This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

1 Determinazione di un valore approssimativo per la costante di dissociazione (cioè, entro un ordine di grandezza) <ol><li> Preparare l&#39;impasto indicato nella tabella 1. </li><li> Preparare scorte del ligando di interesse a più alta concentrazione disponibile, e poi a sei dieci diluizioni al raddoppio del presente. Qualora un approssimativo K d è noto dai dati precedenti, puntare ad avere almeno due concentrazioni al di sopra e al di sotto del K d. </li><li> Aliquota 18 ml della miscela in otto pozzetti in un piatto qPCR. Aggiungere 2 ml di solvente per il primo pozzo. Aggiungere 2 ml di ciascun membro della serie di diluizioni ligando (punto 1.2) per un bene ciascuno dei rimanenti sette pozzi. </li><li> Posizionare una guarnizione qPCR sopra la piastra. Per ottenere una buona tenuta della piastra, posizionare un applicatore mano (vedi tabelle di reagenti specifici) al centro della piastra. Smooth premuto il sigillo di lato e ripetere sull&#39;altra metà dila piastra. </li><li> Centrifugare la piastra a 500 xg per due minuti per rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Porre la piastra in uno strumento StepOne qPCR. Selezionare l&#39;opzione &quot;curva Melt&quot;, i filtri ROX, e scegliere la velocità di rampa veloce (questo fornisce una pausa di 2 min a 25 ° C, seguita da una rampa a 99 ° C oltre 40 minuti, e poi 2 minuti di pausa). Eseguire un denaturazione termica. NOTA: I file di script per l&#39;esecuzione di una corsa sono disponibili online all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Al termine della corsa dello strumento, fare clic sul pulsante &quot;Analizza&quot; sullo schermo. Salvare il file risultato. </li><li> Aprire il software Protein Maiusc termica. <ol><li> Creare un nuovo studio; nella scheda delle proprietà, dare a questo un nome, e nella scheda Condizioni, dettaglio i ligandi. </li><li> Passare alla scheda File Experiment, e importare il file salvato risultati (XXX.eds), e impostare il contenuto di ogni pozzetto (template files sono disponibili presso gli autori). </li><li> Passare alla scheda Analisi, e premere il pulsante &quot;Analizza&quot;. NOTA: Questo analizzerà i risultati. E &#39;possibile esportare i risultati di ulteriori indagini con Excel utilizzando la scheda Esporta. I risultati vengono esportati in un formato scheda delineata. E &#39;meglio aprire il file esportato in Excel, e immediatamente salvare in formato Excel. </li></ol></li><li> Verificare che la proteina in presenza del solo solvente dà un risultato simile a quello mostrato nella Figura 1A. Avanti, esaminare le temperature di fusione osservate nei risultati nel riquadro &quot;replicare&quot;. Assicurarsi che questa mostra un chiaro aumento della temperatura di fusione con l&#39;aumento della concentrazione di ligando. NOTA: Idealmente, questo fornirà un chiaro temperatura massima di fusione (supponendo che la proteina è completamente ligando legato), e un approssimativo K d dove la temperatura di fusione è a metà strada tra la proteina-ligando libero eil massimo. </li></ol> 2 set-up sperimentale per la determinazione della costante di dissociazione <ol><li> Preparare l&#39;impasto indicato nella tabella 2 come master mix. </li><li> Preparare le scorte di legante a quindici diverse concentrazioni, che saranno diluiti dieci volte l&#39;esperimento finale. Idealmente, includere le concentrazioni di almeno due ordini di grandezza al di sopra e al di sotto della stima K d, e centrare le concentrazioni sul stimata K d. Focus su sette dei punti all&#39;interno di un ordine di grandezza della stima K d, con altri quattro punti su entrambi i lati di questo; se vi è una scelta, includere più punti a valori che stanno saturando. NOTA: Se necessario, è possibile modificare le condizioni sperimentali in modo tale che le scorte ligando sono al doppio della concentrazione sperimentale, dove ligando solubilità è limitante. </li><li> Aggiungere 120 ml di mastermescolare a otto pozzetti in una piastra ben fondo a U 96, a fungere da serbatoio per una comoda erogazione del master mix. Utilizzare una pipetta a 8 canali per erogare 18 microlitri in una colonna di una piastra PCR. Ripetere per altri cinque colonne, per un totale di 48 pozzetti riempiti in un modello 6 x 8 sulla piastra. </li><li> Aggiungere 20 ml di stock ligando, o il solvente, pozzetti in una piastra ben U-fondo 96. Usando una pipetta a 8 canali, aspirare 2 ml di otto diversi stock ligando (o solvente). Aggiungi questi per una colonna della piastra PCR che era pieno di master mix al passo 2.3. Ripetere con gli stessi