base delle caratteristiche del modello, VLFeat classificherà l&#39;immagine del numero di classi (caratteristiche di interesse) assegnati dall&#39;inizio. A seconda del grado di accuratezza desiderato, è possibile combinare questo metodo con altri approcci o stima cluster parametri come i centri di scafo e di cluster. L&#39;output dell&#39;algoritmo SVM è un modello probabilistico e più maschere binarie delle classi desiderati nei nuovi insiemi di dati. </li></ol></li><li> Salvare i risultati immettendo il comando: &gt;&gt; imwrite (im, format $, $ nomefile) dove $ formato è &#39;tiff&#39; e $ nomefile è il percorso per il file di output. </li><li> Per visualizzare le immagini, immettere il comando: &gt;&gt; imshow (im). </li></ol></li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

Strategie efficaci per l&#39;estrazione di caratteristiche rilevanti di volumi 3D EM sono urgentemente necessarie al fine di tenere il passo con lo tsunami di dati che ha recentemente colpito l&#39;imaging biologico. Mentre i dati possono essere generati in ore o giorni, ci vogliono molti mesi per analizzare i volumi 3D in profondità. Pertanto, è chiaro che l&#39;analisi delle immagini è diventato il collo di bottiglia per scoperte scientifiche; senza soluzioni adeguate per questi problemi, gli scienziati di imaging diventano vittime del loro stesso successo. Ciò è in parte dovuto alla elevata complessità dei dati e anche l&#39;affollamento macromolecolare tipicamente presenti nelle cellule biologiche, dove le proteine ​​e complessi proteici una frontiera all&#39;altra e sostanzialmente appaiono come un gradiente continuo di densità in scala di grigi. Il problema è complicato dalla preparazione del campione e di imaging imperfezioni, e in alcuni manufatti di ricostruzione dell&#39;immagine casi, portando a meno che perfetto dati volumetrici che possono rappresentare sfide per approccio completamente automatizzatoes. Più significativo, tuttavia, è il fatto che gli esperti in preparazione del campione, l&#39;imaging, e l&#39;interpretazione biologica sono raramente ben versati nella scienza computazionale, e quindi richiedono una guida su come affrontare in modo efficace estrazione di caratteristiche e di analisi. Pertanto, attraverso l&#39;uso di vari esempi, il protocollo spiega come preparare i dati per la segmentazione, nonché i passaggi per la generazione manuale astratto modello, la segmentazione automatica basata densità, tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse, e la segmentazione automatica su misura. Gli approcci manuali e automatiche descritte nella procedura si possono trovare in una grande varietà di software di segmentazione, alcuni dei quali sono menzionati qui, ma altri svolgono funzioni analoghe e sono ugualmente adatti. I risultati dimostrano che l&#39;efficacia di ciascuno dei metodi di segmentazione 3D varia per ogni diversa tipologia di insiemi di dati. Anche se i diversi approcci hanno prodotto qualitativamente srendering 3D analoghe sui come il prodotto finale, la quantità di tempo e lo sforzo speso per ciascun durante il processo di segmentazione varia in modo significativo. Le raccomandazioni per adeguate caratteristiche di immagine e gli obiettivi personali per ogni approccio di segmentazione sono riassunti nella figura 5, che viene ulteriormente spiegata nelle seguenti quattro sottosezioni. Questi criteri sono stati applicati ai sei set di dati, come mostrato nel diagramma di flusso decisione di figura 6. Sebbene figure 5 e 6 sono semplicemente lo scopo di fornire una spiegazione razionale per ogni set di dati e di come ciascuno dei criteri sono stati pesati nel processo decisionale, non forniscono una guida infallibile, ma piuttosto un punto di partenza. Ci sono semplicemente troppi criteri che influenzano il processo decisionale: alcuni sono criteri oggettivi, quali le caratteristiche dei set di dati, mentre altri sono criteri più soggettivi, come ad esempio l&#39;obiettivo desiderato. E &#39;sicuro dire che i set di dati che mostrano un alto livel di contrasto con contorni nitidi taglienti, hanno caratteristiche che sono ben separati e relativamente omogenea (non troppo diversi), e vengono elaborati con l&#39;obiettivo di esporre un modello di densità per un gran numero di oggetti, metodi automatizzati saranno superiori, se non per il fatto che gli approcci manuali sarebbero semplicemente delle risorse (tempo) -prohibitive. D&#39;altra parte, se il contrasto è basso, il dato è sfocata e richiede la conoscenza di un esperto, gli oggetti sono affollate, e le caratteristiche mostrano una grande diversità e sono quindi eterogenei quindi, uno non può avere altra scelta che l&#39;estrazione di feature manuale / segmentazione. Manuale Sottratto Modello Generation Manuale astratto modello di analisi è particolarmente efficace