This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Adeguati etici nazionali e istituzionali devono essere ottenuti prima di eseguire esperimenti su animali. 1 Rimozione di EDL muscoli e dei nervi <ol><li> Pesare e anestetizzare profondamente un topo adulto con isofluorane inalato usando un vaporizzatore con il 5% isofluorane più un 1,5 L / min flusso di ossigeno o di una campana di vetro con isofluorane imbevuto di cotone sul fondo. </li><li> Assicurarsi che il mouse è profondamente anestetizzato e non risponde ad un pizzico punta. Decapitare rapidamente utilizzando grandi, forbici affilate o una ghigliottina. </li><li> Fare un taglio linea mediana ventrale attraverso le costole con le forbici e rimuovere gli organi interni. </li><li> Pelle animale afferrando la pelle dal collo e tirandolo oltre i piedi. </li><li> Rimuovere le gambe tagliando sopra i fianchi e posizionare le gambe dalla pelle in un piatto con freddo (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% di CO 2) basso livello di calcio, magnesio bicarbonato alta tamponata contai soluzione salinaning in mM: 128 NaCl, KCl 1.9, 1.2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0.85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, e 10, il glucosio (pH di 7,4 ± 0,05) 16. Il basso di calcio, soluzione ad alta magnesio inibisce la trasmissione sinaptica durante la dissezione. </li><li> Posizionare le gambe lato dorsale nel piatto e pin le gambe e fianchi in giù con aghi o spilli insetti in modo che le articolazioni del ginocchio e della caviglia sono ad un angolo di 90 °. Inserire un perno su ciascuna estremità dei piedi e un pin su ciascuna delle cosce anteriore e posteriore per tenere il tessuto in posizione. </li><li> Utilizzando le forbici a molla Castroviejo, sollevare lo strato superiore del muscolo sulle cosce e fare una linea mediana tagliare per esporre il nervo sciatico direttamente sotto. Il nervo sciatico si trova appena sotto lo strato muscolare superiore e corre sopra il femore dalla sua uscita in prossimità dei fianchi finché si dirama nel peroneo comune e nervo tibiale appena prima l&#39;articolazione del ginocchio. </li><li> Rimuovere il muscolo sopra il nervo sciatico fino al Point in cui le profonde peronei immersioni ramo del nervo nel muscolo flessore lungo dell&#39;alluce (FHL) è visibile. </li><li> Utilizzando # 55 pinze, sezionare il tessuto connettivo intorno al ramo peroneo per liberarlo dalle gastrocnemio e soleo muscoli, che sono sul lato mediale della tibia. Tagliare i tendini dei muscoli gastrocnemio e soleo e rimuovere con cautela li da sotto il nervo. </li><li> Rimuovere il muscolo superficiale sulla parte laterale della tibia per esporre tre fasci distinti tendine alla caviglia-da mediale a laterale: FHL, EDL, e tibiale anteriore (TA), con l&#39;EDL nascosto sotto il TA. </li><li> Tagliare il tendine TA alla caviglia, sollevare il TA e lontano dalla EDL, e tagliare il muscolo vicino al ginocchio per rimuoverlo. </li><li> Tagliare il tendine FHL alla caviglia e sollevarlo di nuovo per raggiungere la zona in cui il nervo entra nel FHL. Tagliare appena sotto quel punto e rimuovere ~ 2/3 del muscolo FHL. </li><li> Tagliare il nervo sciatico più vicino possibile alla articolazione dell&#39;anca come posbile e striscia delicatamente via tutti i rami nervosi, tranne per il ramo peroneo profondo. </li><li> Tagliare i tendini EDL sia a caviglia e del ginocchio con grosse forbici a molla. </li><li> Utilizzando forbici affilate, rimuovere la EDL, il restante FHL e nervo dal tessuto circostante tagliando attraverso l&#39;osso della tibia al ginocchio ea metà strada attraverso la coscia. Tagliare l&#39;osso della tibia rimanente in modo che solo la EDL, parte della FHL e nervo rimangono. </li></ol> 2 Montaggio del muscolo EDL e Nerve nella Bath Tissue (Figura 1A) <ol><li> Prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento, preparare il bagno tessuto. Costantemente profumato il bagno con ossigenata (100% O 2) liquido interstiziale sintetico (SIF) contenente (in mM) 123 NaCl, 3.5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1.7 NaH 2 PO 4, 2.0 CaCl 2, 9.5 NaC 6 H 11 O ( gluconato di sodio), 5.5 glucosio, saccarosio 7,5, e 10 N -2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2-etL&#39;acido hanesulfonic (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Si