1. Preparazione di elettrodi e soluzione salina <ol><li> Preparare salina fisiologica e elettrodi prima che l&#39;animale è sezionato. La soluzione di Leech Ringer è costituito dai seguenti: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl 2, KCl 4,0 mM, Tris 10 mM / acido maleico o HEPES. Regolare il pH a 7,4. </li><li> Preparare un filo di Ag-Cl immergendo un filo d&#39;argento pulito in una piccola quantità di candeggina per 20 minuti o fino a quando il filo ha una finitura liscia grigio scuro. Lavare il filo con acqua distillata prima dell&#39;uso. Quindi, posizionare il filo in un supporto micropipetta che si collega l&#39;amplificatore. </li><li> Preparare un elettrodo di vetro tagliente di vetro borosilicato con un estrattore pipetta. La resistenza dell&#39;elettrodo dovrebbe essere dell&#39;ordine di 20 mW. </li><li> Backfill la pipetta con 3 M di acetato di potassio e inserire in nel supporto micropipetta. </li><li> Per un elettrodo extracellulare preparare una pipetta di vetro tagliente come descritto sopra, rompere la punta indietro distrofinando un altro acuto pipetta vicino al bordo tagliente. Poi il fuoco lucidare la punta in modo che non si strappi i connettivi. Elettrodi extracellulari di plastica potranno anche funzionare finché ci sia un buon contatto tra l&#39;elettrodo e il nervo. </li><li> Inserire l&#39;elettrodo extracellulare registrazione in un supporto micropipetta (con filo di Ag-Cl) che è dotato di un tubo di gomma e siringa per aspirazione. Usare la siringa per disegnare salina nel elettrodo almeno al livello del filo d&#39;argento. </li><li> Impostare l&#39;hardware (amplificatore e stimolo isolatore) e parametri di registrazione software seguendo il manuale per l&#39;unità di registrazione segnale specifico. Vedere Leksrisawat et al. 22 per vedere i dettagli sulle apparecchiature utilizzate negli esperimenti descritti di seguito. </li></ol> 2. Ventrale Ganglio Dissection <ol><li> Sezionare la sanguisuga in un grande piatto foderato elastomero di silicone con soluzione di Ringer sanguisuga. Se l&#39;animale è allungata longitudinalmente saràpiù facile rimuovere il cordone nervoso ventrale (vedere Figura 1A). </li><li> Con # 10 o # 11 dimensioni bisturi, fare una incisione longitudinale con tagli molto superficiali nella linea mediana ventrale. Circa la metà 2/3rd del taglio ventrale è mostrato in Figura 1B. Cercate di non tagliare la calza nera (ventrale seno sangue) fino a quando l&#39;animale è completamente aperto e il seno sangue è allungata senza pieghe. Questo sinusale sangue corre lungo l&#39;animale lungo la linea mediana ventrale. Il VNC è contenuto all&#39;interno di questo vaso sanguigno. </li><li> Dopo che la pelle è stata tagliata la lunghezza dell&#39;animale usare le forbici iris fine per nick seno sangue (Figura 2). Infilare una lama delle forbici iris belle sotto il seno e sollevare leggermente la lama per separarlo dal tessuto nervoso. Tagliare il seno la lunghezza del VNC evitando le radici nervose, nervi segmentale, o le connessioni tra gangli. </li><li> Quindi, rimuovere una parte del cordone nervoso ventrale datagliare le radici distali per cui il vaso sanguigno unisce le radici. Ripetere questo processo per ciascun ganglio lungo la lunghezza del cordone nervoso ventrale. </li><li> Trasferire un segmento di uno o due gangli di una piastra di Petri minore. Il gangli o il singolo ganglio deve essere appuntato teso con un certo gioco. </li><li> Pin i connettivi e le radici in modo che la guaina ganglio gliale è leggermente allungato per evitare che i corpi cellulari dei neuroni di muoversi quando impalare attraverso la guaina gliale e nel