nella segmentazione elementi lineari, fornendo sementi punti (palline) che possono essere collegati automaticamente (bastoncini). Tali palle e bastoni-modelli possono essere molto potente per misurare la lunghezza di unnd orientamento di tale modello e fornire un modello sufficientemente estratta sia per l&#39;ispezione qualitativa e analisi quantitativa. Manuale di generazione del modello astratto viene comunemente usato quando minimizzando le risorse impiegate per l&#39;analisi è più importante di assoluta fedeltà alle forme dei dati originali. E &#39;di maggior successo con le caratteristiche lineari e omogenei di interesse (ad esempio, filamenti, tubi). Dati contrasto, nitidezza, e affollamento non svolgono un ruolo importante nel determinare il successo di questo metodo, a patto che l&#39;occhio umano può riconoscere l&#39;oggetto di interesse. A volte tali modelli possono anche essere utilizzati come uno scheletro di segmentare la mappa 3D in una zona intorno allo scheletro. Anche se il modello è astratto piuttosto che un riflesso di densità esatte, rappresenta una versione scheletrato della densità 3D e quindi permette la visualizzazione senza disordine e analisi qualitativa. Le misure quantitative come la lunghezza possono essere determinate dal modello approssimato. Per unesempio di software con manuale astratto generazione del modello, si prega di visitare la guida dettagliata di Chimera online all&#39;indirizzo <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html</a> . Tracciamento Manuale delle caratteristiche di interesse Manuale pennello tracciato funziona bene con quasi tutte le caratteristiche dei dati, ma è anche il più metodo che richiede tempo. A volte, è l&#39;unica tecnica per l&#39;estrazione di una funzione di interesse da un set di immagini complesso contenente una grande varietà di caratteristiche, come la membrana cellulare sottile e contorto. Un utile strumento disponibile in alcuni programmi permette di interpolazione tra le fette intermittenza segmentati quando la funzione di interesse cambia senza problemi. Tracciamento manuale può essere applicato in modo più efficiente se i dati è fresco e ha medio-alto contrasto, ma può anche essere utilizzatoper insiemi di dati più impegnativi, a patto che l&#39;utente abbia familiarità con l&#39;oggetto di interesse. La complessità dei dati può variare da oggetti discreti a insiemi di dati complessi e affollati, dove gli oggetti sono strettamente imballate. In quest&#39;ultimo caso, la segmentazione manuale può essere l&#39;unica scelta, come approcci automatici spesso stentano a segmentare il volume desiderato e estrarre troppo o troppo poco. Caratteristica morfologie difficili, come ad esempio fogli o volumi contorti, possono anche essere estratti da questo metodo. Tuttavia, l&#39;utente deve tenere a mente che un set di dati con diverse caratteristiche difficili può essere segmentato solo se la densità di popolazione delle caratteristiche di interesse è basso, come la segmentazione di alta densità di popolazione delle caratteristiche di interesse diventa tempo proibitivo. Per un esempio di software di tracciamento manuale, si prega di visitare la guida dettagliata di Amira online all&#39;indirizzo <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guid</a>e.pdf. Automatizzata Segmentazione basata Densità- In contrasto con le tecniche manuali, i metodi automatizzati sono generalmente meno in termini di tempo, che è un fattore importante da considerare quando segmentare una grande pila di immagini. Tuttavia, soglia semplice potrebbe non essere precisi e molto più tempo può essere speso per la raffinatezza e la curatela del volume segmentato automaticamente. Segmentazione basata densità automatica funziona meglio su insiemi di dati che mostrano un gran numero di caratteristiche simili di interesse che richiedono tutte segmentazione. Se i dati è più complessa, queste tecniche automatizzate possono ancora servire come un primo passo, ma probabilmente richiedere un intervento manuale lungo la linea per specificare un volume secondario contenente la caratteristica di interesse. Questa strategia funziona generalmente bene su morfologie lineari o volumi contorti, ma raramente è successo con fogli sottili contorti, comemembrane cellulari. Intervento minimo da parte dell&#39;utente con approcci automatizzati consente la segmentazione attraverso volumi grandi o piccole, mentre spendendo poche risorse degli utenti come il tempo in cambio di alta fedeltà. Per un esempio di software con segmentazione basata densità automatizzato, si prega di visitare la guida dettagliata di Amira online all&#39;indirizzo <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf</a> . Su misura automatizzata Segmentazione Su misura segmentazione automatizzata consente la personalizzazione potere di algoritmi