otto ligando / scorte solvente per due ulteriori colonne. Aspirare 2 ml di restanti otto titoli leganti o solventi, e aggiungere questi per una quarta colonna nel piatto. Ripetere questa operazione per altre due colonne. Questo darà campioni in triplicato per tutti i 16 campioni di legante e solvente. </li><li> Inserite un sigillo qPCR sopra la piastra (vedi passo 1.4). </li><li> Centrifugare la piastra a 500 xg perdue min. </li><li> Posizionare la piastra nello strumento qPCR. Eseguire una denaturazione termica utilizzando i parametri specificati al punto 1.6. </li><li> Al termine della corsa dello strumento, fare clic sul pulsante &quot;Analizza&quot; sullo schermo. Salvare il file risultato. </li><li> Aprire il software Protein Maiusc termica. Creare un nuovo studio; nella scheda delle proprietà, dare a questo un nome, e nella scheda Condizioni, dettaglio i ligandi. </li><li> Passare alla scheda File Experiment, e importare il file salvato risultati (XXX.eds), e impostare il contenuto di ciascun pozzetto. NOTA: file di modello sono disponibili online all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Passare alla scheda Analisi, e premere il pulsante &quot;Analizza&quot;. <ol><li> Selezionare la scheda &quot;replicati&quot; dal menu sul lato sinistro dello schermo per mostrare i risultati come triplica. Valutare l&#39;affidabilità dei dati in base a come sono stretti i triplica. Should i triplicato mostrano scarsa riproducibilità, esaminare i dati grezzi da vicino. </li><li> Analizzare i dati utilizzando sia il Boltzmann o metodi derivati ​​per valutare la temperatura di fusione. Selezionare la scheda &quot;Replicare risultati&quot;, e nella &quot;Replica risultati complotto&quot;, spostare il &quot;complotto:&quot; tasto tra &quot;Tm - Boltzmann&quot; e &quot;Tm - Derivata&quot;. Selezionare il metodo che conferisce maggiore riproducibilità per il campione. Esportare i risultati di ulteriori indagini con Excel utilizzando la scheda Esporta. NOTA: Per i campioni che mostrano molteplici transizioni, è quasi sempre meglio usare il metodo Derivata in modalità multipla fusione. I risultati vengono esportati in un formato scheda delineata. E &#39;meglio aprire il file esportato in Excel, e immediatamente salvare in formato Excel. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno due volte, tra cui una ripetizione in un giorno separato, al fine di garantire la riproducibilità dei risultati. In caso di analisi dei dati (vedere il punto 3 di seguito)indicano che il valore di K d è significativamente diverso alla stima originale, alterare le concentrazioni di ligando di conseguenza (vedi punto 2.2) per garantire una buona gamma di valori intorno K d. </li></ol> 3 Analisi dei dati per determinare la costante di dissociazione sotto denaturazione termica <ol><li> Creare una tabella in Excel delle concentrazioni di ligando e la temperatura di fusione. </li><li> Aprire il software GraphPad Prism, e creare una tabella XY. Inserire i dati, utilizzando la colonna X per le concentrazioni di ligando e la colonna Y per la fusione risultati di temperatura. NOTA: un esempio è mostrato Figura 1B. Uno script con equazioni precaricati, e le istruzioni alternative per l&#39;utilizzo del pacchetto statistico SPSS, è disponibile online all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Nella scheda Analisi, selezionare l&#39;opzione per cambiare il parametro di analisis (Ctrl + T). Per inserire il modello corretto, selezionare &quot;Nuovo&quot; e &quot;Crea nuova equazione&quot;. Inserire l&#39;equazione indicato nella Tabella 3 come &quot;legame unico sito ligando&quot;. NOTA: Un esempio di questi passi è mostrato in Figura 1C. Quando si utilizza lo script con le equazioni precaricati, l&#39;equazione in questione può essere diretto scelti dalla lista piuttosto che inseriti. Derivazione di questa equazione è riportato in appendice. </li><li> Selezionare il &quot;Regolamento per i valori iniziali&quot; casella e inserire le regole per i valori iniziali come indicato nella tabella 3. </li><li> Vincolare il parametro P, come &quot;costante uguale a&quot; e inserire la concentrazione finale di proteine ​​(nelle stesse unità come il legante è dato in). </li><li> Selezionare OK per eseguire l&#39;analisi. NOTA: Un esempio di questi passi è mostrato in Figura 1D. Il software grafica produce una figura che mostra i dati e l&#39;adattamento al modello. Esempi di tanalisi hese sono riportati nei dati rappresentativi. </li></ol> 4. Montaggio dati a modelli cooperativi Per inserire i dati di un modello cooperativo, scegliere tra una un semplice modello cooperativo, o