neurone di interesse. I perni devono essere posizionati attraverso il seno nero per le radici e nel mezzo dei due connettivi per minimizzare i danni degli assoni (Figura 3). </li><li> Porre la capsula Petri con preparato al microscopio e fissarlo con cera sul fondo del piatto per impedire il movimento. </li><li> Concentrarsi attentamente fascio luminoso utilizzando uno specchio e condensatore luce per vedere i neuroni come nella Figura 4A (schematicamente illustrato in Figura 4B </strong&gt;). Notare le due grandi cellule Retzius nel centro del ganglio. </li><li> Per effettuare la registrazione intracellulare del Rz, T, P e N neuroni, posizionare accuratamente la punta dell&#39;elettrodo sopra la cella di interesse e delicatamente abbassare la punta fino una fossetta è visto nella guaina gliale. </li><li> Toccare il titolare elettrodo o manipolatore (con molta attenzione) in modo che la punta dell&#39;elettrodo &quot;pop&quot; nella cella di interesse. </li><li> Iniettare impulsi brevi (30-40 msec) di corrente positiva (1-10 nA) nella cella di evocare potenziali d&#39;azione. </li></ol> 3. Coltura neuroni del ganglio Preparazione ventrale <ol><li> Pin il lato ventrale gangli in un piatto pulito contenente L-15 con siero di vitello fetale (FCS) (Figura 3). Pin le radici in modo che i gangli sono leggermente allungato come fatto in precedenza per le registrazioni intracellulari. Con forbici pregiati, nick capsula gliale ad una estremità, slip una lama forbici sotto la capsula, poi tagliare la capsula glialecome mostrato in figura 5A. </li><li> Aggiungere 100 microlitri aliquota di Collagenase / dispasi al piatto e posto su un agitatore per 15 minuti. Esaminare cellule spostando il terreno di coltura attorno ai corpi cellulari esposte. Ritorno alle cellule di shaker per altri 15 minuti o più a lungo fino a quando le cellule escono con aspirazione minima. </li><li> Utilizzare una pipetta attaccato ad una siringa per estrarre delicatamente le cellule dal ganglio. Fuoco lucidare la punta della pipetta in modo che sia leggermente più grande del diametro del corpo cellulare. Per le cellule Rz in una sanguisuga adulta, il diametro dovrebbe essere di circa 50 micron. </li><li> Preparare una varietà di pipette con diversi diametri senza filamento, questo diminuisce le probabilità di cellule sporgenti all&#39;interno della pipetta. Conservare le pipette in un flacone contenente 80% di etanolo (EtOH) utilizzando un batuffolo di cotone sul fondo per proteggere le punte da scheggiature. Ricordati di lavare il EtOH fuori della pipetta con il mezzo prima aspirazione cellule. </li><li> Dopo il trattamento enzimatico, lavare la-enzima contenente terreno con L-15 (con FCS) 2x. Identificare le cellule di interesse e aspirare lentamente nella pipetta tirando la siringa (Figura 6A). Scarico le cellule aspirati in un altro piatto che contiene L-15 (con FCS). </li><li> Fino ad ora, tutte le procedure erano non-sterile. Effettuare le seguenti operazioni in una cappa sterile. Mettere 3-4 grosse gocce di sterile L-15 (con FCS) in luoghi diversi all&#39;interno di una piastra di Petri sterile. </li><li> Pipettare le cellule in una delle gocce prima citati, soffiando loro intorno nella goccia per lavarli. Ripetere questo in serie in 3 o 4 gocce di mezzo. </li><li> Posizionare cellule in una capsula di Petri pulita riempita con L-15 (con FCS). </li><li> Incubare le cellule per 1-24 ore a temperatura ambiente. Successivamente le cellule pulite possono essere placcati. Lasciando le cellule per poche ore o durante la notte la matrice extracellulare viene via facilmente. Plate subito le celle per generare processi più lunghi. </li><li> Utilizzare