per un set di dati specifici, ma spesso è specifico per i set di dati o tipo di dati, appropriati per un numero limitato di funzionalità caratteristiche, e non può essere generalizzata facilmente. Il procedimento presentato qui è diversa da approcci di segmentazione automatizzate generali, come l&#39;immersione spartiacque e altri livelli di<html> metodi set, che si basano su una determinazione programmato di punti critici di semi, seguita da rapida espansione-marciando cubo da questi punti di sementi. Una variazione su questo tema è la segmentazione di confine, dove le informazioni gradiente vettore informa funzionalità confini. Al contrario, lo script personalizzato qui utilizzato si basa su una fase di formazione in cui l&#39;utente traccia manualmente alcuni esempi. Attraverso l&#39;apprendimento automatico, algoritmi specifici in grado di rilevare e poi imparare a riconoscere autonomamente le proprietà e le caratteristiche dei dati costantemente presenti in tracce. Un utente esperto può riqualificare gli algoritmi e migliorare la precisione di segmentazione includendo esempio più traccia di fornire un più ampio insieme di criteri di funzionalità. In generale, gli approcci thresholding e approcci relativi, o anche su misura possono non essere così utile per estrarre una singola caratteristica di interesse da un&#39;immagine con complessa diversità di organelli o forme, come curation può essere altrettanto alta intensità di lavoro come tracciamento manuale. &quot;&gt; Strategie per triaging dati e scelta di un approccio di segmentazione Dati i criteri soggettivi ed oggettivi presentati nella figura 4 e sintesi di set di dati idonei in figura 5, lo schema decisionale rappresentato in figura 6 in grado di assistere una valutazione efficace delle strategie di estrazione di funzione per una grande varietà di insiemi di dati. I gruppi di dati vengono analizzati e suddivisi in quattro decisioni consecutivi, ciascuno dei quali possono includere uno qualsiasi dei quattro rispettivi obiettivi nonché i quattro criteri soggettivi introdotti nella Figura 4. Come esempio, la Figura 6 è il razionale per triaging ciascuno dei dati di sei insiemi mostrati in Figura 3. Indubbiamente, per impostare ogni dato non vi è un unico percorso unico, ma piuttosto diversi percorsi attraverso questa matrice seguenti criteri diversi per il processo decisionale che può portare to uguali o diversi raccomandazione per la segmentazione di dati. Mentre ogni set di dati avrà il proprio insieme di proprietà, che non si possono prevedere, sei esempi sono dato, ognuno accoppiato con una spiegazione della logica alla base del metodo di estrazione / segmentazione caratteristica preferita. Includere più anche una proposta per un percorso alternativo decisione che abbia conseguenze l&#39;uso dello stesso o di un diverso approccio segmentazione (Figura 6). Il kinocilium è un croccante set di dati con confini ben definiti, il che rende gli approcci automatizzati più probabilità di successo. Tutte le caratteristiche di interesse sono ben separati, ancora una volta favorendo un approccio automatizzato. Inoltre, le caratteristiche di interesse sono simili l&#39;uno all&#39;altro, il che rende relativamente omogeneo insieme di dati ideale per la segmentazione su misura. Infine, l&#39;obiettivo era quello di estrarre l&#39;intera funzione, favorendo un approccio semi-automatico. Di conseguenza, si è concluso che una soglia automatica (solida linea verde), così come una (ad esempio, la forma di segmentazione sorvegliata) approccio custom-designed (linea tratteggiata verde) sono entrambi propensi a fare bene su questo set di dati. Criteri simili, anche se collocato in un ordine diverso nella rete decisioni, si applicano al caso di batteri. Un approccio su misura è raccomandato in parte perché questo insieme di dati era molto grande; di conseguenza, le risorse limitate vietano un manuale approccio intervento / segmentazione alta intensità di lavoro. Mentre soglia avrebbe dato risultati accettabili, l&#39;approccio custom-designed è stato in grado di eseguire obiettivo chiave dello studio di separare le forme batteriche tondeggianti dai depositi di metalli extracellulari, che si trova sia in-tra i batteri o accanto ai batteri, e quindi la approccio su misura è stato preferito. Per i set di dati stereocilia, la prima considerazione è stato l&#39;obiettivo desiderato: l&#39;obiettivo può essere sia di mostrare tutta la densitào per creare modelli geometrici. Il volume di interesse era una zona affollata, e l&#39;obiettivo è stato quello di segmento di un gran numero di oggetti come oggetti separati, al fine di effettuare successivamente l&#39;analisi volumetrica quantitativa, comprese le lunghezze, i numeri, distanze, orientamento, ecc E &#39;stato utile che gli oggetti di interessi erano principalmente