Desideriamo ringraziare il Dr. Gary Devin per la sua intuizione e feedback su l&#39;impiego di cellule in vetroresina.

Introduzione In questo protocollo si mostra come estrarre, selezionare e piastra gliali ristrette precursore (GRP), le cellule dal midollo spinale di feti di topo E13. Queste cellule sono i primi precursori all&#39;interno delle linee cellulari oligodendrocitario e astrociti e sono definite dalla loro espressione di A2B5. Nel medio GRP integrato con FGF-2, i A2B5 GRPs + inizierà esprimere primi oligodendrocitario lignaggio marcatori PDGFαR e NG2 1,2. Queste cellule della linea oligodendrociti passano attraverso una serie di distinte fasi fenotipici, ognuno caratterizzato da cambiamenti morfologici, nonché l&#39;espressione di marcatori a specifici stadi di sviluppo. Queste cellule precursori sono attualmente in fase di studio come una fonte potenziale di approcci terapeutici basati su celle a disordini della materia bianca del sistema nervoso centrale, inclusa la sclerosi multipla, leucodistrofie e leucomalacia periventricolare (PVL) 3,4,5,6 </sup&gt;. Gli studi che utilizzano cervello umano lignaggio derivato precursori degli oligodendrociti hanno riferito di rimielinizzazione con successo nel cervello del modello dismielinizzazione shiverer del mouse così come nei modelli demielinizzati del midollo spinale di roditori 6,7,8,9. Queste cellule precursori gliali sono state utilizzate anche in studi condotti su altri modelli della materia bianca malattie come le lesioni del midollo spinale e la sclerosi laterale amiotrofica 10,11,12,13. Il nostro laboratorio ha sviluppato un precoce postnatale ipossia-ischemia modello di topo con i quali stiamo valutando l&#39;efficacia di queste cellule derivate dal midollo spinale GRP come un approccio restauro in PVL, la principale causa di paralisi cerebrale 14,15,16. Vi è anche un cervello roditore derivato modello OPC che è stato ampiamente utilizzato per studiare lesioni materia bianca poiché le cellule GRP hanno la tendenza a differenziarsi nel percorso astrocitica 17. Il fenotipo OPC è già entrato nel percorso degli oligodendrociti lignaggio, un fenomeno che sembra irreversible. Tuttavia, siamo interessati a valutare la risposta di un più ampio spettro di cellule progenitrici degli oligodendrociti tra GRP e forse anche la NEP derivati ​​a E10.5. Per questo motivo abbiamo adottato il modello di midollo spinale derivato GRP per il nostro lavoro. Oltre all&#39;uso di GRPs per la sostituzione delle cellule, la derivazione di queste cellule di tipo selvatico e modelli di roditori transgenici di malattie della sostanza bianca consente ulteriori studi in differenziazione gliale in condizioni normali e di malattia in un ambiente in vitro. Pubblicazioni precedenti mostrano segni di vulnerabilità selettiva delle cellule precursori oligodendrocitario di derivazione per vari fattori di stress esterni, come eccitotossicità del glutammato maturazione dipendente, stress ossidativo, e di selezionare i fattori implicati nella neuroinfiammazione 18,19. I nostri studi si sono concentrati sulla comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo di queste lesioni della sostanza bianca, valutare la sensibilità di cellule inlo spettro degli oligodendrociti lignaggio di insultare così come l&#39;analisi putativi approcci terapeutici. Materiale Tutte le procedure che coinvolgono animali sono conformi alle politiche e il PHS IACUC JHU. Tutte le operazioni devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni asettiche. Comunemente dissezioni vengono eseguite in una cappa a flusso orizzontale ed in vitro di lavoro in una cappa a flusso verticale. Tutti i mezzi utilizzati freddo durante dissezioni. I topi utilizzati nel nostro studio sono un tipo selvaggio CD-1 e un ceppo transgenico GFP in uno sfondo C57/BL6. Un CD-1 diga del mouse si ottiene in genere da 10 feti + che sono sufficienti per seme 1-2 T25 fiaschi. In genere, due dighe sono sacrificati in un momento e midollo spinale del feto in pool e placcato in 1 T25 pallone per diga. Una volta che le cellule sono state derivate possono essere espansi e caratterizzati in vitro per studi successivi. 