I. Il NanoDrop 2000c spettrofotometro NanoDrop tecnologia si basa su un innovativo sistema di ritenzione di esempio che utilizza la tensione superficiale di tenere e misurare campioni microvolumi tra due piedistalli ottico senza l&#39;uso di cuvette o capillari. Il NanoDrop 2000c spettrofotometro utilizza questa tecnologia per misurare rapidamente e facilmente 0,5-2 ml di gocce proteine, DNA, RNA, e altre biomolecole. Questa capacità è diventato sempre più importante come si evolvono continuamente le tecniche molecolari di utilizzare piccole quantità di materiale per l&#39;analisi. L&#39;ideale spettrofotometro microvolumi per le condizioni in cui è limitato campione. Tuttavia, la facilità d&#39;uso, ciclo di misura veloce e, e gamma di concentrazione estesa anche fare lo spettrofotometro adatto quando grandi quantità di campione sono disponibili. Il ciclo di misura è inoltre notevolmente ridotto, aiutando gli scienziati aumentare l&#39;efficienza per tutta la loro flussi di lavoro. Il microsample è posizionato direttamente sulla parte superiore della superficie di rilevamento e una colonna di liquido si crea tra le estremità delle fibre ottiche dalla tensione superficiale. Questa colonna liquida forma un percorso verticale ottico. Una lampada flash allo xeno fornisce la fonte di luce e uno spettrometro utilizza un CCD lineare viene utilizzato per analizzare la luce che passa attraverso il campione. Rimozione dei dispositivi di contenimento tradizionali come cuvette dal sistema presenta diversi vantaggi: piccole quantità di campione sono necessari per la misura, la pulizia richiede semplicemente strofinando le superfici ottiche con un laboratorio pulire, e la lunghezza del percorso può essere modificato in tempo reale durante la misurazione. Il 2000c NanoDrop determina la lunghezza ottimale percorso automaticamente (1 mm a 0,05 mm), fornendo la più ampia gamma di misure possibili concentrazione proteica senza diluizioni. Accorciando la lunghezza del percorso, più alte concentrazioni di proteine ​​può essere misurata. Questo rimuove efficacemente la necessità di effettuare diluizioni dei campioni più proteine. Ad esempio, il 2000c NanoDrop in grado di misurare le concentrazioni di BSA alto come 400 mg / ml. Il NanoDrop 2000c spettrofotometro è uno spettrofotometro spettro per misurare la densità ottica di DNA, RNA, proteine ​​e altre biomolecole. Questo protocollo video sarà incentrato sulla misurazione delle proteine. II. Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​Utilizzando A280 Misure Assorbanza a. Principio di A280 Misure Il metodo A280 proteina è applicabile a proteine ​​purificate che contengono triptofano, tirosina, fenilalanina o residui di cisteina-cisteina legami disolfuro e assorbanza esporre a 280 nm. Questo metodo utilizza il valore di assorbanza A280 in combinazione con il coefficiente di estinzione di massa o il coefficiente di estinzione molare per calcolare la concentrazione della proteina purificata. Il vantaggio di diretto A280 misure è che la generazione di una curva standard non è necessario per determinare la concentrazione di proteine. Se il campione è una soluzione proteica non caratterizzato, lisato cellulare, o l&#39;estratto di proteina grezza, quindi utilizzando uno dei metodi colorimetrici preconfigurato disponibile sul 2000/2000c NanoDrop, come ad esempio BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry e saggi, è raccomandata. b. Microvolumi Proteine ​​A280 Misure - Avvio <ol><li> Selezionare l&#39;applicazione A280 proteine ​​dal menu principale. </li><li> Seleziona il tipo di campione da misurare dal menu a discesa. L&#39;impostazione predefinita è consigliata per la maggior parte delle miscele di proteine ​​sconosciute in cui 1 Abs = 1 mg / mL. Se misura una proteina precedentemente caratterizzata purificata, allora o il coefficiente di estinzione di massa o coefficiente di estinzione molare e peso molecolare possono essere inseriti per determinare la concentrazione di proteine ​​più