Gli autori sono molto grato a Giuseppe Mancini (già con GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments limitata) per il loro ruolo nella installazione e formazione sul calorimetro a scansione differenziale, Sasmit Deshmukh e Webster Magcalas per le loro discussioni.

1. Strumento di avvio <ol><li> Accendere il calorimetro a scansione differenziale ed aumentare la pressione nelle celle per sopprimere ebollizione dei campioni e prevenire la formazione delle bolle a temperature elevate. Questo è tipicamente ottenuto alimentando azoto nel sistema. </li><li> A seconda del materiale costituente della cellula (ad esempio, tantalio, oro, platino, ecc), regolare la pressione del gas di alimentazione dell&#39;azoto secondo pressione raccomandata dal produttore per evitare di danneggiare la cella. Ad esempio, impostare la pressione di alimentazione del gas di azoto a 45 psi per lo strumento utilizzato per sviluppare questo procedimento, e la pressione superiore a 80 psi può danneggiare la cella. </li><li> Assicurarsi che tutti i serbatoi degli agenti di pulizia sono riempiti al volume desiderato. I detergenti richiesti includono acqua e detergente per lavare e pulire la cella, rispettivamente, dopo ogni esecuzione del campione. </li><li> Impostare la temperatura del vano campione tienead un valore adeguato, preferibilmente 5 ° C, per mantenere l&#39;integrità del campione prima di sperimentare. </li></ol> Preparazione 2. campione <ol><li> Dializzare campione contro il buffer che verrà utilizzato come riferimento per l&#39;esperimento. In alternativa, tampone di eluizione raccolti nella fase finale di purificazione della proteina (cioè eluizione colonna) può essere utilizzato. </li><li> Determinare la concentrazione del campione proteico utilizzando il più adatto metodo di determinazione della concentrazione di proteine, come metodo al Kjealdahl 33 o il metodo Lowry 34. Per confronto oggettivo dei risultati, utilizzare lo stesso metodo in modo coerente all&#39;interno dello stesso studio. L&#39;intervallo di concentrazione richiesto può variare a seconda del modello di strumento. Per lo strumento utilizzato in questo protocollo, il campo di lavoro preferibile è 0,5-1 mg / mL. </li><li> Degas il buffer di campione e di riferimento nel vuoto per sbarazzarsi di microbolle che possono causare il volume inaccurACY. Questo passaggio può essere saltato per i modelli più recenti calorimetro. </li><li> Usando una micropipetta e punte sterili in un armadio biocontenimento flusso laminare, caricare i campioni e il loro rispettivo tampone a coppie in piastre da 96 pozzetti compatibili con lo strumento. Riempire le prime due coppie di pozzetti con tampone e le ultime due coppie con acqua per il buffer-buffer e la scansione dell&#39;acqua, rispettivamente. Scansioni Buffer-tampone verificare l&#39;idoneità dello strumento prima di assaggiare la misura (vale a dire la valutazione dell&#39;errore strumentazione), così come stabilire una linea di base; mentre scansioni acqua vengono eseguiti per pulire le cellule. </li><li> Coprire la piastra a 96 pozzetti con un film di sigillatura, e garantire che i pozzi siano adeguatamente sigillati prima di prendere il piatto fuori dalla biosicurezza gabinetto per evitare la contaminazione del campione. </li><li> Porre la piastra in vano campione tenendo nel giusto orientamento. </li></ol> Setup 3. Sperimentale Parametro Nota: A seconda della instrumentation, i campioni possono essere caricati nella cellula sia manualmente con una siringa, o automaticamente utilizzando un autocampionatore. In questo caso (cioè un ambiente industriale), un autocampionatore viene utilizzato per risparmiare tempo. <ol><li> Utilizzando il software di acquisizione, inserire le informazioni del campione nell&#39;ordine della piastra è stato caricato di cui al punto 2.4. Inserisci concentrazioni se disponibile, altrimenti immettere valori di concentrazione in software di analisi prima analisi dei dati (paragrafo 4.2). </li><li> Selezionare l&#39;opzione che assicura la pulizia delle cellule con detersivo prima ogni scansione del campione, che dovrebbe essere seguito da più passaggi dell&#39;acqua di risciacquo per assicurare residui di detersivo residua delle cellule. </li><li> Impostare la temperatura iniziale dell&#39;esperimento a 20 ° C, ma questo può variare a seconda previa conoscenza del campione. Per proteine ​​note, predeterminata temperatura di partenza può essere usato, mentre una temperatura iniziale inferiore può essere utilizzata anche per campioni sconosciuti. </li><li> Impostare la temperatura finaledell&#39;esperimento, ad esempio 100 ° C. La temperatura finale può variare a seconda previa conoscenza del campione. </li><li> Impostare la frequenza di scansione dell&#39;esperimento, ad esempio 60 ° C / h, che è la velocità di scansione tipica. Tuttavia, velocità di scansione può variare a seconda previa conoscenza del campione, ad esempio 90 ° C / h, o 120 ° C / h. È consigliabile eseguire la scansione di campioni sconosciuti a velocità di scansione differenti per valutare la cinetica di svolgimento. </li><li> campioni Rescan per indagare la reversibilità del dispiegarsi termica. Il dispiegamento di una proteina è considerata reversibili se l&#39;entalpia ottenuto per la seconda scansione è almeno 80% del valore entalpia per la prima scansione. </li><li> Impostare il termostato post-esperimento a 10 ° C per preservare l&#39;integrità delle cellule del calorimetro. </li><li> Verificare che i parametri di configurazione dell&#39;esperimento siano corretti prima di eseguire l&#39;esperimento. Se tutto è a posto, avviare l&#39;esperimento. </li></ol> 4. DatiANALISI <ol><li> Recupero dati grezzi dall&#39;esperimento e selezionare un campione alla volta per l&#39;analisi. Scansione Sottrazione di riferimento, cioè di buffer, dalla scansione del campione. NOTA: Riferimento sottrazione viene eseguita automaticamente da più recenti modelli di strumenti DSC. </li><li> Inserire il valore di concentrazione del campione se è stato omesso di cui al punto 3.1. </li><li> Montare e sottrarre linea di base dal termogramma acquisito per tenere conto di differenze nelle capacità termiche degli stati piegati e ripiegati della proteina che è causato dalla esposizione di gruppi idrofobici all&#39;acqua su di dispiegarsi. Lineare o adattamento della curva cubica possono essere applicati a seconda della forma del profilo DSC per il campione. Per coerenza, lo stesso tipo di raccordo deve essere utilizzato durante uno studio, ad esempio studio di stabilità in tempo reale. Questo passo è necessario per elaborare la curva per l&#39;integrazione dei picchi di ottenere entalpia di transizione. </li><li> Eseguire l&#39;integrazione di picco utilizzando non-lineare dei minimi quadrati. Sulla base del prodottoconoscenza applicare due stati o modello non-due stati. il modello a due stati può essere utilizzata per le singole transizioni termiche cooperative, e per le proteine ​​sconosciute, applicare il modello non-due stati fino ad ulteriore conoscenza del prodotto è disponibile. Se del caso, regolare la curva di montaggio utilizzando la curva di funzione raccordo iterativa del software dell&#39;apparecchiatura fino a quando il valore del chi-quadro rimane costante. </li><li> I risultati ottenuti mostrano i valori per punto medio di temperature di transizione (TM), entalpia calorimetrica (d H), e Van&#39;t Hoff entalpia (d H VH) del campione. </li></ol>