raccomanda una velocità di flusso di 15-30 ml / min. Viene mostrato un bagno disponibile in commercio di 25 ml con due elettrodi stimolanti fissati al fondo della vasca, un post tessuto montato e un supporto per un regolatore di forza e lunghezza (dimensioni approssimative bagno 8,5 centimetri x 3 cm x 1 cm per le specifiche vedi tabella dei materiali / attrezzature). </li><li> Utilizzare il restante tessuto FHL per gestire l&#39;isolato muscolo-nervo e metterlo nella vasca tessuti. Inserire un piccolo pezzo di sylgard sul fondo del piatto e utilizzare un perno insetto attraverso il rimanente tessuto FHL per stabilizzare il muscolo. </li><li> Utilizzare 6-0 punti di sutura in seta per legare entrambi i tendini ed apporre una estremità al posto del tessuto e l&#39;altra al braccio di leva della forza e regolatore di lunghezza (vedi Tabella dei materiali / attrezzature per le specifiche). Utilizzare la lunghezza più piccola sutura che è pratico. Rimuovere il perno di insetti e sylgard dopo aver legato i tendini. NOTA: Per facilitare facilecollegamento alla leva braccio un piccolo pezzo di filo può essere piegato in un &quot;j&quot; gancio sagomato e fissato al braccio leva con resina epossidica. La sutura può essere legato al filo anziché infilato nel piccolo foro sul braccio leva. </li><li> Fai elettrodi di aspirazione da 16 SA vetro da prima con un estrattore micropipetta di vetro (calore = 286, Pull = 0, Velocity = 150, Tempo = 200); rompere la punta posteriore e macinare manualmente su una pietra per affilare fino a quando non vi è circa un cono 3 mm. Sciogliere la punta con un microforge al diametro interno punta desiderato tra 10 - 100 micron a seconda della zona del nervo si vuole campionare (vedi figure 1B-1C per elettrodo schematico e nella tabella dei materiali / Attrezzature per informazioni sul prodotto). </li><li> Riempire un elettrodo di vetro di aspirazione premade al filo d&#39;argento interno con SIF. </li><li> Aspirare l&#39;estremità tagliata del nervo nel elettrodo e collegarlo alla porta positivo di un amplificatore differenziale. Avvolgere l&#39;elettrodo con un argento chloridedfilo che si collega alla porta negativo della headstage. A terra il bagno SIF eseguendo un secondo filo chlorided argento dal bagno alla porta terra del headstage. Anche a terra il tubo di perfusione alla gabbia di Faraday in più punti a ridurre il rumore elettrico introdotto tramite le pompe di perfusione. </li><li> Stimolare il muscolo attraverso gli elettrodi montati su ciascun lato del muscolo nel bagno tessuto per indurre una contrazione contrazione. In alternativa posizionare un elettrodo stimolante sul tagliata del nervo. Aumentare la tensione stimolante finché si osserva una forza contrattile picco e quindi aumentare la tensione di un ulteriore 15% per raggiungere la tensione sovramassimale (0,5 di larghezza di impulso msec). Continuare le contrazioni contrazione alla tensione sopramassimale, con 10 sec di riposo nel mezzo, ma variare la lunghezza del muscolo finché una forza contrattile picco è raggiunto per trovare la lunghezza ottimale (L o) del muscolo. Tutte le rampe di lunghezza e le vibrazioni inizieranno con il muscolo in questo lengesimo. </li><li> Lasciare la preparazione muscolo-nervo rimanga nel bagno per almeno 1 ora prima della successiva raccolta dati per consentire al tessuto di raggiungere la temperatura del bagno e per la normale trasmissione sinaptica a recuperare dopo dissezione in una soluzione a basso calcio. </li><li> Per raccogliere i dati ad una temperatura diversa temperatura ambiente, posizionare una sonda di temperatura nella vasca di tessuto in prossimità del muscolo. Lentamente portare la vasca a temperatura pompando acqua riscaldata attraverso la piastra di carta igienica di base. Avvolgere argilla rilievi di riscaldamento per microonde intorno al serbatoio SIF per aiutare a mantenere una temperatura costante. </li></ol> 3 Raccolta dati <ol><li> Per identificare un afferente come afferente mandrino, registrare l&#39;attività neuronale durante le contrazioni contrazione ripetute prodotte da una tensione di stimolo 0,5 sopramassimale msec consegnato una al secondo. NOTA: Muscle afferenze mandrino devono mettere in pausa durante il 18,19 contrazione contrazione (Figura 2). </li><li> Uso dasoftware di acquisizione ta per applicare le variazioni di lunghezza a velocità diverse e diverse lunghezze. Utilizzare uno script personalizzato per automatizzare questo compito (vedi informazioni supplementari per uno screenshot dello script e le indicazioni su come personalizzare i tratti indicati). Applicare tratti rampa-and-hold di 4 sec a lunghezze tratto di 2,5%, 5%, e 7,5% o L e velocità tratto di 20, 40, o 60% o L / sec 15. NOTA: Vedere il manuale utente per forza specifica e regolatore di lunghezza per necessario fattore di conversione tensione-millimetro. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, determinare la salute dei muscoli a 24 ° C con massime contrazioni tetaniche isometriche (500 msec treno, treno frequenza 120 Hz, 0,5 di larghezza di impulso msec, tensione sovramassimale). Confrontare la forza contrattile picco a valori precedentemente riportati (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un metodo per la registrazione da afferenze dei fusi muscolari in un isolato preparazione del mouse muscolo-nervo. Abbiamo scoperto che le afferenze del mouse mandrino rispondono in modo simile a come allungare quelli di ratti, gatti e gli esseri umani 15, ed altri laboratori hanno utilizzato topi come organismi modello per studiare i neuroni sensoriali sia nel muscolo e la pelle in vitro (ad esempio 3,13) . Muscle afferenze sensoriali possono essere registrate per almeno 6-8 ore sia a 24 ° C e 34 ° C. Per ridurre al minimo la manipolazione del EDL e nervo, utilizzare la parte rimanente del FHL per gestire il tessuto quando possibile. Dopo la dissezione, attendere almeno 1 ora di iniziare la raccolta dei dati per consentire al tessuto raggiunga la temperatura del bagno e per il normale trasmissione sinaptica per recuperare. In precedenza, la salute dei muscoli è stata verificata su un sottoinsieme di muscoli utilizzati in questa preparazione determinando che la massima tetanica contractile forza generata dai muscoli è simile a quella riportata da altri all&#39;inizio e alla fine dell&#39;esperimento 15. Muscle afferenti mandrino stati identificati funzionalmente in questa preparazione, cercando per una pausa caratteristica cottura in risposta alla contrazione contrazione (figura 2), nonché gli attesi frequenza aumenta istantanei in risposta alle variazioni di lunghezza (Figura 3). Nella nostra esperienza, la maggior parte delle afferenze che un incendio in condizioni di controllo sono afferenze dei fusi muscolari. La lunghezza del nervo mantenuto in questa preparazione (~ 7 mm massimo) non è sufficientemente lungo da usare afferenti differenze di velocità di conduzione per identificare sottotipi afferenti muscolare 13. Inoltre, a differenza di gatti e gli esseri umani, le misure di sensibilità dinamica non erano in grado di distinguere chiaramente Gruppo Ia e II afferenze nei topi (per ulteriori approfondimenti vedi Wilkinson et al. 15). Altri sottotipi di afferenze (vale a dire., Gruppo III e IV) può essere identificato tramite ulteriori test funzionali in questa preparazione, per esempio con l&#39;aggiunta di sostanze come la capsaicina, ATP, o bradichinina, diminuendo bagno pH, esponendo il muscolo di ischemia, ecc 3,13,21-23 Utilizzando elettrodi di aspirazione permette l&#39;attività da più neuroni sensoriali da registrare in una sola volta, che aumenta la quantità di dati che possono essere raccolti da un singolo muscolo. Questa preparazione può essere utilizzata per misurare l&#39;effetto complessivo di una perturbazione sulle risposte popolazione di neuroni sensoriali o le risposte dei afferenti identificati. Se le forme picco sono abbastanza unici, fino a 4 neuroni sensoriali possono essere discriminati dal software (sia Spike2 (Cambridge Electronic Design) e LabChart Pro (Strumenti AD) si sono esibiti in modo simile). Nei casi in cui i neuroni non possono essere discriminati, cambiamenti nel posizionamento degli elettrodi o punta di diametro possono essere facilmente implementati. In sintesi, il topo muscolo-nervo prepar vitrozione è un semplice approccio sperimentale che può essere utilizzata per studiare le proprietà di risposta dei muscoli afferenze sensoriali per vari modelli di perturbazioni, lesioni e malattie fisico-chimiche. Inoltre, questa preparazione è ideale per sfruttare i potenti strumenti genetici disponibili nei topi, compresi gli animali transgenici e strumenti optogenetic.