1. Preparazione di Media e fiaschi <ul type="disc"><li> GRPterreno viene utilizzato come mezzo dissezione: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) N2 (100x; Invitrogen) Supplementi e sieroalbumina bovina (BSA, 0,5% w / v). </li><li> Dissociazione media: come mezzo di dissezione. </li><li> Terreno di coltura: media magazzino GRP + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) ed eparina (1 mg / ml, Sigma). </li><li> PLL / laminina rivestite 75 cm 2 o 25 cm 2 palloni (T75 e T25). </li><li> Fiaschette per coltura tissutale (75 cm 2, Falcon) sono state rivestite con 15-20μg/ml Poly-L-lisina (PLL, Sigma) in H 2 O distillata, incubate a 37 ° C per 1 ora poi aspirato. Palloni vengono lavati con 1X PBS poi rivestita con 15-20 ug / ml di laminina (Sigma) in PBS a 37 ° C per 1 ora, poi aspirato e PBS fresco o supporti aggiunto finché le cellule sono pronte per essere placcato. Dopo rivestimento, flaconi non dovrebbe mai essere lasciata asciugare, ma può essere mantenuta in PBS o mezzi a 4 ° C per brevi periodi prima dell&#39;uso. </li></ul> 2. Strumenti e Other Materiale <ul type="disc"><li> Piastre di Petri: 4 per diga: 3 piastre di Petri per la dissezione (75 mm), un piatto di 20 mm per la raccolta dei cavi raccolte spinale. </li><li> Forbici di grandi dimensioni (43 mm forbici operativi, Roboz) e pinze dei tessuti dell&#39;addome per l&#39;apertura della diga di s. </li><li> Forbice piccola per sezionare l&#39;utero e la rimozione dei feti (15 mm Forbici Micro dissezione, Roboz). </li><li> Micro forbici a molla dissezione (6 mm) di sezionare il midollo spinale dei feti. </li><li> Micro Pinza dissezione angolate per l&#39;ancoraggio del corpo diga e fetale durante l&#39;intervento chirurgico e in seguito la rimozione del midollo spinale, una volta esposta. </li><li> 40 o 70 filtro cellule micrometro per la rimozione di detriti cellulari prima della placcatura. </li><li> Tripsina 0,05% preriscaldata a 37 ° C. </li><li> 10 mg / ml DNAse 1 (Sigma), preparato come un archivio di 100x (1 g / ml). </li><li> Bio-hazard sacco per cadaveri animali. </li><li> 15 e 50 ml provette per centrifuga per l&#39;elaborazione estratto midollo spinale. </li></ul> 3. Determinazione Timed Pregnancy Dighe del mouse in stato di gravidanza o sono ordinati da fonti commerciali che specificano la consegna il giorno embrionale E12 o E13 dello sviluppo fetale o di gravidanza, riscontrata in-house. In breve, due femmine sono messi insieme con un maschio nel tardo pomeriggio e lasciato tutta la notte insieme. Il giorno successivo le femmine sono osservate per la presenza della spina muco vaginale posizione. Il tappo di muco è solo un&#39;indicazione che si sia verificato così l&#39;accoppiamento animali vengano successivamente pesati quotidianamente per monitorare la frequenza di aumento di peso. Il giorno si osserva il tappo di muco è definito come giorno uno embrionale (E1). 4. Tissue Derivazione <ol><li> Lavorare sotto una cappa a flusso orizzontale per mantenere condizioni di asetticità. </li><li> Spruzzare il cofano e la zona di lavoro con etanolo 70%. </li><li> Strumenti in autoclave o spray liberamente con il 70% di etanolo. </li><li> Preparare gli strumenti, i media, e microscopio per l&#39;uso. </li><li> Versare 20 ml di mezzo di dissezione a freddo in sterile di Petrish. </li><li> Anestetizzare animale con cloralio idrato (500 mg / kg) somministrato per via intraperitoneale (IP) seguita da dislocazione cervicale o decapitazione. </li><li> Spruzzare la zona addominale della diga con il 70-90% di etanolo (disinfezione) </li><li> Aprire addome con forbice grande e pinze. <ol type="a"><li> In CD1 e C57/BL6 ceppi: Di ​​solito da 8 a 14 feti sarà all&#39;interno dell&#39;utero. Il numero dei feti è sforzo dipendente. </li></ol></li><li> Estrarre l&#39;utero del mouse compresi i cuccioli e mettere in fresco mezzo di dissezione a freddo in un piatto pulito Petri per lavare il sangue e frammenti di tessuto dal feto. </li><li> Estrarre ogni feto dalla tromba uterina e separarli dalla placenta e il sacco embrionale con le forbici di piccole dimensioni. Trasferire i feti estratti in media dissezione fresca in un nuovo piatto Petri. <ol type="a"><li> Mezzo di dissezione deve essere a bassa temperatura per abbassare l&#39;attività metabolica e preservare la vitalità di cellule derivate. </li><li> Lavorare da ora in poi con due pinze emicro dissezione primaverili-forbici. </li></ol></li><li> Lavorare sotto il microscopio di dissezione, tagliare la pelle lungo il midollo spinale con le forbici chirurgiche e micro pelle a buccia di nuovo per esporre il midollo spinale. </li><li> Transetto il midollo spinale con le forbici microchirurgia a circa C1 e all&#39;inizio della