un modello in cui sono definite due costanti di dissociazione separati. Il primo approccio è preferito nel caso di cooperatività negativa, o come un primo esame. Tuttavia, in linea di principio è meglio in caso di cooperatività positiva per modellare due diverse costanti di dissociazione 18. In questo caso, la modellazione può procedere assumendo o sequenziale legame di ligandi, o un legame indipendente di leganti. <ol><li> Seguire gli stessi passi iniziali come nel protocollo 3 Tuttavia, al punto 3.3, inserire una delle equazioni nella tabella 3 elencata come &quot;Simple modello cooperativo&quot;, &quot;sequenziale vincolante di due ligandi&quot;, o &quot;Independent legame di due ligandi&quot; 18. </li><li> Selezionare le regole per i valori inizialiassociato a ciascuna di queste equazioni nella tabella 3. </li><li> Esaminare l&#39;adattamento del modello ai dati. Qualora i dati adattarsi male, prendere in considerazione un altro modello. NOTA: è anche importante esaminare con attenzione il montaggio della temperatura di fusione di dati da parte del software Maiusc termica Protein (passo 2,9): a volte è necessario modificare i parametri qui per ottenere i migliori risultati. Un&#39;altra considerazione è se la gamma di punti dati è l&#39;ideale, e se ci sono punti anomali: o una serie limitata di dati su entrambi i lati di K d, o un unico punto anomalo (specialmente alle più alte concentrazioni di ligando), può influenzare in modo significativo i risultati. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno due volte (vedi punto 2.12) per garantire la riproducibilità. </li></ol> 5. Montaggio dei dati per le curve che indicano Spostamenti binari in fusione Temperatura Di tanto in tanto, piuttosto che una risposta graduata a ligando, le proteine ​​sono stateosservato adottare una risposta binaria, dove campione legata sia chiaramente separata dalle campione non legato. Un esempio è fornito nei risultati rappresentativi (Figura 4). In questo caso, il montaggio delle temperature di fusione non fornirà una buona misura per K d. <ol><li> Esportare l&#39;output di dati grezzi dal Proteine ​​software Maiusc termica. Per ogni punto di temperatura, calcolare la fluorescenza media per il ligando zero e alte concentrazioni di ligando. Tabulare i risultati di ciascun punto dati accanto a questi. NOTA: L&#39;errore creato qui è inferiore errore nelle temperature di fusione a muro. </li><li> Aprire il pacchetto statistico SPSS. Copiare le temperature, le due serie di dati medi, e dati per ogni esperimento di una finestra di dati in SPSS. Nella scheda variabile, impostare il set di dati media per nessun ligando come &quot;Low&quot;, e il set di dati media per la più alta concentrazione di ligando come &quot;alto&quot;. </li><li> Scaricare il file di sintassi disponibileonline all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Selezionare &quot;Esegui → Esegui tutti&quot;. </li><li> Copiare la proporzione risultati legati ad una nuova cartella di lavoro di Excel, con le relative concentrazioni di ligando. </li><li> Aprire il software GraphPad, e creare una tabella XY. Inserire i dati, utilizzando la colonna X per le concentrazioni di ligando e la colonna Y per la fusione risultati di temperatura. Nella scheda di analisi, selezionare &quot;Parametri cambiamento di analisi&quot;. Per inserire il modello corretto, selezionare &quot;Nuovo&quot; e &quot;Crea nuova equazione&quot;. Inserire l&#39;equazione data nella tabella 3, indicato come &quot;Analisi degli spostamenti binari a temperatura di fusione&quot;. </li><li> Selezionare la casella &quot;Norme per valori iniziali&quot;, e inserire le regole per i valori iniziali specificati nella tabella 3. Vincolare il parametro P, come &quot;costante uguale a&quot; e inserire la concentrazione finale di proteine ​​(nelle stesse unità della ligand è dato in). NOTA: esempi di completare queste scatole per il protocollo nella sezione 3 sono mostrati in figura 1C, D. </li><li> Se c&#39;è una buona misura, i risultati possono essere migliorati estrapolando al risultato atteso a una concentrazione del ligando infinita. Dal modello della percentuale legata a ciascuna concentrazione ligando, esaminare il valore per il valore più alto di concentrazione di ligando. Se questa è la 0.99 o superiore, ulteriori analisi è improbabile per migliorare i risultati. </li><li> Se la proporzione è minore di 0,99, un passaggio aggiuntivo è richiesto per correggere gli effetti della proteina non legata nel più alto campione concentrazione del ligando. Al punto 5.2, scrivere la percentuale di legante legato al più alto punto di