National Institute of Health di Grant DA024009, DK046367 &amp; T32DA007027.

Tutto cura degli animali e le procedure sperimentali sono stati in conformità con e approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Virginia Commonwealth University. 1. Preparazione di sterili vetrini poli-D-lisina e laminina-rivestite in piastre da 24 pozzetti <ol><li> Tutte le procedure di passaggio 1 sono eseguite in condizioni sterili, sotto cappa, e con reagenti sterili. Vetrini e doppia acqua deionizzata (DDH 2 O) devono essere sterilizzati in anticipo. Preparazione delle lastre può essere fatto fino a due settimane prima dell&#39;isolamento neurone. </li><li> Sotto il cofano, utilizzare pinze sterili per posizionare vetrini autoclave a 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. </li><li> Preparare azione poli-D-lisina prima del tempo. Aggiungere 50 ml di ddH2O sterile a 5 mg di poli-D-lisina. Vortex e conservare in 3 ml aliquote a -20 ° C. Scongelare aliquote prima dell&#39;uso. </li><li> Per una concentrazione finale di 1 ml di brodo di poli-D-lisina ogni 25 cm 2: pipetta 80 microlitridi azione poli-D-lisina in cima ad ogni vetrino vetro (2 cm 2). Lasciare riposare la soluzione per 10 minuti. </li><li> Rimuovere poli-D-lisina usando il vuoto e sciacquare coprioggetto 3x con sterile DDH 2 O. </li><li> Lasciare le piastre ad asciugare per almeno 2 ore sotto il cofano. </li><li> Piastre possono essere conservati a 4 ° C o - 20 ° C prima di procedere al rivestimento laminina. </li><li> Preparare laminina magazzino prima del tempo. Scongelare laminina su ghiaccio e tenere in ghiaccio durante l&#39;uso. Diluire ad una concentrazione di 50 ug / ml; prestare attenzione alla concentrazione lot; ogni lotto sarà diverso. A seconda della concentrazione molto, circa 20 ml di DDH 2 O sarà aggiunto ad ogni flacone di laminina. Aliquota (5 ml) e conservare a -80 ° C. Scongelare aliquote sul ghiaccio prima dell&#39;uso. </li><li> Coprioggetto Cappotto con 5 mg / cm 2 laminina; pipetta 200 ml di magazzino laminina su ogni vetrino. </li><li> Incubare soluzione laminina su vetrini per 1 ora. </li><li> Aspirare rimanente soluzione laminina e risciacquare coprioggetto una volta conDDH 2 O. Evitare di raschiare superficie del coprioggetto. </li><li> Conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di due settimane. </li></ol> 2. Preparazione anticipo di Neuron Isolation Solutions <ol><li> Preparare la soluzione di Krebs (in mM: 118 NaCl, 4.6 KCl, 1.3 NaH 2 PO 4, 1.2 MgSO4, 25 NaHCO 3, 11 di glucosio, e 2,5 CaCl 2). Luogo 13,79 g di NaCl (FW 58.44), 0,686 g di KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), .289 g MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO3 (FW 84.01), 3,96 g di glucosio (FW 180,2), e 0,555 g di CaCl 2 (FW 111) in 2 L DDH 2 0. Raffreddare a 4 ° C. </li><li> Preparare sciacquare i media (F12 media con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e antibiotico / antimicotico): Per una bottiglia da 500 ml di F12 media, aggiungere 50 ml di FBS e 5 ml di antibiotico / antimicotica Liquid 100x (Gibco). </li><li> Preparare enterico neurone multimediale (Neurobasal Un supporto con B-27, 2 mM L-glutammina, 1% FBS, 10 ng / ml, Glial Neurotr DerivatoFattore ophic (GDNF), e antibiotica / antimicotica Liquid 100x). Per rendere GDNF magazzino, aggiungere 1 ml ddH2O a 10 mcg GDNF e congelare di nuovo in aliquote di 50 microlitri, conservare a -80 ° C. Per un ml fiala di supporto dei neuroni completi 50, combinare 47,5 ml Neurobasal Un supporto, 1 ml di B-27 (50x), 500 ml di FBS, 500 microlitri 200 mM L-glutammina (Gibco) 50 microlitri magazzino GDNF e 500 microlitri antibiotici / antimicotico Liquid 100x. Supporto è realizzato in piccoli lotti 50 ml per assicurare freschezza di GDNF e per evitare la contaminazione di grandi quantità di questa miscela costosi supporti cella. </li></ol> 3. Harvest longitudinale del muscolo / plesso mienterico (LMMP) Preparazione di topi <ol><li> Etici nazionali e istituzionali dovrebbero essere a posto prima di effettuare esperimenti su animali. Adulti svizzeri Webster topi di peso superiore a 25 g (in genere più di 8 settimane di età) sono alloggiati in gruppi di 6 prima di esperimenti. I tessuti di due topi sono utilizzati per l&#39;isolamento dei neuroni enterici ileali e glia e tre topi sono utilizzati perisolamento di cellule del colon. </li><li> Preparare area chirurgica. Raccogliere piccole forbici chirurgiche, pinze angolate, tamponi di cotone, tre bicchieri di vetro 