coda. </li><li> Togliere il midollo spinale con le pinze smussate, verificare le ossa e la cartilagine sono stati rimossi e il trasferimento al 3 ° capsula di Petri di dissezione media. </li><li> Per evitare la crescita eccessiva del tessuto meningea in colture cellulari successive tenta di rimuovere il più delle meningi il più possibile dal midollo spinale. A causa delle nascenti nervi periferici sporgenti questo è più difficile rimuovere il tessuto meningeo estratto dal cervello. </li><li> Una volta meningi sono stati rimossi, trasferire midollo spinale al piatto mm 20 Petri </li><li> Pulire dal fondo spruzzando la superficie con etanolo al 70-90%. </li><li> Le seguenti operazioni per la dissociazione dovrebbe essere fatto in fretta per mantenereuno alta vitalità del tessuto derivata midollo spinale. </li></ol> 5. Istituzione Cultura <ol><li> Tripsina deve essere pre-riscaldato per almeno 30 min a 37 ° CH 2 O-bagno. Una aliquota appropriata dovrebbe essere rimosso dal magazzino per ridurre l&#39;esposizione delle scorte alle fluttuazioni di temperatura. </li><li> Trasferire le corde raccolte spinale ad un tubo da centrifuga da 50 ml contenente 10 ml preriscaldata tripsina (0,05%; qualità Biologicals) e 100 pl DNAsi (10 mg / ml) e triturare brevemente. </li><li> Incubare a 37 ° CH 2 O-bagno per 10 minuti. </li><li> Triturare e incubare per altri 10 minuti. </li><li> Aggiungere 5 ml GRP medio (definito sopra) e centrifugare per 5 min a 1000 RPM. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere pellet con 10 ml di terreno GRP e aggiungere DNAse-1 (10 mg / ml, Sigma). </li><li> Incubare a 37 ° CH 2 O-bagno per 10 minuti. </li><li> Centrifugare 5 min a 1000 RPM e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet con fresh medie GRP poi detriti filtro con un 40-70 micron filtro cell. </li><li> Piastra il PLL / laminina rivestita 25 centimetri (2 fiasche T25) e incubare a 37 ° C, 95% di umidità e 5% CO 2. </li><li> 100 media% cambia il giorno successivo. </li><li> A questo punto, GRP hanno attaccato e ha iniziato estendere i processi. </li></ol> 6. Immunopanning della popolazione GRP <ol><li> Tessuto del midollo spinale Piastra in PLL / laminina rivestite fiaschi fino a pallone è 85-90% confluenti o circa una settimana. </li><li> Cellule Harvest raschiando pallone con un poliziotto in gomma o con il 0,05% tripsina, triturare accuratamente ma delicatamente, centrifugare a 1000 rpm per 5 min e accuratamente risospendere pellet con 3 ml di terreno GRP. </li><li> Trasferire 1 ml ciascuna a 3 T25 palloni o 3 ml a 1 T75 pallone di aggiungere volumi adeguati di mezzo per coprire completamente le cellule e permettono di raggiungere palloni 80-90% di confluenza. </li><li> Variazione media ogni altro giorno, prima, se di media consuma in fretta. </li><li> Coat batteriologica Pepiatti tri (75 mm) notte a 4 ° C con un anticorpo anti-topo IgM (Southern Biotech), 10 pg / ml in PBS. </li><li> Aspirare il tampone in eccesso e lavare i piatti Petri 3x con PBS. </li><li> Aggiungere anticorpo A2B5 (Millipore) ad una concentrazione di 5 pg / ml diluito in PBS e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavare le piastre ancora una volta con PBS 3x poi aggiungere 8 ml di mezzo di GRP contro l&#39;essiccamento della piastra. </li><li> Trasferire 5 ml di terreno GRP da piastre di Petri e cellule GRP raccolto raschiando palloni con un poliziotto in gomma per staccare tutte le cellule </li><li> Triturare sospensione cellulare brevemente per rompere grumi e trasferire 5 ml di sospensione cellulare per le A2B5 rivestite piatti batteriologici Petri. </li><li> Incubare 1 ora a temperatura ambiente senza agitazione. </li><li> Dopo 1 ora supporti aspirato e piatti lavaggio 8x con PBS. </li><li> Raschiare delicatamente le cellule con un poliziotto in gomma in 2 ml GRP supporti poi il trasferimento a PLL / laminina piastre rivestite o fiaschi con un volume adeguato di mezzo di GRP. </li&gt; </ol> 7. Congelamento e conservazione di cellule derivate <ol><li> Le cellule sono raccolte da un 85-90% confluenti T25 o T75 pallone con 2 ml di tripsina 0,05%. </li><li> La tripsina viene diluito e inattivato con mezzo 8ml archivio di GRP e centrifugate a 1000 rpm per 5 min. </li><li> Pellets da T25 beute vengono risospese in 1 ml di mezzo congelamento GRP, (media archivio di GRP integrato con 10% (v / v) di DMSO e facoltativamente, FBS 20%). I granuli più grandi palloni da T75 sono diluiti due