concentrazione del ligando (dal punto 5.7) nella cella R2 (una cella diversa può essere utilizzato, e R2 sostituito opportunamente nell&#39;equazione nella tabella 3). Creare una colonna supplementare dopo la media dei risultati più alti di concentrazione ligando. Negli abeticellule T, copiare l&#39;equazione elencati nella Tabella 3 come &quot;estrapolazione all&#39;infinito concentrazione di ligando&quot;. Copia questa formula per le celle rimanenti in questa colonna. NOTA: Questo calcolo elimina l&#39;effetto della proteina non legata a più alta concentrazione di ligando. La differenza tra la proteina ligando libero e la più alta concentrazione ligando viene moltiplicato per il reciproco della proporzione vincolato alla massima concentrazione ligando per fornire la differenza attesa tra stati proteiche completamente legati e non legati ad ogni punto di temperatura. Questa differenza viene aggiunto o sottratto dallo stato non legato per dare la fluorescenza previsto per la proteina legante completamente legata. </li><li> Sostituire la colonna di concentrazione massima ligando nella scheda tecnica SPSS con questa nuova rubrica, e ripetere il raccordo dei dati. NOTA: i passaggi 5,7-5,9 può avere bisogno di essere ripetuta se il modello suggerisce un ulteriore cambiamento significativo della percentuale legata ai concentrazi massime ligando(se questo è il caso, probabilmente sarebbe l&#39;ideale per ripetere l&#39;esperimento con un più alto punto di concentrazione del ligando incluso). </li><li> Nei casi in cui la proteina mostra un comportamento cooperativo traslazione binaria e display, l&#39;equazione suggerito nel passaggio 5.5 dovrebbero essere sostituite con quelle dal punto 4.1. I parametri &quot;bottom&quot; &quot;Top&quot; e dovrebbero essere sostituiti da 1 e 0, rispettivamente. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno due volte (vedi punto 2.12) per garantire la riproducibilità. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi.">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li><li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB.">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

Fluorimetria differenziale a scansione ha dimostrato il suo potere come un metodo robusto e versatile per la caratterizzazione delle proteine, e identificare potenziali ligandi proteici. I successi ben documentati in expediting stabilizzazione proteica, la scoperta di farmaci (in particolare nei laboratori meno ben finanziati) e cristallizzazione 10,23-25 ​​hanno reso un metodo interessante per lo screening iniziale dei composti. Composti aggiunti alle proteine ​​mostrano una dose di chiara dipendente aumento della temperatura di fusione apparente 7,9. Tuttavia, ci sono stati alcuni tentativi di utilizzare i risultati di questi esperimenti per determinare le costanti di legame apparente per aiutare nella classifica composti per la loro affinità. Qui, presentiamo un metodo per determinare sistematicamente una costante di dissociazione apparente di proteine ​​in presenza di un ligando. I risultati qui presentati dimostrano che DSF può rapidamente e robusta fornire stime della costante di dissociazione peruna combinazione di proteina-ligando. I dati osservati possono essere manipolati con gli strumenti disponibili in commercio di fornire una rapida determinazione di K d, senza la necessità di effettuare assunzioni riguardanti il valore probabile di parametri. Il metodo ha un vantaggio significativo su alcuni metodi comparabili di essere parsimoniosi in proteine ​​e tempo necessario. L&#39;esperimento descritto qui consumerà 0,13 mg di proteine ​​per dell&#39;esperimento (circa 0,4 mg per esperimenti ripetuti in triplice copia). Questo confronto con Calorimetria isotermica di titolazione (ITC), in cui un singolo esperimento con una media di 40 kDa consumerà un importo simile. La serie completa di esperimenti necessari per questo protocollo sarebbe consumare circa 4 ore, compresa la preparazione, per un singolo set di esperimenti. Ancora una volta, questo è probabile che sia molto più veloce di metodi come ITC o risonanza plasmonica di superficie, che pur potenti spesso richiedono notevole ottimizzazione per ottenere migliori dati. I nostri risultati dimostrano che permane l&#39;obbligo di esaminare attentamente i dati grezzi, la misura di questi dati per determinare la temperatura di fusione, e la misura dei dati di temperatura di fusione per determinare la costante di dissociazione. Un primo problema è la forma dei dati grezzi prodotti nella proteina di fusione. In alcuni casi, la forma non può approssimare a quello osservato nella