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Tutti gli autori sono dipendenti di Sanofi Pasteur. Il lavoro è stato finanziato da Sanofi Pasteur, e le spese di pubblicazione di questo video-articolo sono stati pagati da Sanofi Pasteur. Gli autori non hanno carattere rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o ente che ha un conflitto finanziario con l&#39;oggetto o materiale trattato nel manoscritto. Questi includono l&#39;occupazione, società di consulenza, il possesso di azioni o opzioni o diritti d&#39;autore. Nessuna assistenza scrittura è stato utilizzato nella produzione di questo manoscritto.

Questa procedura è stata incorporata con successo in vari pacchetti di test di caratterizzazione, tra stabilità e comparabilità dei prodotti studi 21. In studi di stabilità in tempo reale, DSC viene utilizzato per monitorare la T m, nonché stimare la F a dei biologici nel tempo per determinare la shelf-life. Per quanto riguarda comparabilità del prodotto, che viene usato per valutare l&#39;impatto del processo e cambiamento impianto così come l&#39;effetto di fasi di produzione chiave sulla conformazione strutturale dei lotti prodotti. Ciò comporta in genere il confronto diretto del d H del lotto prodotto per un prodotto di riferimento che è stato designato come il prodotto ideale. Inoltre, DSC ha dimostrato di essere un utile strumento analitico per studi formulativi prodotto 37. La T m di una proteina in differenti tamponi ea differenti concentrazioni può essere utilizzato per determinare la formulazione che porge più stabilitàla proteina. Per garantire l&#39;affidabilità di questo metodo e l&#39;obiettività dei suoi risultati, è importante mantenere i parametri di test coerente da corsa per eseguire all&#39;interno dello stesso studio (per esempio, lo studio formulazione del vaccino). Tuttavia, la procedura può essere modificato per accogliere le differenze nelle proprietà fisiche delle varie proteine. Un esempio di una modifica che può essere fatto sta modificando la velocità di scansione dell&#39;esperimento 38, 39. Proteine che erano inclini a aggregati formano quando riscaldato sono stati esaminati ad una velocità di scansione più veloce (per esempio 120 ° C / h) per evitare il contributo degli aggregati al profilo transizione termica nonché intasamento dei capillari del calorimetro. Vale la pena notare che la scansione di tasso può influenzare il risultato di un esperimento DSC 38. L&#39;ampliamento del picco transizione termica è stato osservato con crescente velocità di scansione in qualche proproteine; tuttavia, T m è rimasto abbastanza costante 38. Inoltre, la procedura di dialisi e di degasaggio per la preparazione dei campioni sono anche molto importante per ottenere risultati accurati 31. Dialisi assicura che l&#39;unica differenza nella composizione del campione e il buffer è la proteina; pertanto, tutti gli eccessi di calore assorbito dal campione può essere attribuita alla capacità termica della proteina. Degasaggio assicura precisa analisi del volume, come l&#39;estrapolazione del parametro termodinamico presuppone che l&#39;evento si sta verificando svolgersi sotto costante volume e pressione 31. La porzione di pressione costante del presupposto è rappresentato da azoto pressurizzazione del sistema di cui al punto 1.1 della procedura. In confronto ad altri metodi per determinare la stabilità di conformazioni proteiche come dicroismo circolare (CD) e fluorescenza Spettroscopie, DSC offre una serie di vantaggi in un comimpostazione commerciale tra cui risparmio di costi e di tempo. In primo luogo, il disegno adiabatica di un calorimetro a scansione differenziale consente la misura della stabilità termica con una migliore precisione di temperatura rispetto a misure con strumentazione per CD e fluorescenza Spettroscopie 6. In secondo luogo, a differenza CD, la precisione dei dati DSC non dipende dalla elicità della proteina 39, 40; tuttavia, CD fornisce ulteriori informazioni sul dispiegarsi della struttura secondaria, che sarebbe gratuito per la DSC 41. Inoltre, la pressurizzazione del sistema DSC consente la verifica con un ampio intervallo di temperatura senza ebollizione il campione; pertanto, una vasta gamma di proteine ​​può essere controllata con DSC. Mentre DSC è un approccio relativamente veloce e semplice per determinare la stabilità termica dei biologici, non è senza limitazioni. In primo luogo, la basepasso linea di sottrazione introduce una qualche forma di incoerenza umana nell&#39;analisi dati grezzi; pertanto, variazioni risultati possono essere osservati tra diversi utenti. In secondo luogo, differenziali calorimetri di scansione hanno limiti minimi di concentrazione che potrebbero essere difficili da realizzare su scala produzione di massa. In terzo luogo, la d H di irreversibile denaturazione termica non è assoluta; il che implica che DeltaG derivato (un indicatore della stabilità della proteina) in scenari simili può essere fuorviante. Inoltre, il metodo funziona meglio per campioni purificati. La presenza di impurità può sia causare uno spostamento del T m se vi è una interazione con la proteina in esame, o comparsa di nuove transizioni termiche se non vi è alcuna interazione. In ogni caso queste caratteristiche extra sui termogrammi possono essere erroneamente attribuiti ai campioni, impattando così l&#39;interpretazione dei risultati. Nonostante queste limitazioni, DSC rimane un metodo affidabile in grado di fornire informazioni dettagliate su termodinamico °e proteine processo dispiegarsi se attuato correttamente 42. In conclusione, DSC offre notevole vantaggio come strumento di lettura conformazionale di prodotti vaccini e loro intermedi. I due parametri, T m e d H, raccolti per una serie di lotti dello stesso prodotto può diventare una linea di base empirica che può essere utilizzato per esaminare l&#39;effetto delle variazioni di processo, formulazione, e condizioni di conservazione sulla struttura terziaria e stabilità delle proteine e antigeni virali 21, 43.

