Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Adeguati etici nazionali e istituzionali devono essere ottenuti prima di eseguire esperimenti su animali. 1 Rimozione di EDL muscoli e dei nervi <ol><li> Pesare e anestetizzare profondamente un topo adulto con isofluorane inalato usando un vaporizzatore con il 5% isofluorane più un 1,5 L / min flusso di ossigeno o di una campana di vetro con isofluorane imbevuto di cotone sul fondo. </li><li> Assicurarsi che il mouse è profondamente anestetizzato e non risponde ad un pizzico punta. Decapitare rapidamente utilizzando grandi, forbici affilate o una ghigliottina. </li><li> Fare un taglio linea mediana ventrale attraverso le costole con le forbici e rimuovere gli organi interni. </li><li> Pelle animale afferrando la pelle dal collo e tirandolo oltre i piedi. </li><li> Rimuovere le gambe tagliando sopra i fianchi e posizionare le gambe dalla pelle in un piatto con freddo (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% di CO 2) basso livello di calcio, magnesio bicarbonato alta tamponata contai soluzione salinaning in mM: 128 NaCl, KCl 1.9, 1.2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0.85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, e 10, il glucosio (pH di 7,4 ± 0,05) 16. Il basso di calcio, soluzione ad alta magnesio inibisce la trasmissione sinaptica durante la dissezione. </li><li> Posizionare le gambe lato dorsale nel piatto e pin le gambe e fianchi in giù con aghi o spilli insetti in modo che le articolazioni del ginocchio e della caviglia sono ad un angolo di 90 °. Inserire un perno su ciascuna estremità dei piedi e un pin su ciascuna delle cosce anteriore e posteriore per tenere il tessuto in posizione. </li><li> Utilizzando le forbici a molla Castroviejo, sollevare lo strato superiore del muscolo sulle cosce e fare una linea mediana tagliare per esporre il nervo sciatico direttamente sotto. Il nervo sciatico si trova appena sotto lo strato muscolare superiore e corre sopra il femore dalla sua uscita in prossimità dei fianchi finché si dirama nel peroneo comune e nervo tibiale appena prima l&#39;articolazione del ginocchio. </li><li> Rimuovere il muscolo sopra il nervo sciatico fino al Point in cui le profonde peronei immersioni ramo del nervo nel muscolo flessore lungo dell&#39;alluce (FHL) è visibile. </li><li> Utilizzando # 55 pinze, sezionare il tessuto connettivo intorno al ramo peroneo per liberarlo dalle gastrocnemio e soleo muscoli, che sono sul lato mediale della tibia. Tagliare i tendini dei muscoli gastrocnemio e soleo e rimuovere con cautela li da sotto il nervo. </li><li> Rimuovere il muscolo superficiale sulla parte laterale della tibia per esporre tre fasci distinti tendine alla caviglia-da mediale a laterale: FHL, EDL, e tibiale anteriore (TA), con l&#39;EDL nascosto sotto il TA. </li><li> Tagliare il tendine TA alla caviglia, sollevare il TA e lontano dalla EDL, e tagliare il muscolo vicino al ginocchio per rimuoverlo. </li><li> Tagliare il tendine FHL alla caviglia e sollevarlo di nuovo per raggiungere la zona in cui il nervo entra nel FHL. Tagliare appena sotto quel punto e rimuovere ~ 2/3 del muscolo FHL. </li><li> Tagliare il nervo sciatico più vicino possibile alla articolazione dell&#39;anca come posbile e striscia delicatamente via tutti i rami nervosi, tranne per il ramo peroneo profondo. </li><li> Tagliare i tendini EDL sia a caviglia e del ginocchio con grosse forbici a molla. </li><li> Utilizzando forbici affilate, rimuovere la EDL, il restante FHL e nervo dal tessuto circostante tagliando attraverso l&#39;osso della tibia al ginocchio ea metà strada attraverso la coscia. Tagliare l&#39;osso della tibia rimanente in modo che solo la EDL, parte della FHL e nervo rimangono. </li></ol> 2 Montaggio del muscolo EDL e Nerve nella Bath Tissue (Figura 1A) <ol><li> Prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento, preparare il bagno tessuto. Costantemente profumato il bagno con ossigenata (100% O 2) liquido interstiziale sintetico (SIF) contenente (in mM) 123 NaCl, 3.5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1.7 NaH 2 PO 4, 2.0 CaCl 2, 9.5 NaC 6 H 11 O ( gluconato di sodio), 5.5 glucosio, saccarosio 7,5, e 10 N -2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2-etL&#39;acido hanesulfonic (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Si raccomanda una velocità di flusso di 15-30 ml / min. Viene mostrato un bagno disponibile in commercio di 25 ml con due elettrodi stimolanti fissati al fondo della vasca, un post tessuto montato e un supporto per un regolatore di forza e lunghezza (dimensioni approssimative bagno 8,5 centimetri x 3 cm x 1 cm per le specifiche vedi tabella dei materiali / attrezzature). </li><li> Utilizzare il restante tessuto FHL per gestire l&#39;isolato