lineare, e questo ha reso il modello geometrico tracciando il metodo di scelta. Tuttavia, se invece l&#39;obiettivo è stato quello di mostrare l&#39;intera densità, quindi la caratteristica morfologia lineare e relativamente elevato contrasto con confini ben definiti farebbe un protocollo di soglia automatica fattibile. Le membrane cellulari e casi di dati mitocondri fallo di approcci automatizzati a causa delle loro categorie di caratteristica morfologia: fogli e volumi involuto, rispettivamente. L&#39;obiettivo è quello di tracciare la cella o mitocondri contorno con precisione, ma ci sono solo risorse limitate per farlo. Inoltre, le caratteristiche di traest sono complesse e non può essere facilmente rilevato o forma codificata automaticamente, anche se per i dati mitocondri imposta il metodo di scripting personalizzato adottato per i batteri possono eventualmente essere applicato con un&#39;ulteriore personalizzazione. Fortunatamente, la membrana e mitocondri stessi rappresentano solo una piccola parte dell&#39;intero volume e, di conseguenza, tracciamento manuale è un semplice seppur approccio richiede tempo. Tracciamento manuale è anche il metodo di scelta per tali insiemi di dati quando il contrasto è piuttosto basso ed i confini sono piuttosto confuso. Di conseguenza, anche se essi costituiscono una parte significativa del set di dati, tali fogli contorte devono essere tracciate manualmente, semplicemente a causa della mancanza di un&#39;alternativa migliore. Il set di dati di impianto posato le sue sfide perché l&#39;obiettivo era quello di segmento tutti gli oggetti, che sono densamente distanziati e compongono un paesaggio affollato. Visualizzazione della densità così com&#39;è consentirebbe misurazioni circa la forma e l&#39;organizzazione degli oggetti, ma because segmentare manualmente ogni oggetto filamentosa è troppo costoso, soglia automatica è stato impiegato invece. Le varie fasi ed i risultati corrispondenti nella creazione di un modello 3D sono state esposte qui, ma ancora più importante, le caratteristiche dei dati e dei criteri personali trovati a essere cruciale nel determinare il miglior percorso di segmentazione sono stati anche chiariti. Le caratteristiche importanti includono dati dell&#39;immagine stessa ciò che è descritto qui come contrasto, affollamento, freschezza, e il numero di forme o funzioni (quali organelli, filamenti, membrane) differenti. Criteri soggettivi da considerare sono l&#39;obiettivo auspicato di segmentazione (misura / conteggio, rappresentazione scheletrato dei dati / Visualizzazione dei volumi di rendering 3D), le caratteristiche morfologiche della caratteristica di interesse (lineare, allungata, in rete, complesso, contorto), la densità di caratteristiche di interesse in relazione a tutto il volume (la frazione degli oggetti che sonoimportante e necessitano di essere estratti), e bilanciando i compromessi di spendere risorse per la fedeltà della segmentazione dei dati originali e il ritorno con riduzione degli investimenti con conseguente miglioramenti incrementali per sostanzialmente più elevato allocazione delle risorse. Il campo di segmentazione dell&#39;immagine è notevolmente maturato nel corso degli ultimi anni, eppure non c&#39;è pallottola d&#39;argento, nessun algoritmo o un programma che può fare tutto. Dimensioni dei set di dati sono cresciuti da centinaia di megabyte di routine decine di gigabyte, e ora stanno iniziando a superare terabyte, rendendo la segmentazione manuale quasi impossibile. Così, più risorse devono essere investite negli approcci di estrazione funzionalità intelligenti e di tempo-efficace che imitano il processo decisionale umano. Tali sforzi dovranno essere combinato con (1) sistema di informazione geografica (GIS) a base di semantiche basi di dati gerarchiche (simile a Google Earth), (2) tecniche di astrazione dei dati (ad esempio, la transizioneda un voxel alla rappresentazione / volumetrico geometrico) compatibile con il calcolatore di progettazione assistita (CAD) software al fine di ridurre significativamente la quantità di dati e consentendo così la visualizzazione di grandi volumi 35, (3) tecniche di simulazione, in quanto essi sono spesso usati nella discipline ingegneristiche, nonché (4) animazione avanzata e creazione di filmati funzionalità, tra cui animazioni fly-through (simile a quello che viene sviluppato per l&#39;industria del gioco). Chiaramente, estrazione delle caratteristiche efficiente e segmentazione è al centro di questa rivoluzione nel prossimo cellulare imaging ad alta risoluzione, e mentre saranno sempre necessari approcci migliori, i principi qui presentati, così come gli esempi di quale approccio è stato adottato per diversi tipi di dati , fornirà alcune informazioni utili per prendere una decisione su quale approccio adottare.