Calorimetria differenziale a scansione (DSC) è un metodo sperimentale che misura direttamente la differenza di calore assorbimento di energia che avviene in un campione rispetto ad un riferimento durante un cambiamento regolamentato temperature 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Effettuato in un calorimetro a scansione differenziale, il metodo implica l&#39;introduzione di energia termica in una cella campione e una cella di riferimento contemporaneamente mentre identicamente aumentando la temperatura di entrambe le celle nel tempo 2, 13,14. Grazie alla differenza nella composizione del campione e il riferimento, sarà richiesto diversa quantità di energia per aumentare la temperatura delle celle 2, 12, 13. Così, la quantità in eccesso di energia necessaria per compensare la differenza di temperatura tra le cellule viene misurata e direttamente correlata a specifiche proprietà termodinamiche del campione 1, 3. Nel 1960, MJ O&#39;Neil e E. Watson di Perkin Elmer sviluppato il primo calorimetro a scansione differenziale per misurare il flusso di calore di materiali solidi 2, 3, 4. In parallelo, PL Privalov e DR Monaseldze EL dell&#39;Istituto di Fisica, Repubblica di Georgia (ex URSS) hanno creato un calorimetro adiabatico differenziale unico che può essere utilizzato foR ricerca biochimica 5, 6. Successivamente, la squadra di Andronikashvili presso l&#39;Istituto di Fisica, Repubblica di Georgia, ha riferito la capacità termica di biomolecole quali proteine fibrose e globulari, DNA e RNA utilizzando DSC 7, 8, 9. Diverse squadre guidate da Sturtevant 10, 11, 12, 13 Brandts e Privalov 14, 15, 16 focalizzati sullo sviluppo della teoria e applicazioni pratiche di DSC per indagare i dettagli termodinamici di proteine svolgimento. Il valore della DSC a studiare grandi strutture supramolecolari quali fagi, cloroplasto, cristalli liquidi fosfolipidi e proteine della carne sono stati riportati anche 17 </<html> sup&gt;, 18, 19, 20. DSC è diventato comune in ricerca e sviluppo farmaceutico per la valutazione della stabilità termica di biomolecole, specialmente proteine 1, 21, 22. Ciò è dovuto principalmente ai progressi in termini di sensibilità e automazione della strumentazione utilizzata per condurre l&#39;esperimento 23, 24. Qui, il risultato finale dell&#39;esperimento DSC, cioè capacità termica molare in funzione della temperatura, è usata per stimare i seguenti parametri termodinamici (variazione capacità termica (ΔCp), entalpia (d H), entropia (ΔS) e energia libera di Gibbs (DeltaG)) utilizzando la seguente equazione: eq1.jpg &quot;/&gt; (1) <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" /> (2) <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" /> (3) <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> (4) <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" /> (5) Dove Cp si misura la capacità termica; q è il flusso di calore nel materiale da testare; T 0 e T sono le temperature iniziale e finale della transizione, rispettivamente 22, 25. E &#39;anche interessante notare che le equazioni di cui sopra si applicano alle proteine singolo dominio che possono subire transizione di due stati e reversibile termico dispiegarsi 22. L&#39;analisi delle proteine più complesse (ad esempio proteine, non-due stati, e oligomeri) have stata riportata da Friere et al. 26; Johnson et al. 27; e Kasimova et al. 28. Per determinare se una proteina subisce transizione di due stati o forme intermedie durante denaturazione termica, l&#39;entalpia sperimentale derivato (d H, indicato anche come calorimetrica entalpia d H Cal) viene confrontato con il entalpia derivato utilizzando l&#39;equazione di van&#39;t Hoff indicato di seguito (anche denominato van&#39;t Hoff entalpia; d H VH): <img alt="equazione 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> (6) Dove T m è la temperatura punto medio della transizione, R è la costante dei gas ideali (1.987 cal mol -1 K -1) e Y è la frazione della popolazione proteine a foglio spiegato 16, 29. SeD H VH è pari a d H Cal; o d H VH / d H Cal è uguale a 1, quindi la proteina subisce una transizione &quot;tutto o niente&quot; (cioè transizione due stati) 16, 25, 29. Tuttavia, se d H VH è inferiore a d H Cal; o d H VH / d H Cal è inferiore a 1, la proteina subisce una transizione non due stati 16, 25, 29. Il rapporto d H VH / d H Cal corrisponde anche alla proporzione della struttura delle proteine che si scioglie come unità cooperativa termodinamico o dominio 26. I parametri termodinamici di cui sopra, come DeltaG e d H forniscono informazioni utili sulla stabilità termica delle proteine, tra cui farmaci biologici<html> 30. Tuttavia, l&#39;accento sarà posto sulla T m e d H in questa pubblicazione, in quanto sono i valori riportati per questo protocollo. T m è la temperatura punto medio della transizione, dove la piegati e gli stati unfolded della proteina sono all&#39;equilibrio (cioè, DeltaG = 0) 25, 31. Maggiore è la T m di una proteina, maggiore è la sua stabilità termica 31. D H corrisponde l&#39;area sotto il picco (s) della capacità termica contro grafico di temperatura (noto anche come termogramma) generato alla fine dell&#39;esperimento DSC 16, 25. È l&#39;energia necessaria per denaturare le proteine e può essere utilizzato per stimare la frazione attiva (F a) in una formulazione proteine (cioè, la proporzione di proteine con conformazione attiva in un campione) utilizzando la seguente equazione: jove_content &quot;&gt; <img alt="equazione 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> (7) Dove d H è l&#39;entalpia sperimentalmente derivati del campione di proteine e Q è l&#39;entalpia determinato per un riferimento ben caratterizzato o proteine standardizzato 22. La stima di F a è importante per monitorare la stabilità in tempo reale dei prodotti, nonché la realizzazione di studi di stabilità in condizioni di stress, come richiesto dalle linee guida ICH 32. Confronto di d H fornisce anche informazioni circa la compattezza della struttura conformazione terziaria di una proteina 31. Dettagli Questo protocollo una procedura per valutare la stabilità termica delle proteine ​​in un ambiente industriale ed è stato ampiamente utilizzato per la formulazione di vaccini. È stato sviluppato utilizzando un calorimetro a scansione differenziale automatizzato che genera risultati riproducibili fo concentrazioni di proteine ​​a partire da 300 mg / mL.