muscolo-nervo e metterlo nella vasca tessuti. Inserire un piccolo pezzo di sylgard sul fondo del piatto e utilizzare un perno insetto attraverso il rimanente tessuto FHL per stabilizzare il muscolo. </li><li> Utilizzare 6-0 punti di sutura in seta per legare entrambi i tendini ed apporre una estremità al posto del tessuto e l&#39;altra al braccio di leva della forza e regolatore di lunghezza (vedi Tabella dei materiali / attrezzature per le specifiche). Utilizzare la lunghezza più piccola sutura che è pratico. Rimuovere il perno di insetti e sylgard dopo aver legato i tendini. NOTA: Per facilitare facilecollegamento alla leva braccio un piccolo pezzo di filo può essere piegato in un &quot;j&quot; gancio sagomato e fissato al braccio leva con resina epossidica. La sutura può essere legato al filo anziché infilato nel piccolo foro sul braccio leva. </li><li> Fai elettrodi di aspirazione da 16 SA vetro da prima con un estrattore micropipetta di vetro (calore = 286, Pull = 0, Velocity = 150, Tempo = 200); rompere la punta posteriore e macinare manualmente su una pietra per affilare fino a quando non vi è circa un cono 3 mm. Sciogliere la punta con un microforge al diametro interno punta desiderato tra 10 - 100 micron a seconda della zona del nervo si vuole campionare (vedi figure 1B-1C per elettrodo schematico e nella tabella dei materiali / Attrezzature per informazioni sul prodotto). </li><li> Riempire un elettrodo di vetro di aspirazione premade al filo d&#39;argento interno con SIF. </li><li> Aspirare l&#39;estremità tagliata del nervo nel elettrodo e collegarlo alla porta positivo di un amplificatore differenziale. Avvolgere l&#39;elettrodo con un argento chloridedfilo che si collega alla porta negativo della headstage. A terra il bagno SIF eseguendo un secondo filo chlorided argento dal bagno alla porta terra del headstage. Anche a terra il tubo di perfusione alla gabbia di Faraday in più punti a ridurre il rumore elettrico introdotto tramite le pompe di perfusione. </li><li> Stimolare il muscolo attraverso gli elettrodi montati su ciascun lato del muscolo nel bagno tessuto per indurre una contrazione contrazione. In alternativa posizionare un elettrodo stimolante sul tagliata del nervo. Aumentare la tensione stimolante finché si osserva una forza contrattile picco e quindi aumentare la tensione di un ulteriore 15% per raggiungere la tensione sovramassimale (0,5 di larghezza di impulso msec). Continuare le contrazioni contrazione alla tensione sopramassimale, con 10 sec di riposo nel mezzo, ma variare la lunghezza del muscolo finché una forza contrattile picco è raggiunto per trovare la lunghezza ottimale (L o) del muscolo. Tutte le rampe di lunghezza e le vibrazioni inizieranno con il muscolo in questo lengesimo. </li><li> Lasciare la preparazione muscolo-nervo rimanga nel bagno per almeno 1 ora prima della successiva raccolta dati per consentire al tessuto di raggiungere la temperatura del bagno e per la normale trasmissione sinaptica a recuperare dopo dissezione in una soluzione a basso calcio. </li><li> Per raccogliere i dati ad una temperatura diversa temperatura ambiente, posizionare una sonda di temperatura nella vasca di tessuto in prossimità del muscolo. Lentamente portare la vasca a temperatura pompando acqua riscaldata attraverso la piastra di carta igienica di base. Avvolgere argilla rilievi di riscaldamento per microonde intorno al serbatoio SIF per aiutare a mantenere una temperatura costante. </li></ol> 3 Raccolta dati <ol><li> Per identificare un afferente come afferente mandrino, registrare l&#39;attività neuronale durante le contrazioni contrazione ripetute prodotte da una tensione di stimolo 0,5 sopramassimale msec consegnato una al secondo. NOTA: Muscle afferenze mandrino devono mettere in pausa durante il 18,19 contrazione contrazione (Figura 2). </li><li> Uso dasoftware di acquisizione ta per applicare le variazioni di lunghezza a velocità diverse e diverse lunghezze. Utilizzare uno script personalizzato per automatizzare questo compito (vedi informazioni supplementari per uno screenshot dello script e le indicazioni su come personalizzare i tratti indicati). Applicare tratti rampa-and-hold di 4 sec a lunghezze tratto di 2,5%, 5%, e 7,5% o L e velocità tratto di 20, 40, o 60% o L / sec 15. NOTA: Vedere il manuale utente per forza specifica e regolatore di lunghezza per necessario fattore di conversione tensione-millimetro. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, determinare la salute dei muscoli a 24 ° C con massime contrazioni tetaniche isometriche (500 msec treno, treno frequenza 120 Hz, 0,5 di larghezza di impulso msec, tensione sovramassimale). Confrontare la forza contrattile picco a valori precedentemente riportati (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