substrato sterile per rivestire un micropozzetti di<html> sh e lasciarlo asciugare completamente (durante la notte), prima coltura esperimenti. </li><li> Dopo il piatto è stato rivestito, lavare il piatto delicatamente con acqua sterile e poi con una piccola quantità di mezzo L-15. Ricordarsi di utilizzare la soluzione di L-15 senza FCS memo per consentire alle cellule di aderire al piatto. Il terreno può essere leggermente modificata in L-15 con FCS dopo che le cellule hanno aderito al substrato. Se le cellule devono essere utilizzati poche ore dopo la placcatura, poi passare il mezzo di L-15 con FCS non è necessario. </li><li> Posizionare le cellule accanto all&#39;altro al momento della placcatura di indurre una rapida sinaptogenesi (Figura 6B). Dopo 24 ore provvedimento attività fisiologica in abbinamenti di neuroni. </li><li> Utilizzare tecniche elettrofisiologiche intracellulari di registrare RP o risposte sinaptiche in coppie in coltura di cellule (stimolare 1 neurone attraverso un intracellulari elettrodi e registrare le risposte dal cellulare accoppiato con un secondo elettrodo intracellulare). </li></ol>title &quot;&gt; 4. Ganglion corpo Preparazione parete <ol><li> Pin il lato sanguisuga dorsale verso il basso in un piatto foderato elastomero come descritto sopra. </li><li> Pin la pelle di un lato con radici sull&#39;altro lato del ganglio mozzata (Figura 7A, ingrandita nella Figura 7B) o fare una finestra sulla parte ventrale della sanguisuga su un ganglio (Figura 7C) con tutte le radici al corpo muro intatto. </li><li> Dopo aver ottenuto una registrazione intracellulare stabile in una delle celle sensoriali (T, p, n) utilizzare una piccola bacchetta di vetro che è stato lucidato fuoco a toccare leggermente la pelle nello stesso segmento. Se il neurone che viene registrato è una cella N quindi più pressione dovrà essere applicato sulla pelle. Nella maggior parte dei casi, la cella N risponderà soltanto se la pelle viene pizzicato con le pinzette. Per questo motivo tali cellule dovrebbero essere processati ultimo come si potrebbe danneggiare la pelle o spostare la ricodifica intracellulare disturbando il preparato in un modo. </li><li> Uno dovrebbe esseregrado di delineare rapidamente la pelle e ganglio con dettagli sufficienti che una mappa di dove si toccato può essere utilizzato per determinare il campo recettivo per un particolare neurone. Dopo la registrazione di come molte cellule T e P il più possibile su entrambi i lati di un ganglio provare le cellule N. </li><li> Per esaminare se i neuroni sensoriali hanno processi che viaggiano attraverso i connettivi in ​​modo rostrale o caudale e poi le radici nel segmento adiacente alla pelle, le connessioni tra gangli possono essere tagliati e campi recettivi riesaminati per quanto riguarda la diffusione di rilevamento. In sostanza si sta esaminando se vi è stata alcuna perdita nel settore ricettivo. </li></ol> 5. Iniezione tinture fluorescenti <ol><li> Preparare un ganglio sanguisuga come descritto sopra. </li><li> Riempire un microelettrodo con una soluzione di Lucifero giallo-CH (3,0%) e cloruro di litio (300 mM). </li><li> Infilzare una delle celle o cellule sensoriali Rz sul lato ventrale del ganglio come descrittosopra. </li><li> Iniettare colorante nella cella facendo passare corrente negativa (3na) attraverso l&#39;elettrodo per 15 min. Impostare la durata dell&#39;impulso di 100 msec e la frequenza di 2 Hz. </li><li> Visualizzare i neuroni colorante riempito eccitando il colorante con una lampada al mercurio e un set di filtri FITC / GFP. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo scopo di questa serie di esperimenti era 1) per insegnare e esporre i principi fondamentali di registrazioni intracellulari da neuroni identificabili e 2) di riconoscere le forme caratteristiche dei segnali elettrici che possono derivare da questi tipi neuronali particolari utilizzando sanguisughe adulti. C&#39;è una storia ricca di indagini utilizzando la sanguisuga per le indagini neurofisiologiche e la ricerca è in corso per affrontare questioni di circuiti neurali e regolazione genica durante lo sviluppo, così come durante la riparazione e la rigenerazione 10 sinaptica. Neuromodulazione, soprattutto attraverso percorsi di ammine biogene, è stata anche una direzione di ricerca di successo nel sanguisuga. Con l&#39;aggiunta di dopamina e di altri agenti farmacologici per il sistema nervoso attraverso la soluzione salina, è stato dimostrato che la dopamina modula reti neurali coinvolti nel processo decisionale 23 e schemi motori per la scansione comportamento 24,25. Questo approccio sperimentale è un semple (e poco costoso) modo per incorporare la modulazione nel laboratorio didattico, e regolando la composizione ionica della soluzione salina è un modo efficace per insegnare le equazioni di Nernst e di Goldman-Hodgkin-Katz. Per avere successo con i preparativi gangliari è importante avere il ganglio teso prima di tentare di colpire un soma con un elettrodo intracellulare. Altrimenti il ​​soma si sposterà quando si spinge verso il basso sul pacchetto gliali. Inoltre, quando desheathing ganglio della rimozione di neuroni per cultura, evitare la regione di interesse durante il taglio di tutti i ganglio così somas non siano danneggiati mentre sono rimossi. Inoltre, l&#39;eccessiva incubazione nella enzimi può causare neuroni troppo fragile per essere rimosso. Si richiede alcuni tentativi per ottenere un tempo di incubazione ideale perché ogni serie di enzimi è leggermente diverso nelle loro azioni. Ulteriori indagini per ottimizzare cultura dei media potrebbe migliorare questa tecnica. VariDIVERSI fattori, quali la presenza di insulina, zuccheri, o fattori di crescita possono essere esaminati per più il mantenimento di colture. Per determinare se le cellule mantengono la loro capacità di sintetizzare trasmettitori, come la sintesi della serotonina nelle cellule Rz, colorazione rosso neutro può essere applicato per etichettare processi serotoninergici. Invasione della microglia anche tessuto danneggiato e rigenerante può essere quantificato macchie nucleari giorni dopo un infortunio. Anche se questa preparazione ha molti vantaggi da offrire in esame rigenerazione e la riparazione, nonché circuiti neurali, l&#39;identificazione farmacologico e molecolare dei vari sottotipi recettoriali a livello delle sinapsi non sono state pienamente caratterizzato. Una libreria di tag di sequenze espresse è disponibile 26, e la sanguisuga medicinale genoma è attualmente in fase di montaggio 27, ma la limitazione principale sanguisuga rispetto ad alcune preparazioni modello è la possibilità di modificare il genoma di geni selettivi in tipi cellulari specifici. In embrioni tla sua limitazione è stata affrontata mediante iniezione di DNA o dsRNA per regolare l&#39;espressione genica 28. La tecnica di pistola gene è stato recentemente utilizzato per esprimere la connessina invertebrato (innexin) proteine ​​nei neuroni sanguisuga. Espressione di un innexin da Hirudo verbana (Hve-inx6) è sufficiente per la formazione di giunzioni ectopiche nel sanguisuga medicinale 29. Il-sanguisuga o medicinali H. verbena per così dire 30 è sicuro di avanzare la nostra comprensione della fisiologia e l&#39;evoluzione delle sinapsi elettriche nei prossimi anni.

