Allora perché questo protocollo è significativo? Bene, le metastasi cerebrali sono molto difficili da trattare e questo protocollo produce un modello murino clinicamente rilevante con tumori extracranici minimi. Questa tecnica consente un'analisi obiettiva della distribuzione dei farmaci e della risposta dai tumori intracranici.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che il modello è altamente riproducibile e le metastasi cerebrali si sviluppano in un tempo relativamente breve dopo l'iniezione. La progressione della malattia è simile tra gli animali, rendendo più facile per i ricercatori standardizzare gli esperimenti, le tempistiche di trattamento e gli endpoint. Il mio consiglio per i principianti è di esercitarsi con la pinza e la siringa mentre guardano attraverso il microscopio a dissezione, familiarizzando con i punti di riferimento anatomici intorno al collo e praticando il protocollo in presenza di un veterinario.
Iniziare seminando cellule tumorali BT-474 a una densità di semina di due volte 10 alle sei cellule in un pallone T-75 usando 10 millilitri di terreno di crescita completo e coltura fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 70-80% prima dell'iniezione. Il giorno dell'iniezione, scartare i terreni di crescita e lavare il monostrato cellulare con PBS due volte e aggiungere cinque millilitri di reagente di dissociazione della coltura cellulare preriscaldato. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando le cellule non si sono staccate.
Dopo cinque minuti, rimuovere il pallone dall'incubatrice e picchiettarlo delicatamente per favorire il distacco della cellula. Aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura completo contenente il 10% di FBS per estinguere l'attività del reagente di dissociazione. Risospendere delicatamente le cellule nella soluzione mediante pipettaggio per ridurre i grumi di cellule.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri e centrifugare a 180 G per tre minuti a temperatura ambiente. Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di HBSSS senza calcio e magnesio per ridurre al minimo l'aggregazione cellulare. Centrifugare la sospensione cellulare a 180 G per tre minuti a temperatura ambiente Decantare il surnatante per rimuovere il siero residuo o il reagente di dissociazione e risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di HBSS.
Posizionare un filtro cellulare da 100 micrometri su un tubo conico fresco da 50 millilitri e passare la sospensione cellulare per rimuovere i grumi cellulari. Calcolare il numero di cellule vitali usando il tripano blu e diluire la sospensione cellulare con HBSS a una concentrazione cellulare di 2,5 volte 10 alle sei cellule per millilitro. Tenere il tubo orizzontale sul ghiaccio e scuotere delicatamente il tubo periodicamente per ridurre al minimo l'aggregazione.
La sospensione cellulare può essere conservata sul ghiaccio per un massimo di sei ore. Mouse ear-punch per l'identificazione e utilizzare tagliacapelli elettrici per radere la pelliccia dalla regione del collo. Pulire i peli in eccesso dalla pelle esposta usando del nastro adesivo.
Applicare lubrificante oculare sugli occhi per prevenire l'essiccazione. Fissare delicatamente il mouse agganciando i denti incisivi superiori usando un filo fissato alla scheda chirurgica, seguito da un nastro adesivo sulle zampe anteriori e posteriori. Questo passaggio estende il corpo e mantiene il collo dritto durante la procedura.
Per la preparazione della pelle preoperatoria, pulire il collo con un antisettico topico come lo iodio povidone per ridurre il carico della microflora cutanea e rimuovere i peli sciolti. Pulire dal centro della pelle, lavorando verso l'esterno per prevenire la ricontaminazione del sito di incisione. Ripetere il processo utilizzando il 70% di etanolo ed eseguire tre cicli alternati di iodio ed etanolo per la disinfezione.
Controllare il riflesso tramite il pinch test per garantire la morte dell'anestesia prima di continuare la procedura. Stendere un drappo chirurgico sterile sull'animale. Sotto il microscopio a dissezione, praticare un'incisione verticale di 15 millimetri lungo la linea mediana nella regione del collo del topo usando le forbici, partendo da cinque millimetri sotto la mascella fino all'ingresso toracico.
Utilizzando due paia di pinze angolate, separare la pelle e le ghiandole salivari sottostanti e applicare divaricatori per mantenere esposta la trachea. Utilizzando due paia di pinze ad angolo sottile, sezionare senza mezzi termini il muscolo e il tessuto adiposo adiacente alla trachea per esporre la guaina carotide destra. La guaina carotidea è lo strato fibroso che copre l'arteria carotide comune, la vena e il nervo vago, e questo fascio può essere visualizzato dall'arteria carotide comune rosso vivo.
Cancellare un segmento dell'arteria carotide comune caudale alla biforcazione carotidea della fascia circostante e separarlo dal nervo vago e dalle vene. Isolare e cancellare la biforcazione carotidea dai nervi e dalla fascia circostanti. Posizionare una pinza fine sotto l'arteria carotide esterna e passare una sutura di seta 5-0 sotto l'arteria.
Annodare e stringere la sutura e tagliare la linea in eccesso. Posizionare una pinza fine sotto l'arteria carotide comune e passare una sutura di seta 5-0 sotto l'arteria. Legare un nodo e stringere la sutura in una posizione prossimale al sito di iniezione proposto.
Tagliare la sutura in eccesso, lasciando circa 10 millimetri della linea. Tagliare e inumidire una striscia di tergicristalli monouso a basso contenuto di lanugine di circa 10 per 5 millimetri. Piegare la striscia e posizionarla sotto l'arteria carotide nel sito di iniezione proposto.
Questo sosterrà la nave durante l'iniezione. Sul rostrale comune dell'arteria carotide al sito di iniezione proposto, posizionare una terza legatura con un nodo sciolto. Questo è stretto solo dopo l'iniezione.
Agitare delicatamente la sospensione cellulare e aspirare 200 microlitri di sospensione cellulare in una siringa da insulina con un ago da 31 gauge. Caricare la siringa nel driver della siringa collegato a un pedale attivante. Attaccare una cannula fine con un ago calibro 31 alla siringa e innescare la linea.
Controllare se l'arteria carotide è ben posizionata e pressurizzata. Utilizzando due pinze ad angolo fine, una delicatamente tesa sull'estremità della prima legatura e l'altra che tiene l'ago calibro 31, inserire lentamente l'ago con la smussatura nel lume del vaso sanguigno, facendo attenzione a non perforarlo. Iniettare lentamente 100 microlitri di sospensione cellulare preparata in precedenza nell'arteria carotide comune a 10 microlitri al secondo.
Questo consegnerà 2,5 volte 10 alle quinte cellule nel vaso sanguigno. L'iniezione di successo può essere visualizzata attraverso la pulizia del sangue dal vaso sanguigno carotideo. Sollevare delicatamente e stringere la legatura sciolta immediatamente dopo aver ritirato l'ago per evitare il riflusso e il sanguinamento.
Tagliare le suture in eccesso e rimuovere il pezzo di tergicristalli monouso a basso contenuto di lanugine inumiditi. Utilizzando una pipetta P-200, sciacquare la cavità chirurgica due volte con 150-200 microlitri di acqua sterile o soluzione salina. Dopo aver controllato i sanguinamenti, riposizionare i tessuti molli, le ghiandole salivari e la pelle sopra l'arteria carotide e la trachea.
Chiudere lo strato cutaneo dell'incisione utilizzando un portaago da sutura, una pinza e una sutura monofilamento 6-0 riassorbibile o non assorbibile in uno schema continuo. Iniettare 50 microgrammi per chilogrammo di buprenorfina e un milligrammo per chilogrammo di meloxicam tramite iniezione sottocutanea come sollievo dal dolore post-chirurgico. Spostare l'animale in una gabbia calda e pulita per riprendersi dall'anestesia.
La lectina è stata iniettata nell'arteria carotide comune dei topi con o senza legatura esterna dell'arteria carotide. Una riduzione della lectina è stata osservata nei tessuti delle guance quando l'arteria carotide esterna è stata legata. I risultati hanno mostrato che la legatura non ha avuto alcun impatto sulla consegna del cervello.
La progressione del tumore è stata monitorata utilizzando la linea cellulare di carcinoma mammario amplificata da luciferasi, HER2. Il modello di metastasi cerebrali BT474 ha mostrato un aumento dei segnali bioluminescenti dalla quinta settimana di iniezione carotidea interna e progressivamente è cresciuto successivamente. Dalle settimane cinque a otto, l'intensità del segnale eterogeneo indicava un tumore intracranico con perfusione fluida complessa.
La concentrazione di gadolinio all'interno della regione tumorale è aumentata man mano che fuoriusciva dalla circolazione sanguigna nel tessuto tumorale. L'accumulo di nanomedicina e metastasi cerebrali è stato confermato nei topi BT-474 da livelli di nanomedicina più elevati rilevati nella regione tumorale rispetto alle regioni cerebrali non coinvolte. Con il progredire del modello di metastasi cerebrale BT-474, gli animali hanno iniziato a perdere fino al 20% del peso corporeo, rendendo il tempo di sopravvivenza mediano nove settimane dopo l'iniezione.
I risultati istologici hanno descritto che i tumori erano localizzati unilateralmente, corrispondendo al sito di iniezione carotidea in cui i tumori apparivano per lo più come masse solide e solitarie. Sacche di spazi vuoti sono state frequentemente osservate e consistevano in cellule necrotiche, mentre escrescenze più piccole erano presenti anche in alcuni animali. La cosa più importante da ricordare quando si tenta il protocollo è preparare e posizionare correttamente l'arteria carotide prima di inserire l'ago, e quindi applicare la giusta tensione durante l'inserimento dell'ago.
Questo modello è utile per i ricercatori che esplorano la somministrazione di farmaci al cervello e l'efficacia delle nuove terapie per il trattamento delle metastasi cerebrali.