<table><tbody><tr><td>Differential Scanning Calorimeter</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>28428948 (Via GE Healthcare)</td><td>Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.</td></tr><tr><td>Contrad 100</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>1504</td><td>Dilute with water to 20% before use</td></tr><tr><td>500 &amp;micro;L Polypropylene round bottom 96 well plate</td><td>Canadian Life Science</td><td>ML072100</td><td>Equivalent plates from other suppliers (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, VW) can also be used</td></tr><tr><td>MicroCal ThermoVac&amp;nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>N/Ap</td><td>provided with the Cap VP DSC</td></tr><tr><td>Biosafety cabinet&amp;nbsp;</td><td>Labconco</td><td>Logic+ - A2</td><td>biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer dialysis cassette</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810 or 66380</td><td>to equilibrate the sample and buffer</td></tr></tbody></table>

differential scanning calorimetry &#8212; a method for assessing the thermal stability and conformation of protein antigen

Calorimetria differenziale a scansione (DSC) è una tecnica analitica che misura la capacità termica molare di campioni in funzione della temperatura. Nel caso di campioni di proteine, profili DSC forniscono informazioni sulla stabilità termica, e in qualche misura serve come &quot;impronta digitale&quot; strutturale che può essere utilizzato per valutare la conformazione strutturale. Viene eseguita utilizzando un calorimetro a scansione differenziale che misura la temperatura di transizione termica (temperatura di fusione; T m) e l&#39;energia necessaria per interrompere le interazioni stabilizzazione della struttura terziaria (entalpia; d H) delle proteine. I confronti sono fatti tra formulazioni e lotti di produzione, e le differenze di valori derivati ​​indicano differenze di stabilità termica e la conformazione strutturale. I dati che illustrano l&#39;uso della DSC in un ambiente industriale per gli studi di stabilità così come il monitoraggio fasi di produzione principali sono forniti come prova dell&#39;efficacia di questo proprotocollo. In confronto ad altri metodi di valutazione della stabilità termica di conformazioni proteiche, DSC è conveniente, richiede poche fasi di preparazione del campione, e fornisce anche un profilo termodinamico completo del processo dispiegarsi proteine.