200 ml, e una bacchetta di vetro / plastica (pennello). Assicurarsi che tutte le forniture vengono accuratamente lavati e risciacquati prima di utilizzare per ridurre al minimo la contaminazione. Questa fase può essere eseguita il giorno prima dell&#39;esperimento. </li><li> Collocare soluzione di Krebs su ghiaccio e bolla con carbogeno (95% di ossigeno, 5% CO 2) per almeno 30 minuti per stabilizzare il pH. </li><li> Accendere varie attrezzature e prodotti chimici caldi per stabilizzarsi a temperature desiderate; bagnomaria caldo (s) a 37 ° C, centrifuga raffreddare a 4 ° C, luogo soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e il 0,5% tripsina a bagnomaria (37 ° C ). Supporti neurone completi e risciacquare media dovrebbero rimanere refrigerato. </li><li> Posto 150 ml di ghiaccio freddo gorgogliare Krebs in tre bicchieri di vetro 200 ml etichettate &#39;sporco&#39;, &#39;pulito&#39;, e &#39;LMMP&#39;. Coppa Bubble etichettato &#39;LMMP&#39; con CARBOGEN. </li><li> A seguito di approvazione da parte del comitato etico, eutanasia mouse per dislocazione cervicale o CO 2 asfissia. </li><li> Posizionare il mouse in recumbence dorsale sulla superficie chirurgica, pelle pulita con il 70% EtOH, e sollevare la pelle addominale con pinze. Utilizzando le forbici, cavità addominale aperta e rivelare organi digestivi interni. </li><li> Rimuovere la lunghezza del tratto gastrointestinale sollevando una sezione di ileo e rivelando il suo mesentere. Snip attraverso mesentere con le forbici per rimuovere delicatamente e svelare ileo e colon, facendo attenzione a non tirare dal mesentere dell&#39;ileo / colon. </li><li> Dopo la lunghezza dell&#39;intestino viene dispiegato, rimuovere l&#39;ileo tagliando attraverso l&#39;intestino distale allo stomaco e prossimale al cieco. Nota: questa procedura può anche essere eseguita con tessuto colico rimuovendo il colon da distale a cieco al prossimale l&#39;ano. </li><li> I tessuti possono essere ulteriormente suddivisi tra colon prossimale e distale, e jejenum, e ileo. Il resto di questa procedura farà riferimento all&#39;isolamento dell&#39;ileo; tegli procedura è la stessa per l&#39;isolamento di LMMP colon. Porre l&#39;intero ileo in un contenitore di vetro con ghiaccio freddo Krebs segnato &#39;sporca&#39;. </li><li> Creare uno strumento per pulire l&#39;ileo, smussato un grosso ago 20 G con una pietra deposito e collegarlo a una grossa siringa (10 ml) contenente ghiaccio freddo Krebs. </li><li> Pulire materia fecale dal ileo sezionando l&#39;ileo in tre o più pezzi di grandi dimensioni. Rimuovere una sezione ileale dal bicchiere e posizionare l&#39;ago smussato nell&#39;estremità di un pezzo ileale. </li><li> Eseguire delicatamente Krebs attraverso la sezione dell&#39;intestino fino a quando tutta la materia fecale è rimosso in un contenitore dei rifiuti. Posizionare la sezione pulita nel contenitore di Krebs marcato &#39;pulito&#39;. Ripetere fino a quando tutta l&#39;ileo è pulito. </li><li> Per rimuovere il LMMP, tagliare l&#39;ileo in piccoli segmenti, di circa 2-4 cm. Posizionare un segmento di ileo su una bacchetta di vetro o plastica; ileo dovrebbe adattarsi snuggly ma non essere allentato o teso (~ 2 mm). Inizia la rimozione del LMMP rimuovendo delicatamente bit di mesentere ancora attachpostazioni per l&#39;(GI) del tratto gastrointestinale con una pinza. Prevenire il tratto GI di ruotare intorno canna da appuntare delicatamente il tubo per l&#39;asta con il pollice. </li><li> Separare il LMMP dal muscolo circolare sottostante; prima strofinare delicatamente il bordo della pinza lungo l&#39;intera linea in cui è stato attaccato il mesentere, da cima a fondo del segmento, creando delicatamente una lacuna nel muscolo longitudinale. Poi stuzzicare delicatamente via il muscolo longitudinale utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di Krebs. </li><li> Inizia nella parte superiore del gap nel muscolo longitudinale e stuzzicare distanza utilizzando il più leggero tratto orizzontale mentre si applica una pressione molto leggera finché il muscolo longitudinale comincia soltanto a separare dal muscolo circolare; farlo cadere l&#39;intero striscia sul punto di attacco mesentere. </li><li> Poi iniziare delicatamente per aggirare il tubo GI; muovendo dall&#39;alto verso il basso e indietro come il muscolo longitudinale viene lentamente separato dal muscolo circolare tutto intorno al tubo. Al termine, ilLMMP sarà naturalmente venire fuori il resto del tubo GI. </li><li> Posizionare