volte. </li><li> Sospensioni cellulari di 1,5 x 10 - 3 10,11,12,13 cellule vengono trasferiti in fiale criogeniche (Nalgene) e conservato durante la notte in un contenitore criogenico (Nalgene) contenente isopropanolo a -80 ° C a congelare lentamente durante la notte. </li><li> A seguito di celle di congelamento durante la notte vengono trasferite alle caselle freezer e conservati da 6 mesi a 1 anno a -80 ° C o più a lungo termine in N (l). Cellule scongelate sono tipicamente 60-80% realizzabile in funzione soprattutto della qualità del PLL / laminina rivestimento. </li></ol&gt; 8. Risultati rappresentativi CO 2 non è utilizzato per anestetizzare l&#39;animale a causa dei possibili effetti a valle sulla vitalità dei feti e, infine, le cellule derivate. Inoltre, sarà molto difficile da rimuovere completamente le meningi dal midollo spinale durante la procedura di derivazione, ma la combinazione di mezzo GRP e immunopanning eliminerà queste cellule in rapida crescita. Allo stesso modo, il midollo spinale è tutto raccolto, nonostante una maggiore concentrazione ventrale della popolazione GRP a causa della sua origine nel midollo spinale ventrale e la migrazione dorsalmente 20. Tuttavia il mezzo di GRP seleziona per il fenotipo GRP e che la popolazione è massimizzato A2B5 immunopanning. Dopo la placcatura del midollo spinale, le colture in vitro sono incubate per due passaggi o circa una settimana. Dopo 2 giorni di coltura, le cellule di morfologie differenti possono essere osservati in fiaschette per coltura dei tessuti indicanti il ​​eterogeneità della popolazione ma il mezzo GRP seleziona per il fenotipo GRP. Queste cellule sono una combinazione di A2B5 + GRP, E-NCAM + precursori neuronali ristrette (PNR) e nestina + e A2B5-neuroepiteliale cellule e possibilmente fibronectina + meningee cellule. Inoltre, i fenotipi più mature possono essere presenti che esprimono i marcatori tra cui doublecortin e Tuj1 per lineage neuronale, GFAP per gli astrociti e PDGFaR e GALC per lignaggio oligo Al fine di massimizzare altamente GRP popolazione arricchito dal pool eterogeneo di partenza (Figura 1A), le cellule possono essere a doppio immunopanned per selezionare ed eliminare le e-NCAM + cellule seguite da selezione per la A2B5 + popolazione GRP, una volta la densità delle cellule è aumentata a circa il 85-90% di confluenza in fiasche T75. Queste cellule GRP mantenere la loro capacità di diventare astrociti, pur essendo in un mezzo che seleziona per il fenotipo degli oligodendrociti in modo conseguente A2B5 immunopanning può essere necessario per mantenere una popolazione altamente arricchito GRP. Immunopanning generendimenti alleato fino al 95% A2B5 + cellule, ma per la resa ancora maggiore A2B5 perline magnetiche coniugate (Miltenyi Biotec Inc.) può essere usato per fornire una resa fino al 97%. Vigilanza nelle culture GRP le funzioni di manutenzione come ad esempio le normali modifiche multimediali ridurrà al minimo la proliferazione di non-GRP tipi di cellule. Anche in assenza di BMP-4 astrociti possono ancora essere trovati e mezzi impoverito in particolare sembra indurre la differenziazione di un fenotipo astrociti. Sebbene l&#39;integratore B27 contiene tri-iodotironina ormone (T3), vi è stata osservata alcuna tendenza a differenziarsi in oligodendrociti nella popolazione GRP, solo quando livelli più elevati di T3 vengono aggiunti al mezzo di questo fenomeno si verifica. Tuttavia, un T3 libero B27 integratore può essere sostituito se c&#39;è una preoccupazione per la contaminazione da oligodendrociti maturi (figura 1B). Queste cellule GRP possono essere facilmente identificati dalla loro morfologia di soma con 2 o 3 processi brevi ma a schermo per altri tipi di cellule che possono essere presenti, immunocytochemistry può essere eseguita per i precedentemente citati marcatori comuni tipo di sviluppo e delle cellule specifiche. Ci sarà comunemente una piccola popolazione persistente di A2B5 le cellule che sono neuroepiteliale (NEP) e capace di diventare uno GRP o PNR. Fortunatamente, le cellule sono mantenute più a lungo nel terreno GRP più è probabile che il mezzo viene selezionato per il fenotipo GRP. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" /> Figura 1. A) placcati in cellule del midollo spinale di morfologia eterogenei sono stati osservati dopo 2 giorni di coltura. B) Immunopanning GRP massimizza una popolazione altamente arricchito dal pool eterogeneo di partenza.