La preparazione sanguisuga è utile per studiare la funzione di identificabile (sensoriali, motori e inter-neuroni all&#39;interno del sistema nervoso centrale dell&#39;animale (CNS). La proprietà utile di neuroni sanguisuga è che la forma dei loro potenziali d&#39;azione e le proprietà biofisiche sono caratteristici di dato tipo di cellula (cioè P, N, T, Rz). neuroni Inoltre possono essere rimossi dall&#39;animale e coltivate in un mezzo adeguato nel quale le cellule mantengono le loro caratteristiche elettriche per finchè 45 giorni 1,2. Un vantaggio del ganglio sanguisuga per imparare a fare registrazioni elettrofisiologiche è che le cellule sono tipicamente disposti in modo affidabile e ganglio in un modello che consente l&#39;identificazione di tipi cellulari distinti dal ganglio ganglio e da un animale all&#39;altro. La posizione unica e la morfologia dei neuroni in gangli sanguisuga sono stati notati da Retzius già nel 1891 3. Conoscenza del secoloe l&#39;identità e la funzione di un neurone è vantaggioso per indagare circuiti neurali e per fare esperimenti con un dato tipo di cellula. A causa della relativamente grande somata dei neuroni all&#39;interno di un ganglio sono visibili con un microscopio da dissezione, e la somata possono essere selettivamente infilzati con microelettrodi per registrare le loro proprietà elettriche. Coloranti e grandi molecole possono essere iniettati nelle cellule individuali e proprietà del canale studiati da patch clamp. Correnti ioniche che danno origine alle varie forme delle caratteristiche potenziali di azione in vari neuroni sono stati individuati 4-7. Dalle indagini nel modello di innervazione e la ramificazione dei neuroni individuali all&#39;interno del sistema nervoso centrale, le connessioni sinaptiche sono state riprodotte in coltura con neuroni identificati 2,8. Studi nei gangli sanguisuga hanno fornito sull&#39;attuale sviluppo di circuiti funzionali che può essere misurata con elettrofisiologia nonché con Whole comportamento animale studi. La sanguisuga CNS ha anche servito come preparazione prezioso per indagare i meccanismi coinvolti con la riparazione e la rigenerazione neuronale in tutto l&#39;animale e nella cultura 4-6,9-12. Nel cervello dei mammiferi si tratta di un compito arduo per spiegare il comportamento in termini di proprietà e collegamenti di singoli neuroni identificati. In linea di principio si può sperare che lo studio dei sistemi meno complessi come la sanguisuga potrebbe contribuire a definire meccanismi di base utilizzati negli animali superiori. Le connessioni che vengono utilizzati che sottendono un modello nuotata 13,14 e ritmicità del cuore 15 sono stati ben caratterizzati nel sanguisuga. La capacità di alcuni neuroni sanguisuga per formare sia la comunicazione elettrica e chimica è intrigante. Alcune connessioni sono bidirezionali, mentre altri sono unidirezionali chimicamente ma bidirezionale elettricamente 7. Comprendere le connessioni sinaptiche all&#39;interno l&#39;animale così come ricreare lo stesso tipe di connessioni in una capsula di Petri sono strumenti potenti per indagare synaptogenesis 16-18 nonché profilazione farmacologico delle sinapsi 19. Le tecniche di registrazione e stimolazione intracellulari qui descritti forniscono una base per test farmacologici e ricerche in neuroetologia e sviluppo. Inoltre, il cordone nervoso ventrale segmentale può essere sezionato con una zona di pelle innervato. Con la capacità di mantenere una zona di pelle e neuroni vivi, campi recettivi sensoriali possono essere sondati registrando segnali elettrici dal corpo cellulare (cioè soma) dei neuroni sensoriali all&#39;interno rispettiva ganglio addominale nel SNC. In tal modo si può valutare la sensibilità delle terminazioni sensoriali applicando vari gradi di forza sulla pelle e mappare i campi recettivi: tocco leggero, pressione e nocivi (doloroso) stimoli 20,21. Un vantaggio di questa sanguisuga preparazione ganglio-pelle è che una can disegnare anatomicamente il campo cartina ricettivo e tracciare i processi neuronali al neurone identificato una volta che le risposte elettriche vengono registrate. I tre esperimenti sanguisuga descritte di seguito possono essere completati più volte con un solo esemplare, che rende questo un modulo didattico conveniente per laboratori accademici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="256">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td style="width:64px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:64px;">&#160;182 silicone kit</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C5670&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris/maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bleach&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>To chloride silver wire</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;221465&#160;</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">CULTURING MATERIALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Boehringer Mannheim&#160;</td>