Tradizionalmente, la microscopia elettronica di campo (EM) è stato suddiviso in 1) il ramo della biologia strutturale con alta e super-alta risoluzione TEM, in genere combinati con i dati impliciti o espliciti media per indagare il tridimensionale (3D) struttura dei complessi macromolecolari con una composizione definita e in genere una dimensione relativamente piccola 1-4, e 2) il ramo di imaging cellulare in cui interi scenari cellulari sono visualizzati 1,5,6. Mentre il ramo della biologia strutturale ha subito uno sviluppo spettacolare nel corso degli ultimi quattro decenni, il ramo biologia cellulare è stato in gran parte limitato a due dimensioni, spesso su campioni di meno-che-ottimale conservate. Solo con l&#39;avvento della tomografia elettronica negli ultimi dieci anni ha cellula biologica immagini ultrastrutturali ampliato nella terza dimensione 5,7, dove in genere la media non può essere eseguita come gli scenari cellulari, e quindi le caratteristiche di interesse, sono in genere unico. Anche se le scene cellulari visualizzati sono spesso mozzafiato per l&#39;occhio, estrazione efficiente delle caratteristiche di interesse e la successiva analisi quantitativa di tali volumi cellulari molto complessi in ritardo, in parte perché la precisa composizione proteica è generalmente sconosciuta, rendendo quindi difficile interpretare questi cellulare volumi 3D. A questa data, vasta esperienza biologico è spesso necessario per interpretare tomogrammi complesse, o anche per identificare le regioni importanti e componenti essenziali del volume 3D. Come ulteriore complicazione, la visualizzazione di volumi 3D è decisamente non banale. Volumi 3D possono essere pensati e quindi visualizzati come pile di immagini 2D. Ispezione Slice-by-fetta di immagini 2D sequenziali riduce la complessità, ma anche i limiti dispongono di estrazione e l&#39;analisi quantitativa quindi alle due dimensioni. Tuttavia, per la maggior parte degli oggetti 3D, la rappresentazione di volumi 3D come una semplice pila di piani consecutivi porta ad una incompleta und prospettiva distorta nella natura 3D di un particolare sistema. Modi alternativi di ispezione visiva richiedono sia resa volume o il rendering di superficie, che, data la natura spesso denso di un cellulare volume-può facilmente portare a una vista ostruita di oggetti nidificati o sopraffare un utente del tutto, rendendo così la segmentazione manuale interattivo difficile. Per ovviare a questi ostacoli, una grande varietà di estrazione automatizzata funzione (segmentazione) approcci sono stati sviluppati che sono in genere o densimetri o 8-10 a base gradiente. Tuttavia, questi metodi tendono a segmentare l&#39;intero volume indipendentemente da quali aree o funzioni sono di interesse per l&#39;esperto, anche se alcuni metodi recenti possono indirizzare una caratteristica specifica di interesse come filamenti di actina 11. Inoltre, i programmi in esecuzione segmentazione automatica possono talvolta comportare la produzione di un gran numero di sotto-volumi (ad esempio, quando si applica immersio bacinon segmentazione), che spesso hanno bisogno di essere uniti manualmente nuovamente dentro comprendente l&#39;intera funzione di interesse o essere sottoposti ad un&#39;ulteriore segmentazione. Questo vale in particolare per i set di dati complessi e affollati, quindi algoritmi informatici più di rendering non sono in grado di estrarre solo le caratteristiche di interesse con fedeltà, e gli sforzi curation sostanziali da parte di un esperto sono spesso necessari per produrre un volume segmentato desiderato. Inoltre, soluzioni personalizzate ad un problema molto specifico sono spesso pubblicati come una carta incontro scientifico, con poca o nessuna enfasi sulla rendendoli ampio e strumenti completi accessibili ai ricercatori che non hanno una profonda conoscenza dei settori della matematica, informatica e / o computer grafica. Un ambiente software di programmazione personalizzabile, contenente una serie di librerie di analisi dell&#39;immagine, può essere un insieme potente strumento che permette agli utenti di scrivere in modo efficiente i propri moduli per la segmentazione accurata. Tuttavia, questo approccio richiede extformazione ensive e un background in informatica, al fine di sfruttare le sue numerose caratteristiche o funzionalità per l&#39;analisi delle immagini. Si può lavorare in un tale ambiente software versatile per determinati insiemi di dati in cui le caratteristiche sono più radi, per esempio, utilizzando potenti approcci shape-based che si