Figura 1A. Problemi comuni includono bassi turni di temperatura sulla ligando vincolanti, sfondo di alta fluorescenza, e inusuali più transizioni di temperatura. A bassa temperatura turni sono visti sul legame un numero di ligandi. Per questo metodo, il parametro più critico è l&#39;errore nella misurazione T m, rispetto al cambiamento di temperatura. I dati di solito può essere montato abbastanza bene quando la deviazione standard delle misurazioni triplice copia non supera il 10% del turno di temperatura di fusione tra proteine ​​non legato e completamente legato. La nostra esperienza è che quando tale temperaturaturni lette- sono solo 2 ° C, questo può essere sufficiente per il montaggio dei dati, se i singoli punti di dati sono molto accurate. Un secondo problema è insolitamente a forma di curve. Questi spesso differiscono tra proteina libera e forme ligando legato, come il legame ligando influisce modalità della proteina dispiegarsi. In questi casi, l&#39;utente deve esaminare se i dati possono essere utilizzati con idonei considerazione dei modelli da utilizzare per la determinazione della temperatura di fusione e la costante di dissociazione. Un altro problema comune è che l&#39;aggiunta di un cofattore per la proteina (ad esempio, MgCl 2 nel nostro esempio con esochinasi) è necessario per ottenere i dati più affidabili. La nostra esperienza è stata che un attento esame di tutti i fattori che possono nell&#39;esperimento in fase di prendere dei valori iniziali è essenziale per ottenere i migliori risultati. Inoltre, i trattamenti teorici alternativi possono rivelare le caratteristiche di questi dati 15,17. Infine, non è raro che alcune proteine ​​che contain nativamente esposto regioni idrofobiche di mostrare sfondo ad alta fluorescenza. Ci sono una serie di soluzioni a questi problemi, che sono stati ampiamente recensito altrove 6,9. In particolare, l&#39;utente deve valutare se usare la Boltzmann o modelli derivati ​​(ad esempio, figura 4), ​​e nel caso di utilizzo di derivati, se più fusi devono essere modellati. I due metodi di modellazione del dispiegamento termico differiscono dal fatto che il metodo di Boltzmann adatta ai dati sperimentali di Boltzmann, assumendo una forma sigmoidale regolare la curva di dispiegamento. Al contrario, il metodo derivato prende la derivata prima dei dati sperimentali in ogni punto (pannello inferiore nella Figura 1A), e considera la temperatura di fusione di essere il punto di massima derivata prima. Il metodo derivato restituisce generalmente una temperatura di fusione più elevata di circa 2 - 3 ° C. La maggior parte delle proteine ​​torneranno una più coerenterisultato (ovvero, l&#39;errore standard della temperatura di fusione per esperimenti in triplo è inferiore) per uno dei due metodi. Questo è di solito intimamente legata alla forma precisa della proteina dispiegarsi curva, ed è necessario determinare empiricamente il metodo migliore in ciascun caso. Quando viene utilizzato il modello derivato, è anche importante considerare più eventi di fusione. Alcuni dati mostrano chiaramente le prove per più transizioni, e in questi casi i risultati sono suscettibili di essere più facile da interpretare, se questi eventi di fusione più sono modellati. Nel contesto di questo protocollo, è spesso il caso che l&#39;aggiunta del ligando può causare una proteina di passare da avere più transizioni di fusione di una singola transizione (ad esempio, stabilizzando il sottodominio più fragile termicamente), o viceversa. Vorremmo quindi sostenere che i dati grezzi vengono esaminati insieme prima di considerare quale approccio sarà meglio usare. Seguendo il modelling delle singole temperature di fusione, ulteriori problemi possono sorgere in raccordo questi per i modelli presentati nella sezione del protocollo. E &#39;indispensabile esaminare attentamente la misura di dissociazione equazione costante utilizzando una scala logaritmica, in quanto questa analisi evidenzia spesso discrepanze tra i dati osservati e il modello (es., Figura 3). Sebbene i risultati ottenuti sono generalmente robusti, cura nella interpretazione offre la possibilità di estrarre i risultati migliori, e più significato, dai dati. Un particolare problema sollevato da questi dati è l&#39;interpretazione che deve essere posizionato su proteine ​​che mostrano cooperatività, o più eventi vincolanti, in DSF. Abbiamo, ad oggi, solo osservato questo fenomeno in proteine ​​che sono tenuti ad avere più eventi di legame specifici (ad esempio, WCBM, una proteina il cui omologo migliore è un Multimer 26, e che agisce come un Multimer sulla dimensione cromatografia