la striscia sottile risultante di muscolo longitudinale nel bicchiere marcato &#39;LMMP&#39;. Ripetere per tutti i segmenti. </li><li> Dopo che tutte le strisce di LMMP sono state raccolte da un topo, ripetere la procedura per eventuali altri topi utilizzati. Sciacquare bene i bicchieri &#39;sporchi&#39; e &#39;pulito&#39; prima del riutilizzo. </li><li> Sciacquare il LMMP 3x per rimuovere la contaminazione biologica. Riempire tre 2 ml provette Eppendorf con ghiaccio freddo Krebs. Mettere le strisce LMMP nella prima provetta e centrifugare per 30 sec a 356 xg in una centrifuga refrigerata a 4 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e spostare le strisce LMMP al prossimo pulita Krebs tubo pieno. Ripetere questa procedura per ciascun tubo rimanente. </li></ol> 4. Digest LMMP <ol><li> Preparare la soluzione digestione ponendo 13 mg collagenasi di tipo 2 e 3 mg in 10 ml BSA carbogeno-gorgogliare soluzione di Krebs. </li><li> Luogo segmenti di LMMP sciacquato in soluzione di digestione e di uso SICsori desiderate ricavare LMMP in piccoli pezzi. </li><li> Digest LMMP per 60 min a 37 ° C in bagno d&#39;acqua con agitatore mentre viene delicatamente gorgogliare carbogeno. </li><li> Dopo la digestione è completa, raccogliere le cellule per centrifugazione per 8 min a 356 xg in centrifuga refrigerata a 4 ° C. </li><li> Da questo punto in avanti tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di coltura cellulare! Tutti i reagenti ei contenitori devono essere sterilizzati prima dell&#39;uso. </li><li> Durante la centrifugazione, preparare la soluzione tripsina 0,05% disponendo 1 ml riscaldato 0,25% tripsina e 4 ml di HBSS riscaldato in una provetta sterile da 50 ml di coltura cellulare. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere e scartare il surnatante. Non utilizzare un vuoto; questo probabilmente aspirare il pellet cellulare dovuto basse velocità di centrifugazione. Rimuovere con attenzione il pellet e il luogo in provetta pulita con 5 ml di soluzione di tripsina 0,05%. </li><li> Digerire cellule in soluzione tripsina 0,05% a 37 ° C bagnomaria con agitazione per 7 min. Non superare i 7 min di trattamento tripsina totale o neuroni perirà. </li><li> Neutralizzare la tripsina con 10 ml di risciacquo freddo media dopo 7 minuti di trattamento con tripsina. </li><li> Centrifugare le cellule per 8 min a 356 x g. Rimuovere ed eliminare i media. </li><li> Durante la centrifugazione, bilanciare un tratto di rete Nitex sterilizzato in cima ad una provetta sterile 15 ml di coltura cellulare. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere e scartare il surnatante. Delicatamente miscela di cellule risospendere triturando in 3 ml mezzi neuroni completi. Evitare la generazione di bolle d&#39;aria durante questa fase e tutti i futuri passi in cui miscela di cellule viene triturato. Tutti Triturazioni dovrebbe essere fatto molto delicatamente. Soluzione cella filtrante attraverso Nitex maglia in clean 15 ml di tubo di coltura cellulare. </li><li> Opzione: cella Cap tubo cultura e luogo in mixer Hula refrigerata (o qualsiasi mixer che fornisce la rotazione) con rollio delicato e ribaltamento per 30 min. Questo passaggio è facoltativo ma consigliato. </li><li> Opzionale: Dopo mixer Hula, aggiungere 2 ml di risciacquo freddo media per lavare le cellule. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione (8 min, 356 xg). Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 1.200 microlitri mezzi neuroni completi. Triturare le cellule delicatamente usando 1 ml di punta della pipetta di plastica. Non generare bolle d&#39;aria. Pipettare lentamente e delicatamente fino a quando la maggior parte dei pezzi sono interrotte e le cellule sono sospese in un liquido. </li><li> Aggiungere 750 ml di mezzi completi per ciascuno dei 12 pozzetti contenenti un vetrino di vetro pre-rivestito e aggiungere 100 microlitri della soluzione di cellule triturato. </li><li> Incubare neuroni in coltura cellulare incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Cambiare metà dei mezzi cellulari ogni 2 giorni. </li><li> I neuroni sono pronti per le registrazioni elettrofisiologiche dopo 1-2 giorni di coltura. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+cells+isolated+from+the+gut+by+immunoselection+develop+neuronal+and+glial+phenotypes+when+cultured+on+laminin.">Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin.</a> Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).</li></ol>