basano sulla geometria unica di &quot;modelli&quot; per separare gli oggetti di interesse dai loro dintorni 12,13 . Una fiera varietà di pacchetti di visualizzazione grafica computerizzata esiste per la segmentazione manuale interattivo e costruzione del modello. Alcuni pacchetti sono disponibili in commercio, mentre altri sono di origine accademica e distribuite gratuitamente, come ad esempio: University of California San Francisco Chimera 14, University of Colorado IMOD 15, e la University of Texas di Austin VolumeRover 16. Tuttavia, l&#39;ampia gamma e la complessità di caratteristiche e funzionalità di questi programmi possiedono più ripido la curva di apprendimento per EAch. Alcuni programmi di visualizzazione forniscono semplici modelli geometrici, come le palline e bastoni di varie dimensioni, che possono essere inseriti nelle mappe di densità al fine di creare un modello semplificato del volume 3D complesso. Questi modelli permettono quindi semplici misure geometriche e volumetriche e quindi vanno al di là solo la &quot;bella immagine&quot;. Tale tracciamento manuale di oggetti funziona bene per i volumi di cui solo un piccolo numero di oggetti devono essere rintracciati ed estratto. Tuttavia, il recente sviluppo di grandi volumi di immagini ultrastrutturali 3D utilizzando un fascio ionico focalizzato microscopia elettronica a scansione (FIB-SEM) 17-20 o il blocco seriale microscopia elettronica a scansione faccia (SBF-SEM) 21 presenta la complicazione aggiuntiva che la dimensione dei dati 3D set possono variare da gigabyte a decine e centinaia di gigabyte, e anche i terabyte. Di conseguenza, tali grandi volumi 3D sono praticamente inaccessibili per estrazione di feature manuale, e quindi efficiente semi-automatica impresa user-guidataestrazione ure sarà uno dei colli di bottiglia per l&#39;analisi efficiente dei volumi 3D nel prossimo futuro. Presentato qui sono quattro diversi approcci di segmentazione che vengono abitualmente utilizzati in una vasta gamma di tipi di immagine biologici. Questi metodi sono poi confrontati per la loro efficacia per diversi tipi di set di dati, consentendo una compilation in una guida per aiutare i biologi a decidere quello che potrebbe essere il miglior approccio di segmentazione per l&#39;estrazione caratteristica efficace dei propri dati. Come manuali d&#39;uso dettagliate sono disponibili per la maggior parte dei programmi descritti, l&#39;obiettivo non è quello di rendere i potenziali utenti di familiarizzare con uno qualsiasi di questi particolari pacchetti. Invece, l&#39;obiettivo è quello di dimostrare i rispettivi punti di forza ei limiti di queste diverse strategie di segmentazione applicandole ai set di dati di esempio sei con caratteristiche differenti. Attraverso questo confronto, una serie di criteri sono stati sviluppati che si basano sia sulle caratteristiche dell&#39;immagine oggettive delSet di dati 3D, come il contrasto dei dati, freschezza, affollamento, e la complessità, o derivano da considerazioni soggettive, come ad esempio l&#39;obiettivo desiderato per la segmentazione, morfologie delle caratteristiche per essere segmentati, densità di popolazione delle caratteristiche di interesse, ovvero la frazione di il volume occupato dalla funzione di interesse, e di come si procede in modo ottimale con risorse limitate come il tempo e la disponibilità del personale. Questi diversi set di dati di esempio illustrano come questi criteri oggettivi e soggettivi possono essere applicati sequenzialmente in una varietà di combinazioni per produrre un abbinamento di alcuni approcci di estrazione caratteristica con alcuni tipi di set di dati. Le raccomandazioni fornite, si spera, aiuterà i novizi di fronte ad una grande varietà di opzioni di segmentazione scegliere il metodo di segmentazione più efficace per il proprio volume 3D. Mentre l&#39;attenzione di questo articolo è estrazione di caratteristiche, l&#39;attenzione alla raccolta dei dati e dei dati di pre-trattamento è fondamentale per s efficientiegmentation. Spesso la colorazione dei campioni può essere irregolare, e quindi, potenziali artefatti di colorazione deve essere considerato nella procedura di segmentazione. Tuttavia, macchia di solito dà più elevato rapporto segnale-rumore, e quindi richiede meno di filtraggio e di altro trattamento matematico dei volumi cellulari, che potrebbero risultare anche in manufatti. I rispettivi set di dati di immagini grezzi devono essere acquisite con le impostazioni di contrasto e la macchina fotografica dei pixel corretti, allineati, e ricostruito