di esclusione [dati nonmostrato]). Non è affatto chiaro che la cooperatività negativa osservata in DSF denaturazione indica che l&#39;enzima mostrerà infine cooperatività negativa: anzi, questo può essere un indizio del legame complesso che deve essere esplorato più a fondo utilizzando una vasta gamma di metodi. Ciò suggerisce a noi, però, che più studi approfonditi di tali proteine ​​sono suscettibili di individuare gli effetti interessanti. I valori indicati per la costante di dissociazione con questo metodo sono generalmente dello stesso ordine di quelli forniti da altri metodi, come ad esempio Calorimetria isotermica di titolazione e risonanza plasmonica di superficie. Tuttavia, i valori assoluti osservati sono spesso superiori a quelli osservati con questi metodi. Questo è almeno in parte una conseguenza del fatto che la costante di dissociazione si osserva alla temperatura di fusione della proteina con ligando. Questo Kd è generalmente superiore a quella a temperature fisiologiche. Il dissociation costante è correlata alla temperatura della reazione dalle equazioni: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (Dove c θ è la concentrazione di riferimento standard, Δ r G è la variazione di energia libera di Gibbs della reazione, R è la costante dei gas molare, Δ H è la variazione di entalpia nella reazione, e Δ S è la variazione di entropia nella reazione .) Reazioni con costanti di dissociazione nell&#39;intervallo misurabile di questo metodo generalmente hanno un negativo Δ r G, e quindi l&#39;effetto di un aumento della temperatura sulla equazione [1] saranno aumentare la costante di dissociazione. Entrambi i termini Δ H e Δ S che costituiscono l&#39;energia libera di Gibbs (equazione [2]) sono temperature 27 dipendenti, e l&#39;effetto sulla costante di dissociazione dipenderanno dalla grandezza e segno di queste dipendenze di temperatura, e saranno necessariamente interazione dipendente. Di conseguenza, non è inaspettato che le costanti di dissociazione determinate con questo metodo sono a volte superiori a quelli determinati con metodi che operano a RT. Dipendenza dalla temperatura è, naturalmente, anche un avvertimento di molti altri metodi, che tendono a fornire la costante di dissociazione a temperature inferiori alla temperatura fisiologica. Un altro avvertimento del metodo DSF è che è un metodo marcato, a differenza ITC. L&#39;etichetta fluorescente utilizzato (SYPRO arancione) è idrofobo, e così in alcuni casi può competere con il legame di ligandi idrofobici alle proteine. Di conseguenza, è probabile che in alcuni casi, la costante di dissociazione ottenuto sarà artificialmente elevato a causa della competizione con l&#39;etichetta. Tuttavia, per il confronto di diversi ligandi, (l&#39;uso primario diDSF), le differenze è improbabile che siano sufficientemente significativo ai fini della graduatoria di composti per affinità. Un potenziale svantaggio di questo metodo è il limite di rilevamento che può essere raggiunto. In linea di principio, non dovrebbe essere possibile misurare con precisione un valore per K d, che è inferiore al 50% della concentrazione di proteine, e anche i valori di questa gamma sono suscettibili di essere di dubbia precisione. Mentre il limite di rivelazione in questo fine dell&#39;intervallo può essere esteso un po riducendo le concentrazioni di proteine ​​e colorante, la sensibilità dello strumento impedirà un&#39;ulteriore riduzione della concentrazione proteica. Analogamente, l&#39;estremità superiore della sensibilità sarà determinata dalla solubilità del ligando. Per ottenere una stima matematicamente robusto per K d, è molto importante per ottenere dati con il 90% delle proteine ​​presenti nella forma ligando-bound, che richiede concentrazioni di ligando ad essere approssimativaly dieci volte K d (supponendo che non cooperatività). Il limite di rivelazione sarà quindi necessariamente essere un decimo della solubilità del ligando nel buffer pertinente. Ciò significa che i limiti di rivelazione del metodo in genere compresi tra 1 mM e tra 1 e 100 mm, a seconda della proteina e ligando. In conclusione, a scansione differenziale fluorimetria è una tecnica versatile applicabile ad una vasta gamma di proteine. Usando i metodi qui presentati, è possibile determinare rapidamente ed economico l&#39;affinità di una proteina per diversi ligandi. Questo ha un grande potenziale per l&#39;applicazione nella purificazione della proteina e la stabilizzazione, chiarendo la funzione o la specificità degli enzimi provenienti da metagenomi, e nella scoperta della droga, soprattutto nei piccoli laboratori.

