La tomografia a raggi X Cryo Soft può fornire preziose informazioni quantitative a livello cellulare che possono essere utilizzate come standalone o in combinazione con altre tecniche di imaging. Immagine del sensore in uno stato idratato congelato che sono necessari per la colorazione o il sezionamento. Inoltre, è una tecnica ad alto rendimento, perché ogni tomogramma viene raccolto in pochi minuti.
La criotomografia a raggi X molli offre una piattaforma perfetta per seguire il processo di ripristino cellulare in cellule infette o difettose a livello di singola cellula. Questa tecnica può riportare l'efficacia di nuovi farmaci antivirali o di terapia genica per invertire l'infezione dei fenotipi redatti. Per caricare i campioni nel microscopio a raggi X a trasmissione, raffreddare la camera di trasferimento con azoto liquido fino a raggiungere meno di 100 Kelvin.
Riempire la postazione di lavoro con azoto liquido aggiuntivo e accendere il riscaldatore del bordo della workstation. Quando il bordo della workstation smette di bollire, posizionare la scatola criogenica contenente le griglie nelle posizioni appropriate della stazione di lavoro in condizioni criologiche e caricare le griglie sui portacampioni precedentemente raffreddati. Caricare i supporti sulla navetta e proteggerli con le coperture.
Caricare la navetta nella camera di trasferimento a meno di 100 Kelvin e pompare la camera fino a basso vuoto. Collegare la camera di trasferimento al microscopio e seguire la procedura del vuoto sullo schermo per caricare la navetta della camera di trasferimento nel microscopio. Una volta che la navetta è nel microscopio con i campioni, utilizzare il braccio robotico del microscopio per trasferire un supporto del campione allo stadio del campione.
Per l'imaging a campo luminoso della griglia con il microscopio a luce visibile online, selezionare la fotocamera del microscopio a luce visibile e attivare la sorgente LED del microscopio a luce visibile per l'imaging a campo luminoso. Fare clic su Movimento, Controllo, Campione e Theta campione per ruotare il campione a meno 60 gradi in modo che sia rivolto verso l'obiettivo del microscopio a luce visibile, quindi selezionare Controllo movimento e Campione e modificare il campione X e il campione Y per spostare il campione nelle posizioni centrate previste. Selezionare Microscopio, Acquisizione, Impostazioni di acquisizione, Modalità di acquisizione, Continuo e Start e fare clic su Motion Control e Sample per selezionare il campione Z per perfezionare la messa a fuoco con passaggi più piccoli fino a cinque micron fino a quando le celle e/o i fori della pellicola di supporto del carbonio sono a fuoco.
Quindi selezionare Microscopio, Acquisizione, Impostazioni acquisizione, Modalità di acquisizione, Mosaico e Avvia per avviare l'acquisizione di una mappa a mosaico completa della griglia in modalità campo luminoso utilizzando i valori predefiniti per il mosaico. Per l'imaging a mosaico in modalità fluorescenza, spegnere la sorgente LED del microscopio a luce visibile per l'imaging a campo luminoso e selezionare manualmente la sorgente luminosa a LED corrispondente alla lunghezza d'onda di eccitazione desiderata e il filtro ottico corrispondente sulla configurazione. Selezionare Microscopio, Acquisizione, Impostazioni di acquisizione, Modalità di acquisizione, Continuo e Avvia, quindi fare clic su Controllo movimento e campione per selezionare il campione Z per perfezionare lo stato attivo sull'immagine a fluorescenza.
Quindi, fare clic su Microscopio, Acquisizione, Impostazioni di acquisizione, Modalità di acquisizione, Mosaico e Inizia per acquisire una mappa a mosaico che mantenga i parametri posizionali X e Y del mosaico a campo luminoso. Quindi, spegnere la sorgente luminosa a LED. Per l'acquisizione del mosaico a raggi X, modificare la fessura di uscita a cinque micron e utilizzare un'esposizione di un secondo a MISTRAL.
Selezionare Microscopio, Acquisizione, Impostazioni acquisizione, Impostazioni fotocamera e Binning per regolare la messa a fuoco utilizzando la traduzione Z del campione. Selezionare Motion Control e Sample per selezionare il campione Z.Iniziando in passi di cinque micron, perfezionare la messa a fuoco fino a passi di 0,5 micron fino a quando la cella o i fori della lamina di carbonio sono ben a fuoco. Per acquisire una mappa a mosaico del quadrato mesh, fare clic su Microscopio, Acquisizione, Impostazioni acquisizione, Modalità acquisizione, Mosaico e Avvia.