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The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un metodo per la registrazione da afferenze dei fusi muscolari in un isolato preparazione del mouse muscolo-nervo. Abbiamo scoperto che le afferenze del mouse mandrino rispondono in modo simile a come allungare quelli di ratti, gatti e gli esseri umani 15, ed altri laboratori hanno utilizzato topi come organismi modello per studiare i neuroni sensoriali sia nel muscolo e la pelle in vitro (ad esempio 3,13) . Muscle afferenze sensoriali possono essere registrate per almeno 6-8 ore sia a 24 ° C e 34 ° C. Per ridurre al minimo la manipolazione del EDL e nervo, utilizzare la parte rimanente del FHL per gestire il tessuto quando possibile. Dopo la dissezione, attendere almeno 1 ora di iniziare la raccolta dei dati per consentire al tessuto raggiunga la temperatura del bagno e per il normale trasmissione sinaptica per recuperare. In precedenza, la salute dei muscoli è stata verificata su un sottoinsieme di muscoli utilizzati in questa preparazione determinando che la massima tetanica contractile forza generata dai muscoli è simile a quella riportata da altri all&#39;inizio e alla fine dell&#39;esperimento 15. Muscle afferenti mandrino stati identificati funzionalmente in questa preparazione, cercando per una pausa caratteristica cottura in risposta alla contrazione contrazione (figura 2), nonché gli attesi frequenza aumenta istantanei in risposta alle variazioni di lunghezza (Figura 3). Nella nostra esperienza, la maggior parte delle afferenze che un incendio in condizioni di controllo sono afferenze dei fusi muscolari. La lunghezza del nervo mantenuto in questa preparazione (~ 7 mm massimo) non è sufficientemente lungo da usare afferenti differenze di velocità di conduzione per identificare sottotipi afferenti muscolare 13. Inoltre, a differenza di gatti e gli esseri umani, le misure di sensibilità dinamica non erano in grado di distinguere chiaramente Gruppo Ia e II afferenze nei topi (per ulteriori approfondimenti vedi Wilkinson et al. 15). Altri sottotipi di afferenze (vale a dire., Gruppo III e IV) può essere identificato tramite ulteriori test funzionali in questa preparazione, per esempio con l&#39;aggiunta di sostanze come la capsaicina, ATP, o bradichinina, diminuendo bagno pH, esponendo il muscolo di ischemia, ecc 3,13,21-23 Utilizzando elettrodi di aspirazione permette l&#39;attività da più neuroni sensoriali da registrare in una sola volta, che aumenta la quantità di dati che possono essere raccolti da un singolo muscolo. Questa preparazione può essere utilizzata per misurare l&#39;effetto complessivo di una perturbazione sulle risposte popolazione di neuroni sensoriali o le risposte dei afferenti identificati. Se le forme picco sono abbastanza unici, fino a 4 neuroni sensoriali possono essere discriminati dal software (sia Spike2 (Cambridge Electronic Design) e LabChart Pro (Strumenti AD) si sono esibiti in modo simile). Nei casi in cui i neuroni non possono essere discriminati, cambiamenti nel posizionamento degli elettrodi o punta di diametro possono essere facilmente implementati. In sintesi, il topo muscolo-nervo prepar vitrozione è un semplice approccio sperimentale che può essere utilizzata per studiare le proprietà di risposta dei muscoli afferenze sensoriali per vari modelli di perturbazioni, lesioni e malattie fisico-chimiche. Inoltre, questa preparazione è ideale per sfruttare i potenti strumenti genetici disponibili nei topi, compresi gli animali transgenici e strumenti optogenetic.