I dati grezzi maggior parte degli esperimenti DSC sono presentati come un flusso di calore rispetto grafico delle temperature, come calorimetro misura effettivamente la differenza nel tasso di flusso di calore nella soluzione campione e tampone 35. Pertanto, se entrambe le celle (cioè le cellule del campione e di riferimento) contengono soluzioni identiche durante un esperimento, i dati grezzi dalla scansione dovrebbe essere una linea piatta, senza picchi osservabili. Ogni picco osservato può essere attribuito a un errore della strumentazione (ad esempio, danneggiati o contaminati celle), che è il motivo per cui in esecuzione delle scansioni del buffer prima campione di analisi è un test di sistema di idoneità adeguata. La Figura 1 illustra il risultato di una tipica scansione di buffer che indica che calorimetro era in buone condizioni prima campione di analisi. La Figura 2 mostra i dati grezzi per un esperimento DSC effettuata su difflotti diversi di due campioni di proteine. Come accennato più sopra, i picchi osservati sono le differenze nel flusso di calore dei campioni e dei rispettivi buffer. Le differenze di concentrazione del campione possono causare variazioni nella capacità termica registrata dal calorimetro; Tuttavia, queste variazioni sono normalizzati durante l&#39;analisi del campione di cui al punto 4.2 della procedura. Concentrazioni più elevate possono anche rivelare i domini termodinamici aggiuntivi non contribuendo alla transizione a concentrazioni più basse. Inoltre, ogni transizione rappresenta un dominio termodinamico che può includere uno o più domini strutturali della proteina 36. In questo caso, la proteina 1 ha tre domini strutturali che si sciolgono in cooperazione. La Figura 3 mostra i risultati generati dall&#39;analisi dei dati grezzi per proteina 1 e 2 presentati nella figura 2, cioè, dopo basale sottrazione e iterativo curva fitting. I termogrammi risultanti sono stati normalizzati per la scansione di frequenza (effettuata automaticamente da un algoritmo di pre-impostato nel software di analisi) e la concentrazione; in tal modo, presentando i risultati dell&#39;esperimento di capacità termica paragonabile rispetto grafici della temperatura. Il software di analisi utilizza i dati dalla capacità termica rispetto grafici di temperatura, come T m e ΔCp, per derivare altri parametri termodinamici utilizzano varianti delle equazioni sopra riportate seconda della cooperatività di proteine svolgimento. Durante il test di campioni sconosciuti, impostare l&#39;intervallo di temperatura appropriata è fondamentale. Altrimenti, termogrammi incompleti comportano, come illustrato nella figura 4. Anche se T m da tali profili può essere derivata, d H non può essere determinato con precisione. Pertanto, il campione deve essere riprovato con un intervallo di temperatura maggiore per catturare completamente i transizione termica. Alcune proteine ​​anche rimodulo adily aggregati dopo la completa denaturazione, determinando una capacità termica post-transizione aumentando: questo spesso appare come un termogramma incompleta come illustrato in Figura 2B. Tuttavia, rianalisi con temperatura finale superiore può aiutare a confermare se vi sia un evento di una transizione conformazionale a quella regione del termogramma o è solo l&#39;effetto di calore di assorbimento di aggregati proteici. La stabilità termica è uno dei più importanti proprietà fisiche delle proteine e dei prodotti a base di proteine del settore 37. In farmaceutico, è utilizzato per determinare la stabilità dei biologici in diverse condizioni, tra tamponi formulazione e fattori ambientali quali umidità e temperatura. E &#39;anche usato per monitorare chiave fase di produzione (ad esempio, purificazione e disintossicazione) per garantire la coerenza tra le conformazionale lotti di produzione. <strong<html> &gt; Figure 5 e 6 illustrano l&#39;uso di DSC per esaminare gli effetti delle condizioni di disintossicazione e di stoccaggio chimici rispettivamente sulla stabilità e la conformazione strutturale delle due proteine differenti. Le differenze significative nel Tm e d H indicano cambiamenti conformazionali e degradazione delle proteine, rispettivamente. Inoltre, la perdita del terzo transizione nella figura 6 illustra ulteriormente la degradazione di un dominio che è stato confermato da una diminuzione del peso molecolare quando i campioni sono stati analizzati utilizzando cromatografia di esclusione molecolare con multi-angolo dispersione della luce (SEC-MALS) ( dati non mostrati). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> Figura 1: Buffer Scansioni. La somiglianza in gradiente di ogni scansione senza picchi osservabili indica che lo strumento è in buone condizioni e generato risultati riproducibili.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> Figura 2: dati grezzi raccolti da esperimenti DSC. Questi grafici sono buone rappresentazioni dei dati non analizzati (RAW) acquisite dopo prove sperimentali (ad esempio prima di sottrazione della linea di base e curve fitting). Ogni linea rappresenta un lotto di produzione. Protein 2 tende ad aggregare più facilmente in seguito a riscaldamento, con un conseguente aumento della capacità termica superiore a 100 ° C nella regione post-transizione del termogramma. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /><br/&gt; Figura 3: Analyzed DSC dati. Questi grafici sono buone rappresentazioni di dati DSC analizzati (cioè dopo la sottrazione della linea di base e curve fitting). La linea blu rappresenta il termogramma dopo il basale sottrazione, mentre la linea rossa rappresenta la curva con il migliore adattamento al termogramma. (A) La T m e d H per Protein 1 Campione n ° 12 sono 80.16 ° C e 1,69 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. (B) La T m e d H per Protein 1 Esempio # 13 sono 80.15 ° C e 1,71 x 10 6 cal / mol rispettivamente. (C) La T m e d H per la Proteina 2 Esempio # 21 sono 75.01 ° C e 4,08 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. (D) La T m e d H per la Proteina 2 Esempio # 22 sono 75.67 ° C e 4,22 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per</a>visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> Figura 4: Un Termogramma incompleto. I dati grezzi raccolgono per Protein 1 analizzato in un intervallo di temperatura inadeguata. La temperatura finale di esperimento è stato impostato a 90 ° C che non accogliere l&#39;intero profilo di transizione della proteina rispetto al esperimento figura 2A che è stata impostata a 120 ° C. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> Figura 5: hanno analizzato i dati che mostra l&#39;effetto di disintossicazione chimica sulla struttura terziaria della Proteina 1. (A) Protein 1 è una tossina nella sua conformazione nativa e has la sua T m a 56.84 ° C e d H a 2,57 x 10 5 cal / mol. (B) La forma disintossicata di Protein 1 (cioè tossoide) ha T valori d H di 81.01 ° C m ed e 1,89 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. Pertanto, si può concludere che la fase di disintossicazione introdotto qualche forma di variazione della conformazione strutturale della proteina 1, che conferisce maggiore stabilità (superiore T m) alla sua forma disintossicata. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> Figura 6: ha analizzato i dati che mostra l&#39;effetto delle condizioni di magazzinaggio sulla conformazione delle proteine 3. Questi grafici illustrano l&#39;effetto della temperatura di conservazione (2-8 ° C) sulla stabilità e la struttura terziaria della ProTEIN 3 più di 30 settimane. La T valori d H per Protein 3 a 8 ° (A) e 38 ° settimana (B) di stoccaggio m e sono riportati nella tabella 1 che segue. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> Tm 1 (° C) </td><td> D H 1 (cal / mol) </td><td> Tm 2 (° C) </td><td> D H 2 (cal / mol) </td><td> Tm 3 (° C) </td><td> D H 3 (cal / mol) </td></tr><tr><td> Protein 3 conservato a 2-8 ° C per 8 settimane </td><td> 61.91 </td><td> 1.71 x 10 5 </td><td> 75.54 </td><td> 2.17 x 10 5 </td><td> 90.29 </td><td> 4.17 x 10 5 </td></tr><tr><td&gt; Protein 3 conservato a 2-8 ° C per 38 settimane </td><td> 61,87 </td><td> 1,66 x 10 5 </td><td> 75.18 </td><td> 1.46 x 10 5 </td><td> 90.22 </td><td> 5,76 x 10 5 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Tm e d H Valori per Protein 3 al 8 ° e 38 ° settimana di conservazione a 2 - 8 ° C. Sebbene i valori m T in entrambi i punti temporali sono simili, la differenza nei valori d H indica che la struttura terziaria della proteina 3 è degradato oltre 30 settimane sotto la condizione di memoria specificato.