I muscoli scheletrici sono innervati dai neuroni sensoriali che forniscono il sistema nervoso centrale con importanti informazioni circa l&#39;ambiente muscolo. Fusi muscolari sono altamente specializzati strutture incapsulate composte di fibre muscolari intrafusali che si trovano in parallelo con le fibre muscolari extrafusali. Mandrini sono innervati dal Gruppo Ia e II afferenze che codificano variazioni di lunghezza e il tono muscolare fibra intrafusali è regolata dinamicamente da innervano gamma motoneuroni 1. GRUPPO IB afferenze sono posizionati tra le fibre muscolari e le loro inserzioni tendinee e sono sensibili alle variazioni di forza muscolare, per esempio durante la contrazione muscolare 2. Il Gruppo Ia, Ib e II afferenze fornire un feedback propriocettivo che aiuta nel controllo motorio adeguato. Ulteriori popolazioni di afferenze muscolari situate in tutto il muscolo (gruppo III e IV) servono per segnalare metabolita accumulo, la presenza di stimoli nocicettivi, e la temperatura del muscolo <sup&gt; 3. Questa informazione sensoriale muscolare è fondamentale per mantenere l&#39;omeostasi, prevenendo danni muscolari e modulante movimento. Afferenze muscolari possono modificare i loro modelli di cottura sulla base di precedenti esperienze 4. L&#39;attivazione dei nocicettori può portare alla induzione di stati di dolore cronico 5 e segnalazione aberrante dai propriocettori del muscolo può portare a problemi di equilibrio o di movimento 6. Usiamo un caso isolato muscolo-nervo in preparazione vitro per studiare la risposta dei recettori muscolari terminazioni dei neuroni sensoriali da topi adulti di entrambi i sessi (mostrati sono risposte di 2-4 mesi C57Bl / 6 topi). Il mouse è la specie modello per gli studi di genetica nei mammiferi. Questa preparazione richiede l&#39;isolamento del ramo profondo peroneale del nervo sciatico e il muscolo estensore lungo delle dita (EDL), una contrazione muscolare rapida del gruppo peroneo trova nella parte laterale della gamba. L&#39;EDL è spesso usato per studiare le proprietà contrattili del muscolo 7-9, ha tendons che sono facili da isolare ed è abbastanza piccolo da consentire un adeguato apporto di ossigeno diffusivo a riposo e con cicli di contrazione ragionevoli 10. Altri muscoli in questo settore (per esempio, soleo e tibiale anteriore) sono di dimensioni simili e questa preparazione possono essere facilmente modificati per registrare da afferenze di questi muscoli. Un elettrodo di aspirazione è posizionato sull&#39;estremità taglio del nervo per registrare muscolo sensoriale afferente cottura. Neuroni individuali possono essere identificati e analizzati in base alla loro forma spike spike utilizzando il software di ordinamento. Stimolare elettrodi nel bagno o sul nervo può essere usato per evocare la contrazione muscolare. Lunghezza del muscolo e la forza possono essere controllati e misurati utilizzando sistemi disponibili in commercio. Simile in preparati in vitro sono stati utilizzati nei roditori per lo studio di gruppo III e IV afferenze muscolari nel ratto EDL 11, GRUPPO IA e II afferenze mandrino nel