Gli autori dichiarano che non esistono grandi interessi in competizione.

Animali utilizzati Questo protocollo è stato ottimizzato per Swiss Webster topi. Tuttavia, questo metodo è facilmente adattabile ad altri mammiferi di piccole dimensioni quali ratti e ad altri ceppi di topi. Abbiamo effettuato con successo isolamenti preliminari con i topi C57 e del recettore μ-oppioidi knock-out. Tuttavia, è anche possibile che altri ceppi di topi possono essere problematico a causa di variazioni morfologiche nel tratto GI. Inoltre, vi sono differenze note tra ceppi di top...

Il sistema nervoso enterico (ENS) è vasta rete di nervi e glia che corre per tutta la lunghezza del tratto gastrointestinale (GI). L&#39;ENS controlla funzionalmente tutti gli aspetti della digestione, tra cui la peristalsi, l&#39;assorbimento di liquidi / secrezione, sensazione di stimoli, ecc (per una rassegna vedi 1). Esso contiene oltre 500 milioni di neuroni, più che trovato nel midollo spinale, e contiene ogni classe neurotrasmettitore presente nel cervello. Inoltre, l&#39;ENS è unico in quanto può funzionare senza riflesso input dal sistema nervoso centrale 2. Comprensione della ENS è cruciale, non solo per capire il suo normale ruolo fisiologico, ma per capire il suo coinvolgimento in una varietà di neuropatie che può essere congenito (malattia di Hirschsprung), acquisita (Chagas), secondaria a condizioni di malattia (gastroparesi diabetica), farmaco indotta (sindrome dell&#39;intestino oppiacei), oppure a causa di un infortunio (ileo postoperatorio) 1. Inoltre, i neuroni enterici possono essere un reservoir per infezioni virali (varicella zoster) 3. A causa delle sue somiglianze con il cervello e gli alti livelli di serotonina nell&#39;intestino, i farmaci volti a curare i difetti del sistema nervoso centrale spesso hanno effetti collaterali indesiderati sul ENS 2. Si osserva inoltre che molte neuropatie come il morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson mostrano cambiamenti cellulari simili nei neuroni enterici lunghi prima della loro comparsa in neuroni centrali, rendendo l&#39;ENS un modello accessibile per studiare la patogenesi di queste malattie 4. Pertanto, una conoscenza approfondita della ENS è una necessità nel capire gli stati di malattia e la prevenzione / predire gli effetti collaterali farmacologici. I neuroni del ENS sono stati tradizionalmente studiati nella cavia utilizzando preparati wholemount 5-7 o neuroni in coltura 8. Nonostante la facilità con cui i neuroni possono essere studiate in questo grande animale, questo modello ha molti limiti compresimancanza di ceppi geneticamente modificati, la mancanza di reagenti specifici per questa specie, e l&#39;alto costo associato con l&#39;ordinazione e che ospita questi soggetti. Lo sviluppo di un modello di sistema nervoso enterico murino ha il vantaggio unico di vari sistemi knock out, una vasta gamma di altre metodologie consolidate che possono essere utilizzati in combinazione con la tecnica di coltura cellulare, e la capacità di fornire una convalida per il modello cavia . L&#39;ENS è contenuto tre plessi che corrono la lunghezza del tratto gastrointestinale: l&#39;esterno myenteric plesso (tra il muscolo longitudinale e circolare) che è principalmente responsabile per le azioni peristaltici dell&#39;intestino, così come la mucosa e della sottomucosa plessi, ( trovato sotto e all&#39;interno della mucosa, rispettivamente) che controlla in gran parte l&#39;assorbimento di liquidi / secrezione e il rilevamento di uno stimolo. Questo metodo inizia con l&#39;isolamento del plesso (LMMP) preparazione muscolare / myenteric longitudinale mediante pelaturalo strato muscolare esterno del tratto GI. Questo riduce drasticamente il problema della contaminazione che sorgono quando lo strato di mucosa è coinvolta nel isolamento. Come risultato, questo processo è ideale per lo studio del controllo della motilità neuronale piuttosto che azioni secretori della ENS. Il metodo qui presentato risultati in una coltura mista dei neuroni enterici e glia. Almeno due diversi tipi di neuroni sono basate presenti sulle precedenti osservazioni elettrofisiologiche e immunocitochimica 9. La presenza di cellule gliali è estremamente vantaggiosa, in quanto non sono solo un tipo di cellula importante studiare nel loro diritto, ma contribuiscono alla sopravvivenza dei neuroni enterici 10 e di mantenere l&#39;espressione del recettore nativo sulla superficie delle cellule neuronali 11. Inoltre, carenze di glia enterica possono portare