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Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Calorimetria differenziale a scansione misura la temperatura di transizione termica (s) ed energia termica totale richiesta per denaturare una proteina. I risultati ottenuti sono utilizzati per valutare la stabilità termica di antigeni proteici in formulazioni di vaccino.

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell&#39;antigene

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

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38.9K Views.  Sanofi Pasteur Limited.  Calorimetria differenziale a scansione misura la temperatura di transizione termica (s) ed energia termica totale richiesta per denaturare una proteina. I risultati ottenuti sono utilizzati per valutare la stabilità termica di antigeni proteici in formulazioni di vaccino. 

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Ricerca

Biochimica

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

Progettazione di materiali in lega di proteine ​​della seta-seta per le applicazioni biomediche

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Bioingegneria

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To evaluate the potential biotechnical value of these proteins, the analysis of protein structures and functions is a central challenge in this program. The stability of protein sample is essential to provide meaningful assay results and increase the crystallizability of the targets. The thermal shift assay (TSA), a fluorescence-based technique, is established as a popular method for optimizing the conditions for protein stability in high-throughput. In TSAs, the employed fluorophores are extrinsic, environmentally-sensitive dyes. An alternative, similar technique is nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF), which relies on protein native fluorescence. We present here a novel osmolyte screen, a 96-condition screen of organic additives designed to guide crystallization trials through preliminary TSA experiments. Together with previously-developed pH and salt screens, the set of three screens provides a comprehensive analysis of protein stability in a wide range of buffer systems and additives. The utility of the screens is demonstrated in the TSA and nanoDSF analysis of lysozyme and Protein X, a target protein of the Virus-X project.

A protocol is presented to rapidly test the thermal stability of proteins in a variety of conditions through thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry. Buffer systems, salts and additives, together comprising three unique stability screens, are assayed with proteins to identify suitable buffers for functional and structural studies.