preciso. </li><li> Scegliere l&#39;unità di concentrazione dal menu a discesa. </li></ol> c. Microvolumi Proteine ​​Misure A280 - Blanking <ol><li> Stabilire il bianco con un buffer adeguato. E &#39;importante utilizzare il buffer in cui viene sospesa la proteina. Il buffer utilizzato deve essere lo stesso pH e di una forza simile ionica come la soluzione del campione. Nota: buffer RIPA contribuire assorbanza troppo a 280 nm e sono quindi incompatibili con le misure dirette proteine ​​A280. Per le proteine ​​sospese in un buffer RIPA, si consiglia di concentrazione proteica essere determinata usando un test tampone compatibile RIPA colorimetriche. </li><li> Pipettare 2 ml di soluzione appropriata di chiusura sul piedistallo in basso, abbassare il braccio e fare clic su Vuoto. </li><li> Pulire la soluzione del bianco dal piedistalli inferiore e superiore con un laboratorio panno asciutto. </li></ol> d. Microvolumi Proteine ​​Misure A280 di misura Considerazioni importanti: L&#39;omogeneità del campione è estremamenteimportante, in quanto tale un piccolo volume che viene misurato. Per garantire che i campioni siano omogenei, mescolare delicatamente ma accuratamente i campioni immediatamente prima di assumere una aliquota per la misurazione. Evitare l&#39;introduzione di bolle durante la miscelazione e pipettaggio. A causa della variabilità della tensione superficiale tra le diverse proteine, si consiglia di carico 2 ml di campioni per assicurare un&#39;adeguata formazione colonna. Utilizzare sempre bassi puntali di ritenzione. Per caricare un campione, toccare la punta della pipetta sulla superficie inferiore piedistallo ottica mentre espellere la soluzione per evitare che la soluzione di aderire alla parte esterna della punta della pipetta. Espellere inferiore all&#39;importo totale del campione per evitare scoppio e l&#39;introduzione di bolle nel campione. <ol><li> Immettere un ID campione nel campo appropriato, carico 2 l di primo campione come descritto per la Misura vuoto e fare clic. Una nuova aliquota 2μL del campione dovrebbe essere utilizzato per ogni misura. </li><li> Rimuovere il campione dal piedistalli inferiore e superiore con un laboratorio panno asciutto. </li></ol> e. Microvolumi Proteine ​​A280 Misure di pulizia Un normale e privo di lanugine, pulire laboratorio è spesso sufficiente per pulire i piedistalli ottica tra le misurazioni. f. Fare Proteine ​​A280 Misure Ricondizionamento Soluzioni e reagenti contenenti tensioattivi può uncondition le superfici di misura piedistallo nel corso del tempo, impedendo la colonna di liquido campione di forma. Un appiattimento della goccia sul piedistallo più basso è indicativo della superficie ottica diventa incondizionato. Se le proprietà di superficie sono stati compromessi, ricondizionamento i piedistalli è importante garantire colonna formazione del campione. In questo caso, lucidare le superfici ottiche con forza usando laboratorio pulire o utilizzare Compound NanoDrop piedistallo Ricondizionamento (PR-1) come indicato. III. Microvolumi Concentrazione Determinazione proteine ​​mediante test colorimetrici a. Principio di rilevamento colorimetrico Lo spettrofotometro NanoDrop 2000c può essere utilizzato anche per misurare soluzioni di proteine ​​non caratterizzato, lisati di cellule, proteine ​​ed estratti grezzi mediante test colorimetrici. Metodi colorimetrici sono metodi indiretti che richiedono l&#39;interazione di una tintura con la componente proteica del campione per la produzione di un nuovo complesso che assorbe la luce nella gamma di lunghezze d&#39;onda visibili. Lo spettrofotometro NanoDrop 2000c ha diversi test colorimetrici pre-configurati tra cui BCA, Pierce 660, Bradford, Lowry e metodi. Il test BCA sarà dimostrato come un test colorimetrico esempio utilizzando uno spettrofotometro microvolumi. (Screenshot) L&#39;(acido Bicinchoninic) BCA test è un metodo comune colorimetrico spesso utilizzato per soluzioni di proteine ​​diluite e proteine ​​in presenza di componenti che sono