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord.">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li><li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity.">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li><li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-permeable+AMPA/kainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors.">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li><li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia.">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li><li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+white+matter:+clinical+and+pathophysiological+aspects.">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li><li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripotential+glial-restricted+precursor+(GRP)+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord:+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function.">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li><li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord.">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li><li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins.">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li><li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li><li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter.">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li><li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li></ol>

Questo studio è stato finanziato dal National Institute of Health [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), e R01NS028208 (MVJ)] e la Fondazione Child Neurology. Il contenuto di questo rapporto sono di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Institute of Health, DHHS. Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti per questo studio.

<p class="jove_content"&gt; Malattie del sistema nervoso centrale sostanza bianca comprende un gran numero di eziologie, tra le cause genetiche, infiammatorie, ischemica e tossici<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Mentre la sclerosi multipla e vasculopatie sono la principale causa di malattia della materia bianca negli adulti, leucomalacia periventricolare associata alla prematurità è la causa più comune di lesioni della sostanza bianca nella popolazione infantile. Al fine di delineare ulteriormente i meccanismi della malattia ulteriore studio di lignaggio ofoligodendrocytic cellule, che sono fortemente colpite dalla insulto perinatale, è necessaria. GRPs sono state isolate dal midollo spinale e roditore embrionale dimostrato di essere tripotential in natura, dando origine a oligodendrociti e due distinte popolazioni astrociti, ma non differenziano in neuroni<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Allo stesso modo, le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) derivati ​​da topi nervo ottico e alla fine il cervello embrionale o postnatale precoce ratti hanno dimostrato di maturare in oligodendrociti funzionanti nelle condizioni di appropriati mezzi<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Inoltre, fetale o adulto derivato OPC umano sono stati ulteriormente manipolato in oligodendrociti fenotipi più maturi<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Celle in vetroresina sono stati isolati sia dal midollo spinale dei ratti e E12 E13.5-13.5 nei topi. Nelle differenze di ratto sono state riportate tra le cellule GRP-dorsali e ventrali derivato nella loro risposta a condizioni che promuovono la generazione di oligodendrociti o astrociti con ventrale derivati ​​GRPs che presenta una maggiore propensione a differenziarsi in i fenotipi più maturi<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Questo può essere dovuto alla migrazione di ventrale dorsale delle cellule GRP nascenti, che potrebbero essere meno sensibile ai segnali di differenziazione. Immunopanning consente la sottopopolazione che esprime A2B5 essere isolato e raccolte per la manutenzione in coltura.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Le nostre culture del mouse in PRFV sono derivati ​​dal totale tessuto del midollo spinale che produce un eterogenea, della popolazione studiata di cellule da cui vengono selezionate le cellule in vetroresina con mezzi chimici (media) e le tecniche di base di anticorpi. Mentre i nostri studi hanno utilizzato i derivati ​​del midollo spinale di topo le cellule in vetroresina, è stato segnalato più recentemente la derivazione di cellule progenitrici derivate cervello di topo oligodendrociti, che sono anche in grado di svilupparsi in oligodendrociti maturi<sup&gt; 31</sup&gt;. Qui le cellule derivate sono inizialmente coltivate come oligospheres che l&#39;utilizzo del mezzo adeguato cultura sono manipolati in un PDGFαR arricchito +, la popolazione OPC<sup&gt; 31</sup&gt;. I nostri studi si sono concentrati sugli effetti del nostro modello di insulto ipossico-ischemico sulle cellule nello spettro lignaggio degli oligodendrociti da A2B5 + e PDGFαR in PRFV precursori della proteina basica della mielina (MBP + esprimere) oligodendrociti maturi. Infatti il ​​nostro<em&gt; In vitro</emCaratterizzazione&gt; ha dimostrato che queste cellule immature in vetroresina mature in cellule MBP che esprimono sia in monocolture o in co-colture con i neuroni corticali. Queste cellule possono essere manipolati in cultura in percorsi di differenziazione specifici per lo studio dei meccanismi coinvolti nella perinatale lesioni della sostanza bianca. Ci sono diversi modelli murini di malattie della sostanza bianca che coinvolgono le cellule del lignaggio degli oligodendrociti e la disponibilità di questa popolazione permette un&#39;indagine approfondita dei meccanismi che causano pregiudizio, come pure per esplorare l&#39;utilità delle possibili opzioni di terapia cellulare.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reattivo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-base </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Tripsina (0,05%) EDTA </td><td> Qualità biologica, Inc. </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> POLY-L-lisina HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020-1MG </td></tr><tr><td> DNasi 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