Una volta acquisita la mappa, fare clic su Motion Control e Sample e modificare il campione X e il campione Y per spostare il campione in una posizione di campo piatto. Impostare il tempo di esposizione a un secondo a MISTRAL. Quindi, normalizzare il mosaico acquisito dall'immagine a campo piatto per ottenere la trasmissione e salvare il mosaico normalizzato.
Per allineare il campione sull'asse di rotazione con la rotazione a zero gradi, selezionate Controllo movimento (Motion Control) e Campione (Sample) e modificate il campione X, il campione Y e il campione Z per concentrarvi sulla feature della cella da inserire sull'asse di rotazione. Per ruotare il campione in una posizione theta positiva, selezionare Motion Control e Sample e modificare sample theta in theta positivo. Utilizzate lo strumento linea per disegnare una linea sulla feature della cella da inserire sull'asse di rotazione.
Per ruotare il campione in una posizione theta negativa, selezionare Motion Control e Sample e modificare il theta del campione in theta negativo. Utilizzate lo strumento linea per disegnare una linea sulla feature della cella da inserire sull'asse di rotazione. In posizione theta positiva o negativa, utilizzate la traslazione Z del campione per spostare la feature selezionata nella posizione centrale tra entrambe le linee e ripetete la rotazione del campione fino a ottenere una distanza minima linea-linea.
Quando il theta campione è uguale a zero, spostate il campione X due volte la distanza necessaria per posizionare la feature selezionata al centro del campo visivo e spostate la piastra di zona X per riportare la feature al centro del campo visivo. Per ottimizzare nuovamente la posizione Z della piastra di zona rispetto al nuovo asse di rotazione, selezionare Microscopio, Acquisizione, Impostazioni di acquisizione, Modalità di acquisizione e Serie focale e fare clic su Avvia per registrare una serie focale Z della piastra di zona. Quindi, fate clic su Controllo movimento (Motion Control) e Piastra zona (Zone Plate) e selezionate la piastra di zona Z per spostare la piastra di zona Z nella posizione in cui il campione è a fuoco.
Per acquisire un tomogramma, fate clic su Controllo movimento (Motion Control) e Campione (Sample) e selezionate Campione theta (Sample theta) per spostare l'angolo massimo negativo su più 0,1. Fare clic su Microscopio, Acquisizione, Impostazioni di acquisizione, Modalità di acquisizione e Tomografia per impostare il numero di immagini come numero totale di angoli, tenendo conto dell'immagine ad angolo zero e dell'intervallo angolare e impostare il numero di immagini. Selezionare Angolo Inizio e Fine angolo, fare clic su Microscopio, Acquisizione, Impostazioni acquisizione, Impostazioni fotocamera e impostare il tempo di esposizione.
Fare clic su Avvia per avviare l'acquisizione della serie di inclinazione della tomografia. Il campione ideale dovrebbe avere singole celle al centro di una maglia quadrata incastonate in un sottile strato di ghiaccio e circondate da marcatori fiduciali d'oro ben dispersi. Molti organelli diversi, come mitocondri, reticoli endoplasmatici, vacuoli e nucleo dovrebbero poter essere distinti nel tomogramma finale ricostruito, grazie alla ricostruzione quantitativa dei coefficienti di assorbimento lineare.
In questa immagine, si può osservare un quadrato con una maggiore densità cellulare. In questo esempio, il blotting era meno efficiente, portando a uno strato di ghiaccio più spesso con crepe. Anche se alcune strutture più grandi possono essere riconosciute in questa preparazione, i dettagli fini sono stati persi all'interno del rumore e della consistenza granulosa a causa della scarsa qualità di vetrificazione del ghiaccio spesso.
Il campione crioconservato deve essere minimamente maneggiato, poiché la maggior parte degli artefatti viene indotta quando i campioni si trovano in questa fase. Di solito, la fotomicroscopia a luce crio-visibile correlativa, si utilizza una tomografia precedente al substrato criogenico. Inoltre, la microscopia spettrale può essere eseguita su elementi chimici rilevanti.
Questo protocollo riempie una nicchia operando in un modello e in un regime di risoluzione, che non sono facilmente accessibili da nessun'altra tecnica di imaging diretto, consentendo pochi micron e una risoluzione a mezzo passo di 30 nanometri.