in un volume 3D. Per le tomografie, immagini allineate vengono ricostruite in genere utilizzando ponderato retroproiezione, e quindi il set di dati è di solito sottoposti ad algoritmi di denoising come anisotropo diffusione non lineare 22, filtraggio bilaterale 23, o mediana ricorsiva filtraggio 24. Dati di imaging FIB-SEM e SBF-SEM sono allineati da fette consecutivi incrociati-correlazione in XY programmi che utilizzano, come ImageJ 25. Miglioramento del contrasto e filtraggio possono essere applicati per aumentare le caratteristiche diinteresse e quindi de-rumore la pila di immagini. Il filtraggio può essere eseguita sia su tutto il volume prima di volume secondario di selezione o sui subvolumes selezionati, come gli approcci di filtraggio possono essere computazionalmente costoso. Down-campionamento dei dati (binning), che è talvolta usato per ridurre il rumore e / o riduzione delle dimensioni del file, è consigliato solo se i dati sono stati significativamente sovracampionato rispetto alla risoluzione anticipata. Dopo la riduzione del rumore, le immagini elaborate possono essere segmentati con vari metodi, e la messa a fuoco in questo studio è sui seguenti quattro: (1) il manuale generazione del modello astratto attraverso la creazione di un modello di palla-e-bastone, (2) tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse, (3) la densità automatizzato basato su soglie, e (4) la segmentazione automatica su misura tramite uno script per il progetto di segmentazione specifica. Segmentazione Boundary 8 e coinvolgente segmentazione spartiacque 10 sono alternative migliori a soglia semplice, ma they appartengono nella stessa categoria e non sono stati inclusi esplicitamente in questa discussione. Tracciamento manuale di densità richiede delineare le caratteristiche di interesse, affettare-by-slice, che permette il mantenimento della densità originale rispettive aree sub-cellulare. Questo approccio permette un controllo massimo del processo di segmentazione, ma è un processo noioso e laborioso. Approcci di segmentazione densità (e correlati) basato su soglie automatiche sono semi-automatico, in cui un algoritmo sceglie pixel basato su una serie di parametri definiti dall&#39;utente. Diversi accademici (gratuito) pacchetti di visualizzazione, come UCSF Chimera, MDI, Fiji 26, e VolumeRover sono disponibili, oltre che commerciale (che richiede licenze a pagamento) pacchetti, ed entrambi i tipi di solito includono uno o più di questi approcci di segmentazione. I pacchetti software utilizzati in questo lavoro per illustrare questi diversi metodi includono sia programmi commerciali e accademici s aperteOurce programmi per generare manualmente un modello astratto, così come la segmentazione manuale e automatica della densità. Tuttavia, il software open source può talvolta offrire opzioni più avanzate, attraverso la possibilità di personalizzazione. Un confronto di queste tecniche utilizzano differenti tipi di set di dati ha portato alla seguente presentazione di regole e linee guida su come affrontare la segmentazione dei diversi volumi di dati biologici in 3D, che a nostra conoscenza non è ancora stata pubblicata. Quindi, questo è il primo confronto sistematico dei diversi approcci e la loro utilità su insiemi di dati con diverse caratteristiche per gli utenti con finalità diverse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Material Name</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Amira</td>
			<td style="width:151px;">FEI Visualization Sciences Group</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:99px;">Chimera</td>
			<td style="width:151px;">UCSF</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;"><a name="RANGE!A4">Fiji/ImageJ</a></td>
			<td style="width:151px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:99px;">IMOD</td>
			<td style="width:151px;">Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:99px;">Photoshop</td>
			<td style="width:151px;">Adobe</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.adobe.com/products/%20photoshopfamily.html">http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">MATLAB</td>
			<td style="width:151px;">MathWorks</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.mathworks.com/">http://www.mathworks.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">VLFeat</td>
			<td>VLFeat</td>
			<td></td>
			<td>http://www.vlfeat.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from voxels to knowledge: a practical guide to the segmentation of complex electron microscopy 3d-data