I muscoli scheletrici sono innervati dai neuroni sensoriali che forniscono il sistema nervoso centrale con importanti informazioni circa l&#39;ambiente muscolo. Fusi muscolari sono altamente specializzati strutture incapsulate composte di fibre muscolari intrafusali che si trovano in parallelo con le fibre muscolari extrafusali. Mandrini sono innervati dal Gruppo Ia e II afferenze che codificano variazioni di lunghezza e il tono muscolare fibra intrafusali è regolata dinamicamente da innervano gamma motoneuroni 1. GRUPPO IB afferenze sono posizionati tra le fibre muscolari e le loro inserzioni tendinee e sono sensibili alle variazioni di forza muscolare, per esempio durante la contrazione muscolare 2. Il Gruppo Ia, Ib e II afferenze fornire un feedback propriocettivo che aiuta nel controllo motorio adeguato. Ulteriori popolazioni di afferenze muscolari situate in tutto il muscolo (gruppo III e IV) servono per segnalare metabolita accumulo, la presenza di stimoli nocicettivi, e la temperatura del muscolo <sup&gt; 3. Questa informazione sensoriale muscolare è fondamentale per mantenere l&#39;omeostasi, prevenendo danni muscolari e modulante movimento. Afferenze muscolari possono modificare i loro modelli di cottura sulla base di precedenti esperienze 4. L&#39;attivazione dei nocicettori può portare alla induzione di stati di dolore cronico 5 e segnalazione aberrante dai propriocettori del muscolo può portare a problemi di equilibrio o di movimento 6. Usiamo un caso isolato muscolo-nervo in preparazione vitro per studiare la risposta dei recettori muscolari terminazioni dei neuroni sensoriali da topi adulti di entrambi i sessi (mostrati sono risposte di 2-4 mesi C57Bl / 6 topi). Il mouse è la specie modello per gli studi di genetica nei mammiferi. Questa preparazione richiede l&#39;isolamento del ramo profondo peroneale del nervo sciatico e il muscolo estensore lungo delle dita (EDL), una contrazione muscolare rapida del gruppo peroneo trova nella parte laterale della gamba. L&#39;EDL è spesso usato per studiare le proprietà contrattili del muscolo 7-9, ha tendons che sono facili da isolare ed è abbastanza piccolo da consentire un adeguato apporto di ossigeno diffusivo a riposo e con cicli di contrazione ragionevoli 10. Altri muscoli in questo settore (per esempio, soleo e tibiale anteriore) sono di dimensioni simili e questa preparazione possono essere facilmente modificati per registrare da afferenze di questi muscoli. Un elettrodo di aspirazione è posizionato sull&#39;estremità taglio del nervo per registrare muscolo sensoriale afferente cottura. Neuroni individuali possono essere identificati e analizzati in base alla loro forma spike spike utilizzando il software di ordinamento. Stimolare elettrodi nel bagno o sul nervo può essere usato per evocare la contrazione muscolare. Lunghezza del muscolo e la forza possono essere controllati e misurati utilizzando sistemi disponibili in commercio. Simile in preparati in vitro sono stati utilizzati nei roditori per lo studio di gruppo III e IV afferenze muscolari nel ratto EDL 11, GRUPPO IA e II afferenze mandrino nel quarto muscolo punta lumbrical ratto 12 e gruppo III e IV afferenze muscolari in tegli topo plantare muscolo 13. Un sistema in vitro ha i vantaggi di accessibilità farmacologico e controllo diretto delle variabili perfusato e fisiochimiche come temperatura e pH. Un approccio in vitro elimina il potenziale in vivo confonde di anestesia e lo stato di perfusione del muscolo. Mentre la preparazione muscolo-nervo consente lo studio della risposta diretta di una perturbazione sulle afferenze, la capacità di studiare gamma modulazione efferente di sensibilità mandrino ed altre risposte integrate che è possibile con 14 in vivo o ex vivo 3 preparazioni è sacrificato come non ci sono corpi cellulari neuronali in questa preparazione. Questa preparazione è stato precedentemente utilizzato per caratterizzare la risposta di afferenze dei fusi muscolari mouse per una batteria di rampa e tenere tratti e vibrazioni ed è stato determinato che il mouse mandrino respons afferenties erano simili a quelli riportati in altre specie, come i ratti, gatti, e gli esseri umani. Risposte mandrino afferenti mouse sono risultati simili sia a 24 ° C e 34 ° C la temperatura del bagno, anche se a 34 ° C tassi di cottura assoluto sono stati più veloci e le afferenze erano più in grado di rispondere più velocemente cambia di lunghezza 15. Descriviamo di seguito come questo preparato può essere utilizzato per identificare e studiare le afferenze dei fusi muscolari. Inoltre, questa preparazione può essere facilmente modificato per studiare la risposta di altri sottotipi afferenti muscolare 13 di confrontare le proprietà di afferenze sensoriali in risposta ad uno stato di farmaco o malattia o assortiti altre variabili (ad esempio età, sesso, gene bloccato).