Tutte le proteine ​​si legano, con affinità diverse, ad una vasta gamma di altre molecole di ioni semplici ad altre grandi macromolecole. In molti casi, le proteine ​​si legano a molecole piccole parti come parte della loro normale funzionamento (ad esempio, una chinasi legame ATP). Altre interazioni possono essere estranei alla funzione, ma sono sperimentalmente utili come strumenti (ad esempio, piccole molecole che stabilizzano le proteine ​​per migliorare il successo di cristallizzazione, o aiutare a mantenere le proteine ​​in soluzione); mentre piccole molecole che si legano ai siti attivi e siti allosterici di proteine ​​può agire come inibitori, e quindi modulare l&#39;attività degli enzimi. Vi è un&#39;ampia gamma di tecniche che possono essere utilizzate per determinare l&#39;affinità di proteine ​​per molecole partner. Calorimetria isotermica di titolazione 1 è ampiamente considerato come un &quot;gold-standard&quot;, in quanto fornisce informazioni sulle reazioni ricco, è l&#39;etichetta libera, e ha limitato le opportunità per unrtifacts dell&#39;esperimento. Tuttavia, nonostante i recenti miglioramenti nella sensibilità della strumentazione e automazione del set-up sperimentale, è ancora relativamente costoso in termini di fabbisogno proteico, ha al massimo un rendimento basso-medio, ed è più adatto alle interazioni con moderata a affinità alta (10 Nm a 100 mM K d) 2. Altra etichetta metodi gratuiti come risonanza plasmonica di superficie o doppio strato interferometria 3 offerta throughput più elevati, e hanno raggiunto la sensibilità per rilevare molecole più piccole a partire da 100 bis. Tuttavia, gli strumenti high throughput per questi metodi sono relativamente costosi, sono giustificati solo se ci sarà un continuo rendimento di progetti rilevanti, e quindi sono suscettibili di essere inaccessibile a molti laboratori universitari. Fluorimetria differenziale a scansione (DSF, o thermofluor) è stato descritto nel 2001 4 come metodo per la scoperta di nuovi farmaci. In questo metod, proteine ​​vengono incubati con un colorante fluorescente (stati usati coloranti inizialmente naftalen-solfonico), che ne modifica la fluorescenza dopo il legame alle regioni idrofobiche delle proteine. Il campione di proteina-colorante viene poi riscaldata, e la fluorescenza monitorato come aumenta il calore. Il dispiegamento della proteina, e l&#39;esposizione di parti idrofobiche della proteina, dà luogo ad un pattern caratteristico della fluorescenza in funzione della temperatura (Figura 1A). L&#39;esperimento può essere eseguita in piccoli volumi in qualsiasi strumento commerciale quantitativa PCR, e quindi in un singolo esperimento, un gran numero di campioni può essere simultaneamente testati (solitamente 48, 96 o 384 campioni, a seconda del modello di strumento). Esperimenti di solito può essere eseguita in circa un ora, fornendo la possibilità di alto rendimento analisi dei campioni 5. Ulteriori miglioramenti della metodologia hanno visto l&#39;adozione di coloranti con migliori proprietà spettrali 6,7 </sup&gt;, strumenti generici per l&#39;analisi dei dati, e suggerito protocolli per lo screening iniziale di 8,9. La gamma di applicazioni del metodo è stato esteso, con un focus particolare sulla creazione di condizioni ottimali per la preparazione e la conservazione delle proteine ​​10, e sull&#39;identificazione di potenziali partner di legame per aiutare la cristallizzazione 11. Il relativamente alto rendimento del metodo, costo relativamente basso contenuto di proteine ​​(~ 2 mg per reazione), e l&#39;applicabilità di studiare molecole leganti deboli ha fatto DSF uno strumento prezioso per frammento basato progettazione di farmaci, soprattutto in un contesto accademico 12-14. Nonostante l&#39;ampia applicazione di DSF per studiare le interazioni proteina-ligando, pochi studi hanno descritto determinazione delle costanti di dissociazione da questi studi. Tuttavia, questi hanno la tendenza a produrre equazioni dettagliate che descrivono lo svolgersi della proteina, con molti parametri che devono essere installati i dati sparsi o in alcuni casi estimated 7,15-17. Questi metodi sono di particolare rilevanza nei casi difficili, come ad esempio i composti strettamente