Come stabilizzare proteina: stabilità schermi per Thermal Shift saggi e Nano differenziale a scansione fluorimetria nel progetto Virus-X

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

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A Package of Established Analytical Tools to Investigate the Solid-State Alteration of Lipid-Based Excipients

Lipid-based excipients (LBEs) are low-toxic, biocompatible, and natural-based, and their application supports the sustainability of pharmaceutical manufacturing. However, the major challenge is their unstable solid-state, affecting the stability of the pharmaceutical product. Critical physical properties of lipids for their processing-such as melt temperature and viscosity, rheology, etc.-are related to their molecular structure and their crystallinity. Additives, as well as thermal and mechanical stress involved in the manufacturing process, affect the solid-state of lipids and thus the performance of pharmaceutical products thereof. Therefore, understanding the alteration in the solid-state is crucial. In this work, the combination of powder x-ray diffraction and differential scanning calorimetry (DSC) is introduced as the gold standard for the characterization of lipids' solid state. X-ray diffraction is the most efficient method to screen polymorphism and crystal growth. The polymorphic arrangement and the lamella length are characterized in the wide- and small-angle regions of x-ray diffraction, respectively. The small-angle x-ray scattering (SAXS) region can be further used to investigate crystal growth. Phase transition and separation can be indicated. DSC is used to screen the thermal behavior of lipids, estimate the miscibility of additives and/or active pharmaceutical ingredients (API) in the lipid matrix, and provide phase diagrams. Four case studies are presented in which LBEs are either used as a coating material or as an encapsulation matrix to provide lipid-coated multiparticulate systems and lipid nanosuspensions, respectively. The lipid solid-state and its potential alteration during storage are investigated and correlated to the alteration in the API release. Qualitative microscopical methods such as polarized light microscopy and scanning electron microscopy are complementary tools to investigate micro-level crystallization. Further analytical methods should be added based on the selected manufacturing process. The structure-function-processability relationship should be understood carefully to design robust and stable lipid-based pharmaceutical products.

This publication shows the application of x-ray diffraction and differential scanning calorimetry as gold standards for investigating the solid-state of lipid-based excipients (LBEs). Understanding the solid-state alteration in LBEs and its effect on the performance of pharmaceutical products thereof is the key factor for manufacturing robust lipid-based dosage forms.

Un pacchetto di strumenti analitici consolidati per studiare l'alterazione allo stato solido degli eccipienti a base lipidica

Lipid-based excipients (LBEs) are low-toxic, biocompatible, and natural-based, and their application supports the sustainability of pharmaceutical ...

Chimica

<meta charset="utf8"></head><body>Saggi di spostamento termico ad alto rendimento per interazioni proteina-ligando

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although bioinformatic and structural predictions have contributed to the study of unknown proteins, in vitro experimental validations are often hampered by the optimal conditions and cofactors required for biochemical activity. Cofactor binding is not only essential for the activity of some enzymes but may also enhance the thermal stability of the protein. One practical application of this phenomenon lies in utilizing the change in thermal stability, as measured by alterations in the protein's melting temperature, to probe ligand binding. 
Thermal shift assay (TSA) can be used to analyze the binding of different ligands to the protein of interest or find a stabilizing condition to perform experiments such as X-ray crystallography. Here we will describe a protocol for TSA utilizing the pseudokinase, Selenoprotein O (SelO), for a simple and high-throughput method for testing metal and nucleotide binding. In contrast to canonical kinases, SelO binds ATP in an inverted orientation to catalyze the transfer of AMP to the hydroxyl side chains of proteins in a posttranslational modification known as protein AMPylation. By leveraging the shift in the melting temperatures, we provide crucial insights into the molecular interactions underlying SelO function.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento degli studi strutturali e biochimici delle proteine attraverso saggi di spostamento termico

Here, we present the thermal shift assay, a high-throughput, fluorescence-based technique used to investigate the binding of small molecules to proteins of interest.

Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Biologia

Rilevamento ad alta sensibilità del legame composto-proteina mediante fluorescenza

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. Umbelliferone, an active ingredient in Tibetan medicine Vicatia thibetica, exhibits an immunomodulatory effect with an unknown mechanism. The CD40 protein is a key target in the immune response. Therefore, this study employs the principle of differential scanning fluorescence technology to analyze the interactions between CD40 protein and umbelliferone using fluorescent enzyme markers. Initially, the stability of the protein fluorescent orange dye was experimentally verified, and the optimal dilution ratio of 1:500 was determined. Subsequently, it was observed that the temperature melting (Tm) value of CD40 protein tended to decrease with an increase in concentration. Interestingly, the interaction between CD40 protein and umbelliferone was found to enhance the thermal stability of CD40 protein. This study represents the first attempt to detect the binding potential of small molecule compounds and proteins using fluorescence microplates and fluorescent dyes. The technique is characterized by high sensitivity and accuracy, promising advancements in the fields of protein stability, protein structure, and protein-ligand interactions, thus facilitating further research and exploration.

Autore in primo piano: Semplificazione dei metodi PCR per una maggiore accessibilità ed efficienza

This protocol describes a unique method for detecting the binding between compounds and protein molecules, offering the advantages of minimal protein sample loss and high data accuracy.

Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell'antigene

Riepilogo

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Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

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