quarto muscolo punta lumbrical ratto 12 e gruppo III e IV afferenze muscolari in tegli topo plantare muscolo 13. Un sistema in vitro ha i vantaggi di accessibilità farmacologico e controllo diretto delle variabili perfusato e fisiochimiche come temperatura e pH. Un approccio in vitro elimina il potenziale in vivo confonde di anestesia e lo stato di perfusione del muscolo. Mentre la preparazione muscolo-nervo consente lo studio della risposta diretta di una perturbazione sulle afferenze, la capacità di studiare gamma modulazione efferente di sensibilità mandrino ed altre risposte integrate che è possibile con 14 in vivo o ex vivo 3 preparazioni è sacrificato come non ci sono corpi cellulari neuronali in questa preparazione. Questa preparazione è stato precedentemente utilizzato per caratterizzare la risposta di afferenze dei fusi muscolari mouse per una batteria di rampa e tenere tratti e vibrazioni ed è stato determinato che il mouse mandrino respons afferenties erano simili a quelli riportati in altre specie, come i ratti, gatti, e gli esseri umani. Risposte mandrino afferenti mouse sono risultati simili sia a 24 ° C e 34 ° C la temperatura del bagno, anche se a 34 ° C tassi di cottura assoluto sono stati più veloci e le afferenze erano più in grado di rispondere più velocemente cambia di lunghezza 15. Descriviamo di seguito come questo preparato può essere utilizzato per identificare e studiare le afferenze dei fusi muscolari. Inoltre, questa preparazione può essere facilmente modificato per studiare la risposta di altri sottotipi afferenti muscolare 13 di confrontare le proprietà di afferenze sensoriali in risposta ad uno stato di farmaco o malattia o assortiti altre variabili (ad esempio età, sesso, gene bloccato).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muscle neuroni sensoriali che innervano fusi neuromuscolari e organi tendinei del Golgi codificano lunghezza e forza modifiche essenziali alla propriocezione. Ulteriori fibre afferenti monitorare altre caratteristiche dell&#39;ambiente muscolare, tra cui metabolita accumulo, temperatura, e stimoli nocicettivi. Nel complesso, l&#39;attivazione anormale dei neuroni sensoriali può portare a disturbi del movimento o sindromi da dolore cronico. Descriviamo l&#39;isolamento della estensore lungo delle dita (EDL), muscoli e nervi per lo studio in vitro delle risposte afferenti tratto evocati nel topo adulto. L&#39;attività sensoriale viene registrata dal nervo con un elettrodo di aspirazione e singole afferenze può essere analizzato utilizzando spike software di ordinamento. Preparati in vitro consentono di studi ben controllati sulle afferenze sensoriali, senza i potenziali confonde di anestesia o di perfusione muscolare alterato. Qui si descrive un protocollo per individuare e testare la risposta delle afferenze dei fusi muscolari per allungare. È importante sottolineare che,questa preparazione supporta anche lo studio di altri sottotipi di afferenze muscolari, proprietà di risposta in seguito all&#39;applicazione di droga e l&#39;integrazione di approcci genetici potenti e modelli di malattia nei topi.

La risposta di afferenze muscolari possono essere registrati a seguito di una serie di perturbazioni, a seconda di quale afferente sottotipo è studiata. Risposte rappresentativi di afferenze dei fusi muscolari a contrazione muscolare e la rampa e tenere tratto sono mostrati qui. Per identificare un afferente come afferente mandrino, twitch contrazioni sono date una volta al secondo (0,5 larghezza di impulso msec) per vedere se c&#39;è una pausa nella cottura durante la contrazione 18,19. Figura 2 mostra una traccia di rappresentante di attività neuronale e la tensione muscolare durante queste contrazioni contrazione. Nessuna attività neuronale si osserva durante le contrazioni contrazione, come previsto per le afferenze mandrino. Se il afferente registrata era un gruppo Ib Golgi afferente organo tendine, un aumento del tasso di cottura durante la contrazione sarebbe previsto. In condizioni di controllo la maggior parte delle afferenze con schema di accensione regolare (~ 12 impulsi / sec a 24 ° C e ~ 32 impulsi / sec a 34 ° C) Sono afferenze muscolari del mandrino. Un sottoinsieme di afferenze mandrino sarà solo il fuoco durante tratto (nelle nostre mani ~ 11% delle afferenze mandrino) 15. Figura 3A mostra una traccia crudo rappresentante di due afferenze dei fusi muscolari rispondere a una rampa e tenere tratto prodotta dal regolatore di forza e lunghezza. La funzione di Spike Istogramma di LabChart viene utilizzato per identificare e analizzare la frequenza di emissione istantanea delle due neuroni singoli separatamente (Figure 3B-3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 isolata del muscolo Preparazione A) L&#39;estensore lungo delle dita (EDL) e innervano nervo sciatico sono montati in un bagno isolata tessuto perfuso con ossigenato liquido interstiziale sintetico (SIF). Un amplificatore extracellulare collegato ad un suctisu elettrodo registra l&#39;attività neurale. Un doppio forza e lunghezza controller con opportuni software-controlli e misure di forza muscolare e la lunghezza. Gli elettrodi da bagno tessuto offrono stimoli per la produzione di contrarsi o contrazioni tetaniche. Pompaggio acqua riscaldata attraverso i canali della piastra bagno interno controlla la temperatura del bagno del tessuto. B) Tirato elettrodo di aspirazione in vetro con ~ 3 millimetri punta conica. C) ingrandita rappresentazione della forma della punta ideale per l&#39;elettrodo di aspirazione che viene prodotto utilizzando un microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Mandrino afferenti Risposta a Twitch contrazione. Activit neuronaley (traccia in alto) e la tensione muscolare (traccia inferiore) da 30 contrazioni contrazione si sovrappongono con piano traccia sovrapposizione in nero. Attività afferenti pause durante la contrazione aumento della tensione indotta, che è una risposta caratteristica delle afferenze dei fusi muscolari. Staffa e freccia sopra la traccia in alto indicano il tempo durante la contrazione quando l&#39;attività è in pausa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3 Mandrino afferenti risposta a rampa e Tenere Stretch A) attività di Raw neurale di due afferenze (top trace) nel corso di una rampa e tenere premuto tratto applicato al EDL (lunghezza del muscolo mostrato nella traccia di fondo). B), frequenza di emissione istantanea (Inst. P., impulsi al secondo) dell&#39;unità espositrici attività a L o da A (mostrato in blu). C) instantanéfrequenza di emissione ous dell&#39;unità più piccola che solo gli incendi durante l&#39;allungamento (mostrato in arancione). Entrambe le unità presentano l&#39;adattamento frequenza di picco durante il tratto che è caratteristica di afferenze dei fusi muscolari 1.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscolari neuroni sensoriali sono coinvolti nella segnalazione propriocettiva e anche la relazione su eventi di stato e di pregiudizio legate metaboliche. Descriviamo un topo adulto in vitro preparazione muscolare-nervosa per gli studi sulla afferenze muscolari tratto attivato.

Un<em&gt; In Vitro</emPreparazione muscolare-nervosa&gt; Adult mouse per studiare le proprietà di cottura delle afferenze muscolari

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.8K Views.  San José State University.  Muscolari neuroni sensoriali sono coinvolti nella segnalazione propriocettiva e anche la relazione su eventi di stato e di pregiudizio legate metaboliche. Descriviamo un topo adulto in vitro preparazione muscolare-nervosa per gli studi sulla afferenze muscolari tratto attivato. 

Video: An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Studiare l&#39;integrazione degli adulti nati Neuroni

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Ricerca

Neuroscienze

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

Un<em&gt; In Vitro</emPreparazione&gt; per stimolare e registrare i programmi motori Nutrire con i movimenti fisiologici in<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In Vitro Caratterizzazione delle proprietà elettrofisiologiche di fibre afferenti coliche in ratti

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

In Vitro Test per studiare l'aggregazione della proteina Tau e lo Screening di stupefacenti

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...