ad anomalie della motilità gastrointestinale stati di malattia, coniato 12 &#39;neuro-gliopathies&#39;. Pertanto, la cultura ENS presentata qui risultati in diversi tipi di cellule che sono maturi per le indagini. I vantaggi di questo metodo sono la facilità di isolamento, i requisiti di strumento poco costoso, e un breve periodo di tempo per padroneggiare la tecnica da parte di personale di laboratorio con esperienza. Limitazioni della metodologia includono bassa resa cella complessiva da elevati volumi di tessuto e l&#39;esclusione dei neuroni dell&#39;ENS di plexi mucosa e sottomucosa. Questa procedura sarà molto vantaggioso per gli studiosi specializzati in elettrofisiologia, immunoistochimica, PCR singola cellula, e altre metodologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12-545-82</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">P6407- 5 mg</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:171px;">CELLTREAT</td>
			<td style="width:137px;">229124</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:171px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">354 232</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:291px;">ddH2O</td>
			<td style="width:171px;"> </td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;">Can prepare in lab </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">15 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">188261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">50 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">227261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP358-212</td>
			<td style="width:79px;">MW 58.44</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP366-500</td>
			<td style="width:79px;">MW 74.55</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaH2PO4 .2H2O</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">S369-3</td>
			<td style="width:79px;">MW137.99</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">MgSO4</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M7506-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 120.4</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S6014-5KG</td>
			<td style="width:79px;">MW 84.01</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">glucose</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">D16-1</td>
			<td style="width:79px;">MW 180.16</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">CaCl22H2O</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">C5080-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 147.02</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">F12 media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">11330</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:137px;">110-001-101HI</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibiotic/antimycotic 100x liquid</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">15240-062</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Neurobasal A media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">10888</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">25030164</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)</td>
			<td style="width:171px;">Neuromics</td>
			<td style="width:137px;">PR27022</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">8940</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-812-41</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">23-400-101</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">250 ml Graduated Glass Beaker</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-100-250</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 L Glass Erlenmyer flask</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-500-2000</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Plastic rod (child&#39;s paint brush)</td>
			<td style="width:171px;">Crayola</td>
			<td style="width:137px;">05 3516</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">Carbogen</td>
			<td style="width:171px;">Airgas</td>
			<td style="width:137px;">UN 3156</td>
			<td style="width:79px;">5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">10 ml Leur-lock Syringe</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">309604</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">305167</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Collagenase type 2</td>
			<td style="width:171px;">Worthington</td>
			<td style="width:137px;">LS004174</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:291px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">American Bioanalytical</td>