Approcci di microscopia elettronica 3D moderni hanno recentemente permesso visione senza precedenti dell&#39;organizzazione ultrastrutturale 3D di cellule e tessuti, permettendo la visualizzazione di grandi macchine macromolecolari, come i complessi di adesione, così come le strutture di ordine superiore, come il citoscheletro e organuli cellulari nel loro rispettiva cella e il contesto dei tessuti. Data la complessità intrinseca dei volumi cellulari, è essenziale per estrarre prima le caratteristiche di interesse al fine di permettere la visualizzazione, quantificazione, e quindi la comprensione della loro organizzazione 3D. Ogni set di dati è definito da caratteristiche distinte, ad esempio, segnale-rumore, nitidezza (nitidezza) dei dati, l&#39;eterogeneità delle sue caratteristiche, affollamento di funzioni, presenza o assenza di forme caratteristiche che permettono una facile identificazione, e la percentuale dell&#39;intero volume che una specifica regione di interesse occupa. Tutte queste caratteristiche devono essere consideratial momento di decidere su quale approccio adottare per la segmentazione. I sei differenti set di dati ultrastrutturali 3D presentati sono stati ottenuti da tre immagini differenti approcci: resina incastonato tomografia elettronica macchiato, focalizzato di ioni di tipo beam e il blocco di serie a scansione faccia- microscopia elettronica (FIB-SEM, SBF-SEM) dei campioni leggermente macchiato e fortemente colorate rispettivamente. Per questi insiemi di dati, sono stati applicati quattro diversi approcci di segmentazione: (1) completamente manuale edificio modello seguito esclusivamente dalla visualizzazione del modello, (2) segmentazione tracciamento manuale dei dati seguita da il rendering di superficie, (3) approcci semi-automatizzato seguito mediante fusione di superficie, o algoritmi di segmentazione progettati su misura (4) automatizzati seguiti da resa di superficie e analisi quantitativa. A seconda della combinazione di caratteristiche di set di dati, si è constatato che in genere uno di questi quattro approcci categoriali supera gli altri, ma a seconda della esatta sequenza di criteri, more di un approccio può avere successo. Sulla base di questi dati, vi proponiamo uno schema di triage che categorizza entrambe le caratteristiche dei set di dati oggettivi e criteri personali soggettivi per l&#39;analisi dei diversi set di dati.

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From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Il collo di bottiglia per cellulare microscopia elettronica 3D è estrazione di caratteristiche (segmentazione) in mappe di densità 3D altamente complessi. Abbiamo sviluppato una serie di criteri, che fornisce indicazioni su quale approccio di segmentazione (manuale, semi-automatico o automatico) è più adatto per diversi tipi di dati, fornendo così un punto di partenza per la segmentazione efficace.

Da Voxels alla Conoscenza: Una guida pratica per la segmentazione del Complesso microscopia elettronica 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K Views.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  Il collo di bottiglia per cellulare microscopia elettronica 3D è estrazione di caratteristiche (segmentazione) in mappe di densità 3D altamente complessi. Abbiamo sviluppato una serie di criteri, che fornisce indicazioni su quale approccio di segmentazione (manuale, semi-automatico o automatico) è più adatto per diversi tipi di dati, fornendo così un punto di partenza per la segmentazione efficace. 

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Stage Light fabbricazione microscopia per Luce correlate / Microscopia Elettronica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescenza tempra di un vicino infrarosso Fluoroforo incapsulata all&#39;interno di liposomi come strumento per<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Una guida per Strutturato illuminazione TIRF Microscopia a alta velocità con colori multipli

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Microscopia a luce correlativa (CLEM) per il monitoraggio e la proteina virale di Imaging strutture in cellule di Cryo-immobilizzata associate

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Analisi dell'espressione genica di cellule endoteliali esposte per Shear Stress utilizzando più flusso parallelo-piastra Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Una guida per costruire un altamente propenso spazzato Tile microscopio per l'esteso campo di vista singola molecola Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...