<table><tbody><tr><td>Force and Length Controller &amp;amp; Tissue Bath</td><td>Aurora Scientific, Inc.</td><td>300C-LR &amp;amp; 809B-IV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &amp;amp; Easy Load II Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07523-80 &amp;amp; EW-77200-60</td><td></td></tr><tr><td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &amp;amp; Headstage Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 1800; 700000 &amp;amp; 700500</td><td></td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; Aurora Scientific, Inc.</td><td>S88&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; 701 C</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Swift</td><td>892070</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Source</td><td>Fiberlite</td><td>Model 190</td><td></td></tr><tr><td>Analog to Digital Board</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>AD Instruments</td><td>LabChart Pro 7</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>A-M Systems</td><td>672445</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Glass</td><td>Dagan</td><td>SA16</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td></td></tr><tr><td>Isoflourane</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>18627</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Surgical Tools&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Large Dissecting Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14014-17</td><td></td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Large Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>#55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharp Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk Suture</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF&lt;br/&gt; (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium gluconate</td><td>Sigma</td><td>S2054-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S8282-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muscle neuroni sensoriali che innervano fusi neuromuscolari e organi tendinei del Golgi codificano lunghezza e forza modifiche essenziali alla propriocezione. Ulteriori fibre afferenti monitorare altre caratteristiche dell&#39;ambiente muscolare, tra cui metabolita accumulo, temperatura, e stimoli nocicettivi. Nel complesso, l&#39;attivazione anormale dei neuroni sensoriali può portare a disturbi del movimento o sindromi da dolore cronico. Descriviamo l&#39;isolamento della estensore lungo delle dita (EDL), muscoli e nervi per lo studio in vitro delle risposte afferenti tratto evocati nel topo adulto. L&#39;attività sensoriale viene registrata dal nervo con un elettrodo di aspirazione e singole afferenze può essere analizzato utilizzando spike software di ordinamento. Preparati in vitro consentono di studi ben controllati sulle afferenze sensoriali, senza i potenziali confonde di anestesia o di perfusione muscolare alterato. Qui si descrive un protocollo per individuare e testare la risposta delle afferenze dei fusi muscolari per allungare. È importante sottolineare che,questa preparazione supporta anche lo studio di altri sottotipi di afferenze muscolari, proprietà di risposta in seguito all&#39;applicazione di droga e l&#39;integrazione di approcci genetici potenti e modelli di malattia nei topi.