			<td>&#160;269-638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leibovitz L-15 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>041-01415H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Ready Systems Ag&#160;</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">04-001</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:102px;">D-Glucose-Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gentamycin sulfate&#160;</td>
			<td>any&#160; supplier</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>043-0503H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3375</td>
			<td>Free acid, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Concanavalin A Type IV</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P 7890</td>
			<td>MW 15-30,000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;Microwell plate, 60 x 10 &#956;l</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3034</td>
			<td>Flat bottom, 10 in a bag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Intracellular electrode probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>&#160;26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting microscope (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fiber optic lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Small adjustable mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To direct light beam toward the preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, Suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;MD4-M3-R</td>
			<td>&#160;Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Raised preparation stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>&#160;782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>&#160;27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass tools&#160;</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pipettes with bulbs&#160;</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Plastic tip for suction electrode</td>
			<td rowspan="2">local hardware store (Watt&#8217;s brand)</td>
			<td rowspan="2">&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis

La sanguisuga d&#39;acqua dolce, Hirudo medicinalis, è un organismo modello versatile che è stato usato per affrontare le questioni scientifiche nei campi della neurofisiologia, neuroetologia e biologia dello sviluppo. L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di consolidare tecniche sperimentali dal sistema sanguisuga in un unico articolo che sarà utile a fisiologi con esperienza in altre preparazioni del sistema nervoso, o agli studenti di biologia con poca o nessuna esperienza di elettrofisiologia. Dimostriamo come sezionare la sanguisuga per la registrazione intracellulare dai circuiti neurali individuate nel ganglio. Successivo mostriamo come cellule individuali di funzione nota possono essere rimossi dal ganglio essere coltivate in una piastra di Petri e come registrare da quei neuroni in coltura. Allora dimostriamo come preparare una zona di pelle innervata da utilizzare per la mappatura campi sensoriali o motorie. Queste preparazioni sanguisuga sono ancora ampiamente utilizzati per affrontare le proprietà elettriche di base di networ neuraleks, il comportamento, sinaptogenesi, e lo sviluppo. Sono anche un modulo di formazione adeguata per le neuroscienze o fisiologia laboratori didattici.

Registrazioni intracellulari da neuroni sensoriali del ganglio sanguisuga si caratterizzano per le loro distinte tracce di tensione-tempo mostrati in figura 4C. Il potenziale di membrana cellulare nelle cellule gangliari sanguisuga sani è -45 a -60 mV. Se potenzialità sono più piccoli (meno negativo) si deve cambiare l&#39;elettrodo di vetro, o se il potenziale è ancora bassa, passare ad un altro segmento del cordone nervoso. Potenziali d&#39;azione spontanei con piccola ampiezza possono indicare che l&#39;elettrodo è in un motoneurone. Se questo accade nella parete ganglio-corpo di iniezione di corrente può essere utilizzata per determinare se il neurone innerva qualsiasi muscoli ancora attaccato alla pelle. Il motoneurone anello erettore (AE) si trova sul lato ventrale del ganglio (Figura 4B) e farà sì che il annuli (creste o segmenti) a salire attivando il muscolo erettore anello. Iniettando corrente nelle cellule sensoriali dovrebbe evocare potenziale d&#39;aziones con le forme d&#39;onda caratteristiche mostrate nella Figura 4C. Se le forme