significativi UV (280 nm) assorbanza. A differenza del metodo A280 proteine, il metodo BCA Protein richiede che una curva standard essere generato prima di concentrazioni di proteine ​​del campione può essere misurata. Il metodo utilizza acido bicinchoninic (BCA) come reagenti di rilevamento. Il Cu-BCA chelato formano in presenza di proteine ​​è misurata a 562 nm e normalizzato a 750 nm. b. Microvolumi BCA saggio Misure BCA saggio Preparazione <ol><li> I reagenti necessari sono contenuti nel kit riducente compatibile (Thermo Scientific gatto Pierce non 23250..): Reagente BCA A, B reagente BCA, reagente compatibilità, buffer di ricostituzione, e albumina (BSA) standard. </li><li> Equilibrare tutte le proteine ​​sconosciute e gli standard di proteine ​​a temperatura ambiente e mescolare accuratamente. </li><li> Preparare abbastanza fresca reagente di lavoro per gli standard ed i campioni da misurare con un rapporto di 50:1 di reagente A: B </li><li> Per l&#39;analisi micro, utilizzare un rapporto 1:1 di reagente di lavoro a campione. Aggiungere 10 ml di reagente di lavoro a ciascuna provetta con tubi sufficiente a coprire tutti i campioni e standard. Per l&#39;alta gamma test, utilizzare un rapporto di 20:01 di reagente di lavoro a campione. Aggiungere 190 ml di reagente di lavoro a ciascuna provetta con tubi sufficiente a coprire tutti i campioni e standard. Fare riferimento alla BCA Pierce corredo della documentazione per stabilire quale rapporto è adatto per i vostri campioni. </li><li> Aggiungere 10 ml di standard o campione per ciascun tubo contenente reagente. Mescolate bene delicatamente vortex. </li><li> Incubare le provette a 37 ° C per 30 minuti. </li><li> Lasciare le reazioni a temperatura ambiente (~ 10 minuti). </li></ol> c. Microvolumi Misure saggio BCA Generazione Curva Standard <ol><li> Selezionare il metodo BCA Protein dal menu principale. Se la finestra di verifica lunghezza d&#39;onda appare, assicurarsi che il braccio è basso. </li><li> Immettere i valori per ogni concentrazione standard nella tabella riquadro di destra. Il software permette di riferimento e fino a 7 additstandard ionale. Il riferimento e / o norme devono essere misurate in replica. Nota: Il requisito minimo per la generazione di curva standard è la misura di due standard o la misura del riferimento zero e almeno uno standard. Si raccomanda che gli standard aggiuntivi essere inclusi come necessario per coprire il previsto intervallo di concentrazione test. </li><li> Stabilire un vuoto. Il vuoto per test colorimetrici è generalmente deionizzata H 2 O. </li><li> Pipettare 2 ml di dH 2 O sul piedistallo in basso, abbassare il braccio e fare clic su Vuoto. Solo un vuoto necessario per coprire tutte le successive misurazioni di riferimento e standard. </li><li> Stabilire il riferimento pipettando un&#39;aliquota di 2 microlitri contenente solo reagente di lavoro e di buffer con nessuna proteina sul piedistallo più basso. Abbassare il braccio e Misura clic. </li><li> Nella scheda standard, evidenziare lo standard desiderato e Pipettare 2 ml di standard desiderato sul piedistallo più basso. Abbassare il braccio e Misura clic. Ripetere la procedura per tutte le norme. Assicurati di misurare tutti gli standard prima di campioni di misura. Per visualizzare curva standard fare clic su Visualizza Curva Standard. </li></ol> d. Microvolumi Misure Assay BCA 2 Misure proteine ​​microlitri <ol><li> Dopo tutti gli standard sono stati misurati, fare clic sul pulsante Campioni. Inserire l&#39;ID del campione. Carico 2 l di campione sul piedistallo più basso e fare clic su Misura. Una nuova aliquota 2 l di campione deve essere utilizzato per ogni misurazione. </li><li> Pulire il campione dal piedistalli inferiore e superiore con un laboratorio panno asciutto. </li></ol> e. Microvolumi Misure di analisi BCA di pulizia e ricondizionamento Effettuare la pulizia e ricondizionamento, come descritto nella diretto A280 misurazioni dell&#39;assorbanza. Rappresentante dei risultati: Determinazione delle proteine ​​microvolumi concentrazione è effettuata sia da un diretto A280 misura o un saggio colorimetrico indiretto. L&#39;A280 esempio di misura determina la concentrazione di proteine ​​in base al coefficiente di estinzione della proteina di interesse. Il test colorimetrico BCA esempio determina la concentrazione di proteine ​​a base di una curva standard di concentrazioni di proteina nota.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