La risposta di afferenze muscolari possono essere registrati a seguito di una serie di perturbazioni, a seconda di quale afferente sottotipo è studiata. Risposte rappresentativi di afferenze dei fusi muscolari a contrazione muscolare e la rampa e tenere tratto sono mostrati qui. Per identificare un afferente come afferente mandrino, twitch contrazioni sono date una volta al secondo (0,5 larghezza di impulso msec) per vedere se c&#39;è una pausa nella cottura durante la contrazione 18,19. Figura 2 mostra una traccia di rappresentante di attività neuronale e la tensione muscolare durante queste contrazioni contrazione. Nessuna attività neuronale si osserva durante le contrazioni contrazione, come previsto per le afferenze mandrino. Se il afferente registrata era un gruppo Ib Golgi afferente organo tendine, un aumento del tasso di cottura durante la contrazione sarebbe previsto. In condizioni di controllo la maggior parte delle afferenze con schema di accensione regolare (~ 12 impulsi / sec a 24 ° C e ~ 32 impulsi / sec a 34 ° C) Sono afferenze muscolari del mandrino. Un sottoinsieme di afferenze mandrino sarà solo il fuoco durante tratto (nelle nostre mani ~ 11% delle afferenze mandrino) 15. Figura 3A mostra una traccia crudo rappresentante di due afferenze dei fusi muscolari rispondere a una rampa e tenere tratto prodotta dal regolatore di forza e lunghezza. La funzione di Spike Istogramma di LabChart viene utilizzato per identificare e analizzare la frequenza di emissione istantanea delle due neuroni singoli separatamente (Figure 3B-3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 isolata del muscolo Preparazione A) L&#39;estensore lungo delle dita (EDL) e innervano nervo sciatico sono montati in un bagno isolata tessuto perfuso con ossigenato liquido interstiziale sintetico (SIF). Un amplificatore extracellulare collegato ad un suctisu elettrodo registra l&#39;attività neurale. Un doppio forza e lunghezza controller con opportuni software-controlli e misure di forza muscolare e la lunghezza. Gli elettrodi da bagno tessuto offrono stimoli per la produzione di contrarsi o contrazioni tetaniche. Pompaggio acqua riscaldata attraverso i canali della piastra bagno interno controlla la temperatura del bagno del tessuto. B) Tirato elettrodo di aspirazione in vetro con ~ 3 millimetri punta conica. C) ingrandita rappresentazione della forma della punta ideale per l&#39;elettrodo di aspirazione che viene prodotto utilizzando un microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Mandrino afferenti Risposta a Twitch contrazione. Activit neuronaley (traccia in alto) e la tensione muscolare (traccia inferiore) da 30 contrazioni contrazione si sovrappongono con piano traccia sovrapposizione in nero. Attività afferenti pause durante la contrazione aumento della tensione indotta, che è una risposta caratteristica delle afferenze dei fusi muscolari. Staffa e freccia sopra la traccia in alto indicano il tempo durante la contrazione quando l&#39;attività è in pausa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3 Mandrino afferenti risposta a rampa e Tenere Stretch A) attività di Raw neurale di due afferenze (top trace) nel corso di una rampa e tenere premuto tratto applicato al EDL (lunghezza del muscolo mostrato nella traccia di fondo). B), frequenza di emissione istantanea (Inst. P., impulsi al secondo) dell&#39;unità espositrici attività a L o da A (mostrato in blu). C) instantanéfrequenza di emissione ous dell&#39;unità più piccola che solo gli incendi durante l&#39;allungamento (mostrato in arancione). Entrambe le unità presentano l&#39;adattamento frequenza di picco durante il tratto che è caratteristica di afferenze dei fusi muscolari 1.