d&#39;onda aspetto diverso potrebbe essere dovuto ad un ponte sbilanciato o risarcimento capacità offset. Si dovrebbe consultare il manuale che accompagna l&#39;unità di acquisizione del segnale per i dettagli su come bilanciare il ponte all&#39;interno di una cella. Notate i manufatti di stimolo all&#39;inizio e alla fine degli impulsi di corrente in figura 4C. In questo modo i manufatti guardare quando il ponte è bilanciato. Colture primarie di neuroni del ganglio sanguisuga formano sinapsi elettriche e chimiche nel piatto. Inizialmente le proprietà elettriche delle cellule coltivate non sono esattamente le stesse come siano in vivo. Tuttavia dopo pochi giorni gli impulsi sono quasi indistinguibili da quelli registrati nel ganglio. Questo è dimostrato in Figura 6C con una coppia di celle Rz. Dopo 7 ore nella cultura l&#39;ampiezza dei potenziali sinaptici era 1-2 mV. Dopo 56 ore di cultura sypotenziali naptic erano più grandi di 10 mV (top tracce nella Figura 6C). La forma del potenziale d&#39;azione cambia anche dopo 56hr in coltura. Nelle condizioni descritte queste cellule sono vitali per diversi giorni. Comunicazione intercellulare può essere dimostrata stimolando le radici nervose o connettivi e registrazione da neuroni nel ganglio. Stimolare questi nervi genera potenziali sinaptici robusti e potenziali di azione in diverse cellule gangliari. Tracce in Figura 8B sono stati registrati da una cella Retzius in un ganglio che era stato rimosso dall&#39;animale e riposto in un piatto. La traccia nera era evocato da uno stimolo sottosoglia applicato con un elettrodo extracellulare al connettivo. Aumentando la tensione di stimolo causato la cella di sparare un potenziale di azione (traccia rossa). Coloranti o perossidasi di rafano fluorescente può essere iniettato queste cellule per studiare la loro morfologia. Lucifero giallo è stato iniettato in un Rzneurone facendo passare una corrente attraverso l&#39;elettrodo negativo. Un&#39;alternativa è quella di iniettare il colorante utilizzando sbuffi di pressione dell&#39;aria. Figura 9A mostra il colorante poco dopo l&#39;inizio della iniezione. Trenta minuti dopo la tintura era già diffuso nelle radici nervose (Figura 9B). Il tipo di colorante dipende dall&#39;applicazione, ad esempio, piccoli coloranti peso molecolare che possono passare attraverso giunzioni gap sono utilizzati per identificare sinapsi elettriche. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. . Ventrale dissezione sanguisuga (A) L&#39;animale è completamente bloccato lato ventrale in un piatto foderato elastomero riempito con soluzione salina sanguisuga (B) A un&#39;incisione poco profonda che attraversa la parte anteriore:. L&#39;asse posteriore è fatta solo lateralmente alla linea mediana per evitare di danneggiare il nervo cavo. Il seno sangue nero (che contens il cordone nervoso ventrale) può essere facilmente visibile. Nota quello ganglio esposto che è bianco rispetto alla guaina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Dissezione del seno nero. Vaso sanguigno (freccia) deve essere attentamente tagliato su un lato per esporre il cordone nervoso ventrale (doppia freccia). Lasciare segmenti del vaso sanguigno intatti intorno alle radici segmentale per l&#39;uso come maniglia per manipolare il cordone nervoso ventrale durante il trasferimento tra dissezione e piatti registrazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3"fo: content-width = &quot;3tra&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; width = &quot;400px&quot; /&gt; Figura 3. Sezione isolata del cordone nervoso ventrale. Innesto del cordone nervoso ventrale dai frammenti dei vasi sanguigni rimanenti sulle radici segmentale e alle estremità dei connettivi segmentale espone gangli per registrazioni elettrofisiologiche. Un tesa stiramento dei gangli permette di vedere i corpi cellulari identificabili e permetterà una più facile penetrazione della guaina gliali con un elettrodo di vetro tagliente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Anatomia cellulare del ganglio sanguisuga. (A) Idealmente le cellule Retzius (R) e di altri organismi a grandi cellule (P-pressure, T-touch, N-nocicettivo, AE-anello erettore) sarà chiaramente visibile se il microscopio e il condensatore di luce siano impostate correttamente. (B) Rappresentazione schematica delle cellule del ganglio. Lievi differenze nella posizione dei somas avverrà in ogni ganglio a causa di come il ganglio è allungata e appuntato tesa. Potenziali (C) Azione registrati dalla soma di questi neuroni sono forme d&#39;onda caratteristici. Questi picchi sono stati evocati iniettando corrente positiva nella cella (impulso quadrato sovrapponendo la tensione in tempo le tracce). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Desheathing ganglio per rimuovere i corpi cellulari individuali. (A) La guaina glialedovrebbe essere attentamente tutto il taglio del ganglio per evitare di danneggiare le cellule di interesse. La linea rossa indica un taglio per evitare di colpire la soma dei neuroni Rz. Apertura della guaina dà gli enzimi digestivi accedere alla matrice del tessuto connettivo. (B) corpi cellulari sani sporgenza fuori del ganglio dopo la guaina gliale è stato aperto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Coltura neuroni del ganglio sanguisuga. (A) Le cellule vengono aspirati dal ganglio utilizzando una micropipetta e trasferiti in un piatto contenente cultura mediatica. (B) Collocamento più celle uno vicino all&#39;altro aumenterà il tasso di synaptogenesis tra i neuroni identificabili. Qui la stumps di due neuroni hanno formato una sinapsi. (C) I neuroni in coltura mostrano leggermente diverse proprietà elettriche. Le prime tracce mostrano potenziali sinaptici evocati stimolando l&#39;adiacente cella di 7 ore e 56 ore dopo che le cellule sono state placcate. Le tracce peggiori sono stati evocati iniettando corrente direttamente in una delle celle Rz. Si noti l&#39;aumento di ampiezza potenziale sinaptica e cambiare nel potenziale della forma d&#39;onda azione dopo 56 ore di cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. La sanguisuga ganglio-corpo la preparazione della parete per la mappatura campi recettivi. (A) Un approccio è quello di rimuovere un&#39;intera sezione della parete corpo con 1-3 gangli. Qui le radici da un lato hanno btaglio EEN e il ganglio è stato appuntato fuori al lato. (B) Un appuntato su ganglio a più alto ingrandimento. (C) Un altro approccio è quello di creare una piccola finestra nella parete del corpo e registrare dai gangli intatta, mentre la mappatura di un campo recettivo . (DG) Ciascuno dei neuroni sensoriali presenta una caratteristica di risposta ad uno stimolo meccanico. (D) Un tocco leggero evoca l&#39;attività delle cellule T ma non in P o N celle. (E) La risposta delle cellule T chiude in risposta alla forte stimoli, dando modo di attivazione della cellula P. Come lo stimolo diventa più forti le cellule N diventa attivo (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figure 8. evocato attività nel ganglio sanguisuga. stimolazione extracellulare dei connettivi può essere utilizzato per pilotare la trasmissione sinaptica nel cordone nervoso. (A) Questo viene fatto collegando un elettrodo di aspirazione ad uno dei connettivi e applicando una piccola tensione. L&#39;elettrodo di vetro tagliente (freccia) può essere visto impalare una cella Retzius nel ganglio. (B) tracce di tensione-tempo che mostra il manufatto stimolo seguita da un potenziale sinaptico (nero) e un potenziale d&#39;azione (rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire immagine</a> . <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> Figura 9. Iniezione di colorante in neuroni di sanguisuga. (A) Lucifero gialla può essere iniettato nel soma facendo passare corrente through il microelettrodo registrazione. Una lampada al mercurio e il filtro FITC insieme possono poi essere utilizzati per visualizzare la fluorescenza. (B) Dye ha diffuso nel Rz assoni circa 30 minuti dopo l&#39;iniezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

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Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Questo articolo descrive tre preparati sistema nervoso utilizzando sanguisughe: la registrazione intracellulare dai neuroni in gangli ventrale, coltura neuroni dei gangli ventrale, e la registrazione da una zona di pelle innervata per mappare i campi sensoriali.

Intracellulare di registrazione, sensoriale Campo Mapping, e la coltura neuroni identificata nel Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

intracellular-recording-sensory-field-mapping-culturing-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

19.5K Views.  University of Kentucky.  Questo articolo descrive tre preparati sistema nervoso utilizzando sanguisughe: la registrazione intracellulare dai neuroni in gangli ventrale, coltura neuroni dei gangli ventrale, e la registrazione da una zona di pelle innervata per mappare i campi sensoriali. 

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Ricerca

Neuroscienze

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-imaging di traslocazione della PKC in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

La registrazione dell&#39;attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Una guida per<em&gt; In vivo</em&gt; Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em