vincolanti, o proteine ​​che mostrano le transizioni insolite. Tuttavia, per molti laboratori, queste analisi dettagliate sono troppo ingombranti per l&#39;uso di routine. Proponiamo quindi trattamenti alternativi per diversi scenari, e dimostrare come questi possono essere usati per adattare i dati risultanti dalle diverse interazioni proteina-ligando. Il nostro metodo utilizza lo strumento StepOne qPCR, per la quale software di analisi dei dati su misura è disponibile; mentre questo accelera l&#39;analisi dei dati, i risultati da altri strumenti possono essere elaborati con i metodi precedentemente pubblicati 9, e la stessa analisi a valle possono essere eseguite.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">StepOne real time PCR instrument</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376357</td>
			<td style="width:167px;">DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Protein thermal shift software v1.0</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4466037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">MicroAmp Fast optical 48-well plates&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Optical sealing tape&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375323</td>
			<td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">U-bottomed 96-well plates</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td align="right">11521943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S6650</td>
			<td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SPSS statistics version 20</td>
			<td style="width:71px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6.02</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand applicator (PA1)</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">75-3454-4264-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td align="right">10141520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

Una vasta gamma di metodi attualmente disponibili per determinare la costante di dissociazione tra una proteina e interagendo piccole molecole. Tuttavia, la maggior parte di questi richiedono l&#39;accesso alle attrezzature specialistiche, e spesso richiedono un certo grado di esperienza per stabilire efficacemente esperimenti affidabili e analizzare i dati. Fluorimetria a scansione differenziale (DSF) viene sempre più utilizzato come metodo affidabile per lo screening iniziale delle proteine ​​per interagire piccole molecole, sia per identificare i partner fisiologiche o per la scoperta colpo. Questa tecnica ha il vantaggio che richiede solo una macchina PCR adatti per PCR quantitativa, e quindi idonea strumentazione è disponibile nella maggior parte delle istituzioni; un&#39;eccellente gamma di protocolli sono già disponibili; e vi sono forti precedenti nella letteratura per molteplici utilizzi del metodo. Lavoro passato ha proposto diverse modalità di calcolo costanti di dissociazione dai dati DSF, ma questi sono matematicamente esigente. Qui, abbiamo DEMstrare un metodo per stimare le costanti di dissociazione da una moderata quantità di DSF dati sperimentali. Questi dati possono generalmente essere raccolti e analizzati in un solo giorno. Dimostriamo come i diversi modelli possono essere utilizzati per adattare i dati raccolti da semplici eventi vincolanti, e dove sono presenti siti di legame di cooperazione o indipendenti vincolante. Infine, presentiamo un esempio di analisi dei dati nel caso in cui non si applicano modelli standard. Questi metodi sono illustrati con i dati raccolti sulle proteine ​​di controllo disponibili in commercio, e due proteine ​​del nostro programma di ricerca. Nel complesso, il nostro metodo fornisce un modo semplice per i ricercatori di acquisire rapidamente una visione più interazioni proteina-ligando con DSF.

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Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.1K Views.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Video: Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Ricerca

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Raccolta di sperma di qualità differenziale mediante centrifugazione in gradiente di densità

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...