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An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscolari neuroni sensoriali sono coinvolti nella segnalazione propriocettiva e anche la relazione su eventi di stato e di pregiudizio legate metaboliche. Descriviamo un topo adulto in vitro preparazione muscolare-nervosa per gli studi sulla afferenze muscolari tratto attivato.

Un<em&gt; In Vitro</emPreparazione muscolare-nervosa&gt; Adult mouse per studiare le proprietà di cottura delle afferenze muscolari

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

17.0K Views.  San José State University.  Muscolari neuroni sensoriali sono coinvolti nella segnalazione propriocettiva e anche la relazione su eventi di stato e di pregiudizio legate metaboliche. Descriviamo un topo adulto in vitro preparazione muscolare-nervosa per gli studi sulla afferenze muscolari tratto attivato. 

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

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Neuroscienze

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Un gruppo motore funzionale nella piastra di coltura: Co-coltura degli espianti midollo spinale e le cellule muscolari

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

Registrazione simultanea intracellulare di un motoneuroni lombare e la forza prodotta dal suo gruppo motore nel topo adulto<em&gt; In vivo</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Medicina

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative to understand the cellular and molecular changes involved in maintaining and repairing NMJs. For this purpose, we have developed a method to reliably and consistently examine regenerating NMJs in mice. This nerve injury method involves crushing the common fibular nerve as it passes over the lateral head of the gastrocnemius muscle tendon near the knee. Using 70 day old female mice, we demonstrate that motor axons begin to reinnervate previous postsynaptic targets within 7 days post-crush. They completely reoccupy their previous synaptic areas by 12 days. To determine the reliability of this injury method, we compared reinnervation rates between individual 70 day old female mice. We found that the number of reinnervated postsynaptic sites was similar between mice at 7, 9, and 12 days post-crush. To determine if this injury assay can also be used to compare molecular changes in muscles, we examined levels of the gamma-subunit of the muscle nicotinic receptor (gamma-AChR) and the muscle-specific kinase (MuSK). The gamma-AChR subunit and MuSK to are highly upregulated following denervation and return to normal levels following reinnervation of NMJs. We found a close relationship between transcript levels for these genes and innervation status of muscles. We believe that this method will accelerate our understanding of the cellular and molecular changes involved in repairing the NMJ and other synapses.

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

Il nervo del perone Metodo Injury: Un test affidabile di individuare e testare i fattori che Repair neuromuscolari giunzioni

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

In Vivo Elettrofisiologici misurazione del potenziale di azione muscolare composto da arti anteriori in modelli murini di degenerazione del motoneurone

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e super-risoluzione

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

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