Gli autori sono dipendenti di Thermo Fisher Scientific che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Quantificazione microvolumi utilizza le proprietà intrinseche tensione superficiale di un campione a formare una colonna di liquido tra due superfici di misura. L&#39;assenza di un dispositivo di contenimento, la lunghezza del percorso permette di modificare in tempo reale, essenzialmente eliminando la necessità di eseguire diluizioni. Questa capacità aumenta notevolmente la gamma dinamica delle concentrazioni di proteine, nonché la velocità di misura. Utilizzando quantità minime di campione, un gran numero di campioni possono essere analizzati rapidamente e con precisione, permettendo agli scienziati di prendere più misure e ottenere il controllo di qualità migliore. Inoltre, e, se necessario, i campioni preziosi possono essere recuperati dopo l&#39;assunzione di una misura. Quando questi piccoli volumi vengono misurati, l&#39;omogeneità del campione è estremamente importante per evitare gli errori di campionamento. Bassa puntali di conservazione deve essere sempre usato per i campioni di carico e le punte dovrebbe essere cambiato tra il campione replica. Le superfici piedistallo devono essere puliti e condizionati a garantire i risultati più accurati. Infine, lo spettrofotometro microvolumi è ideale quando campione è limitato, tuttavia, la facilità d&#39;uso, velocità e ampia gamma dinamica dello spettrometro lo rendono adatto campione quando è abbondante.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Spettrofotometria tradizionale richiede ponendo i campioni in cuvette o capillari. Questo è spesso impraticabile a causa del volume campione limitato spesso utilizzati per l&#39;analisi delle proteine. La Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spettrofotometro risolve questo problema con un innovativo sistema di ritenzione del campione che tiene campioni microvolumi tra due superfici di misura utilizzando le proprietà di tensione superficiale dei liquidi, consentendo la quantificazione di campioni in volumi più bassi 0,5-2 microlitri. L&#39;eliminazione di cuvette o capillari consente di modificare in tempo reale lunghezza del percorso, che riduce il tempo di misura mentre aumentando notevolmente la gamma dinamica delle concentrazioni di proteine ​​che possono essere misurati. La necessità di diluizioni è anche eliminata, e preparati per la quantificazione del campione sono relativamente facili come le superfici di misurazione può essere semplicemente cancellato con laboratorio pulire. In questo articolo video presenta le modifiche ai metodi tradizionali di proteine ​​concentrazione determinazione per la quantificazione degli importi microvolumi di proteine ​​utilizzando A280 letture di assorbanza o il saggio colorimetrico BCA.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Campioni microvolumi sono quantificati da un sistema spettrofotometro che utilizza naturale tensione superficiale di conservare i campioni senza l&#39;uso di cuvette o capillari. La gamma dinamica di concentrazioni di proteine ​​e la velocità con cui possono essere misurati sono notevolmente aumentata con questo metodo.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

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microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Research

JoVE Journal

Biology

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Video: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Ricerca

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro