Questo protocollo consente al ricercatore di monitorare l'attività e la risposta di singoli neuroni sensoriali a una stimolazione controllata in una vertebra comportamentale intatta. Questa elettrofisiologia patch è un modo rapido e diretto per registrare dall'attività di spiking dei singoli neuroni in tempo reale. E questo fornisce una migliore risoluzione del tempo e sensibilità a un costo inferiore rispetto alla maggior parte delle tecniche di imaging ottico.
Le cellule ciliate della linea laterale sono omologhe a quelle dell'orecchio interno umano. Quindi questa tecnica è pronta a rivelare le proprietà dei circuiti delle cellule ciliari che si applicano alla sordità umana e ai disturbi dell'udito. L'elettrofisiologia è un mestiere che utilizza abilità motorie fini che devono essere viste e imitate fisicamente.
Solo le istruzioni di testo lasciano troppo spazio per interpretazioni errate. Per iniziare, erogare un sottile strato di elastomero siliconico auto-miscelante come Sylgard in un piatto di coltura tissutale con fondo di vetro di copertura per creare un piatto di registrazione inferiore in elastomero siliconico. Per realizzare perni di dissezione, fornire una carica negativa di cinque volt a un bicchiere da 100 millilitri di Etchant utilizzando un alimentatore CC e attaccare un filo di tungsteno all'uscita caricata positivamente.
Immergere ripetutamente la punta del filo nel bagno dell'incisione fino a quando la punta si restringe a un punto acuto. Al microscopio stereo, tagliare il filo a circa un millimetro dalla punta con una lama di rasoio a bordo dritto. Ripetere questa ripetizione tre volte, quindi inserire i perni nella scheda di registrazione stagionata utilizzando pin fini.
Per preparare gli elettrodi di registrazione, tirare i tubi capillari in vetro borosilicato utilizzando un estrattore di micropipette con filamento a scatola. L'elettrodo dovrebbe avere una punta di 30 micrometri di diametro con un cono che verrà utilizzato per registrare i neuroni afferenti dalla linea laterale posteriore. Tirare un ulteriore tubo capillare in vetro borosilicato in una coppia di elettrodi con diametri di punta da uno a cinque micrometri più piccoli.
Tenendo un elettrodo in ogni mano, far scorrere delicatamente le punte l'una sull'altra per rompere le punte. Utilizzando una microforgia, lucidare la punta smussata fino a quando non è liscia. Il diametro finale della punta dovrebbe essere compreso tra 30 e 50 micrometri.
Immobilizzare le larve di zebrafish e trasferirle in una piastra di petri di 35 millimetri usando una grande punta per trasferire pipetta. Rimuovere il più possibile la soluzione circostante. Immergere le larve in 10 microlitri dello 0,1% di alfa-bungarotossina per circa cinque minuti.
Lavare la larva paralizzata con soluzione extracellulare per 10 minuti. Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare la larva dal bagno della soluzione extracellulare alla piastra di registrazione con fondo silicone. Al microscopio stereo, posizionare delicatamente le larve con forcep a punta fine sopra il centro di questo tappetino in silicone, lateralmente verso l'alto con le estremità anteriore e posteriore del corpo che corrono da sinistra a destra.
Utilizzando pin a punta fine, inserire il perno del bordo ortogonalmente nel silicone attraverso il notocordo dorsale delle larve direttamente dorsale all'ano. Inserire il secondo perno attraverso il notocordo verso l'estremità della coda e inserire il terzo perno attraverso la dorsale notocordo della vescica gassoso. Inserire il quarto perno attraverso la vescicola otica fornendo una leggera rotazione mentre il perno si inserisce nell'incapsulante.
Quando viene applicata una leggera rotazione, osserva il tessuto tra il cleitro e la vescicola otica per rivelare il gruppo di somata afferente. Posizionare la larva del perno sotto l'obiettivo 10 volte su uno stadio fisso del microscopio DIC e orientare le fessure miocetali dei blocchi muscolari parallele al vettore dello stadio della testa sinistra. Posizionare il filo di terra nella soluzione del bagno e assicurarsi che sia collegato allo stadio della testa sinistra.
Riempire l'elettrodo di registrazione VR con 30 microlitri di soluzione extracellulare utilizzando una punta flessibile per pipetta a caricamento in gel e inserirlo nel supporto della pipetta del palco della testa sinistra. Aumentare l'ingrandimento a 40 volte e abbassare la pipetta di registrazione nella soluzione per piatti applicando al contempo una pressione positiva prodotta da un trasduttore pneumatico. Portare la punta dell'elettrodo su un miosiotto tra i due miomeri ventrali alla linea laterale fino a quando la fessura non è centrata nell'apertura della punta dell'elettrodo VR Abbassare la pipetta fino a quando il bordo in ritardo dell'apertura della punta contatta delicatamente l'epitelio.
Dopo il contatto iniziale, manovrare la pipetta in diagonale per assicurarsi che il bordo d'avanguardia faccia contatto e possa generare una guarnizione. Applicare la pressione negativa con il trasduttore pneumatico e tenerla. Nel software patch clamp, fare clic sul pulsante Riproduci sulla barra degli strumenti per monitorare il segnale VR.
Assicurarsi che la registrazione VR si ottiene una volta osservata l'attività del motoneurone con la dinamica del segnale burst stereotipata Wells. Riempire l'afferente elettrodo di registrazione con 30 microlitri di soluzione extracellulare e inserirlo nel supporto della pipetta del palco della testa destro. Quindi abbassarlo nella soluzione per piatti applicando una pressione positiva prodotta da un trasduttore pneumatico.
Individuare l'elettrodo e portare la punta dell'elettrodo sopra il campione. Utilizzando un micromanipolatore, abbassare la punta dell'elettrodo afferente fino a mantenere la posizione sopra il cleithrum. Aumentare l'ingrandimento a 40 volte l'immersione e individuare l'intersezione del nervo della linea laterale posteriore e del cleitro.
Portare la punta dell'elettrodo sopra il ganglio afferente e abbassare la pipetta fino a quando la punta non contatta l'epitelio. Manovrare delicatamente l'elettrodo in modo che l'intera circonferenza della punta contatti il ganglio afferente. Applicare la pressione negativa con il trasduttore pneumatico e tenerla.
Dopo aver fatto clic su Riproduci nel software di patch clamp, assicurarsi che la registrazione delle patch sciolte dell'intera cella dei neuroni afferenti si ottiene quando i picchi si verificano spontaneamente all'incirca ogni 100-200 millisecondi. Una volta rilevata l'attività del neurone e del motoneurone, fare clic sul pulsante Registra sulla barra degli strumenti nel morsetto di picco 10 per acquisire registrazioni simultanee senza gap in entrambi i canali. Eseguire la pre-elaborazione dei dati come descritto nel manoscritto testuale.
Utilizzando questo protocollo di registrazione senza gap, l'attività in tempo reale dei neuroni afferenti e VR può essere misurata contemporaneamente. Gli script di pre-elaborazione scritti personalizzati generano grafici per facilitare la visualizzazione del rilevamento dei picchi utilizzando parametri quali soglia, durata minima e intervallo minimo di interspike. I segnali isolati sono stati ottenuti regolando le variabili di rilevamento limite inferiore e superiore nello script di pre-elaborazione.
Il rilevamento dei picchi delle radici ventrali segue parametri identici con input aggiuntivi. I burst all'interno di un comando motore sono definiti da un minimo di due picchi entro 0,1 millisecondi della durata di almeno cinque millisecondi e delimitati da un minimo di tre burst con intervalli interburst inferiori a 200 millisecondi Gli script di pre-elaborazione sovrapporranno sezioni di attività afferente immesse in un periodo di interesse ben definito. In questo caso, l'attività spontanea media mostra cambiamenti drammatici in risposta all'inizio dell'attività motoria raffigurata sull'asse X come tempo uguale a zero.
Sono state rilevate differenze significative nei tassi di picco diversi tra i tassi di picco pre-nuoto e i tassi di picco sia dei periodi di nuoto che post-nuoto. I tassi di picco afferenti erano negativamente correlati con la durata del nuoto. Non viene rilevata alcuna correlazione tra velocità di picco relativa e frequenza di nuoto.
La salute degli animali è la cosa più importante quando si cerca di tentare questa procedura. È fondamentale monitorare il flusso sanguigno veloce non solo per garantire il benessere degli animali, ma anche aumentare la probabilità di successo della registrazione neurale. Sfruttando gli strumenti genetici disponibili in Zebrafish, questo protocollo di elettrofisiologia può essere integrato da linee transgeniche per indagare con forza la connettività del circuito anatomico e funzionale nei sistemi di cellule ciliate e oltre.
Questa modifica semplificata della tecnica del patch clamp ci consente di monitorare il funzionamento in vivo dei sistemi sensoriali.