derivation of glial restricted precursors from e13 mice

Questo è un protocollo per la derivazione di gliali ristrette precursore (GRP), le cellule dal midollo spinale di feti di topo E13. Queste cellule sono i primi precursori all&#39;interno della linea cellulare oligodendrocitario. Recentemente, queste cellule sono state studiate come fonte potenziale di terapie rigeneranti nelle malattie della sostanza bianca. Leucomalacia periventricolare (PVL) è la principale causa di non-malattia genetica della sostanza bianca durante l&#39;infanzia e colpisce fino al 50% dei neonati estremamente prematuri. I dati suggeriscono una accresciuta sensibilità del cervello in via di sviluppo di ipossia-ischemia, stress ossidativo ed eccitotossicità che colpisce selettivamente nascente della sostanza bianca. Gliali precursori ristrette (GRP), cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) e gli oligodendrociti immaturi (preOL) sembrano essere i giocatori chiave per lo sviluppo della PVL e sono oggetto di studi continui. Inoltre, studi precedenti hanno identificato un sottogruppo di tessuto del SNC che ha aumentato la sensibilità al glutammato come eccitotossicitànonché uno schema di sviluppo a questa suscettibilità. Il nostro laboratorio sta studiando il ruolo dei progenitori degli oligodendrociti in cellule PVL e l&#39;uso nella fase di sviluppo GRP. Utilizziamo queste cellule derivate vetroresina in diversi paradigmi sperimentali per testare la loro risposta alle sollecitazioni selezionare coerenti con PVL. GRP cellule possono essere manipolate in vitro e in OPCs preOL per esperimenti di trapianto con il mouse i modelli PVL e in modelli in vitro di PVL-come insulti tra ipossia-ischemia. Utilizzando cellule in coltura e in studi in vitro ci sarebbe ridotta variabilità tra esperimenti che facilita l&#39;interpretazione dei dati. Cellule in coltura consente anche per l&#39;arricchimento della popolazione GRP, riducendo al minimo l&#39;impatto della contaminazione di cellule non-GRP fenotipo.

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Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Questo protocollo descrive la derivazione di precursori gliali limitati dal midollo spinale del feto e mantenute in vitro sia per trapianto o per lo studio del lignaggio oligodendrocitario.

Derivazione di precursori gliali limitati dalla E13 topi

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Views.  Johns Hopkins University. Questo protocollo descrive la derivazione di precursori gliali limitati dal midollo spinale del feto e mantenute in vitro sia per trapianto o per lo studio del lignaggio oligodendrocitario.

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Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Ricerca

Neuroscienze

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Derivazione delle Culture leptomeningi Explant da Postmortem cervello umano donatori

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Impianto di cannula in Cisterna Magna di roditori

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...