			<td rowspan="2" style="width:137px;">AB00440</td>
			<td rowspan="2" style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-864-252</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Nitrex Mesh 500 &#181;M</td>
			<td style="width:171px;">Elko Filtering Co</td>
			<td style="width:137px;">100560</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Pipette Set</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">21-377-328</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharpeining Stone</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">NC9681212</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:195px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)</td>
			<td style="width:108px;">Nuaire</td>
			<td style="width:137px;">NU-425-400</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">10 L Shaking Waterbath</td>
			<td style="width:108px;">Edvotek</td>
			<td style="width:137px;">5027</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:283px;">Microcentrifuge 5417R</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">5417R</td>
			<td style="width:195px;">May use a single larger centrifuge with size adapters</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">Allegra 6 Series Centrifuge</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">366816</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">HuluMixer Sample Mixer</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15920D</td>
			<td style="width:195px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator</td>
			<td style="width:108px;">Nuiare</td>
			<td style="width:137px;">NU-4750</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">Analytical Balance Scale</td>
			<td style="width:108px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:137px;">XS104</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse

Il sistema nervoso enterico è una vasta rete di neuroni e glia funzionare la lunghezza del tratto gastrointestinale che controlla funzionalmente motilità gastrointestinale. Una procedura per l&#39;isolamento e la coltura di una popolazione mista di neuroni e glia dal plesso mienterico è descritto. Le colture primarie possono essere mantenuti per più di 7 giorni con connessioni di sviluppo tra i neuroni e glia. La striscia di muscolo longitudinale con l&#39;allegata mienterico plesso è spogliato dal muscolo circolare sottostante dell&#39;ileo mouse o del colon e sottoposto a digestione enzimatica. In condizioni di sterilità, l&#39;isolata popolazione neuronale e gliale sono conservati all&#39;interno del seguente centrifugazione pellet e placcato su vetrini. Entro 24-48 ore, si verifica crescita dei neuriti e neuroni può essere identificato da marcatori pan-neuronale. Dopo due giorni di cultura, isolati neuroni potenziali d&#39;azione di fuoco, come osservato da studi di patch clamp. Inoltre, glia enterica può anche essere indicanied di GFAP colorazione. Una rete di neuroni e glia in stretta apposizione forma entro 5 - 7 giorni. Neuroni enterici possono essere individualmente e direttamente studiati utilizzando metodi come l&#39;immunoistochimica, elettrofisiologia, imaging del calcio, e la PCR singola cellula. Inoltre, questa procedura può essere eseguita in animali geneticamente modificati. Questa metodologia è semplice da eseguire e poco costoso. Nel complesso, questo protocollo espone i componenti del sistema nervoso enterico in modo facilmente manipolata in modo da poter meglio scoprire la funzionalità del ENS in stati normali e malattie.

<html> Subito dopo l&#39;isolamento di cellule LMMP-derivati, i neuroni e altri tipi di cellule non sarà immediatamente evidente. Vivente, cellule rotonde di fenotipo indistinto può essere vista come detriti tessuto dai frammenti di tessuto non digeriti e tessuto connettivo. Questo relitto è di alcuna preoccupazione e sarà in gran parte rimossa con la prima variazione media in due giorni. Non tentare di pulire le diapositive prima di questo, come le cellule vitali sani saranno rimossi. Do...

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An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia, immunoistochimica,<em&gt; Ecc</em&gt;.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

26.5K Views.  Virginia Commonwealth University. Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia, immunoistochimica, Ecc.

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Studiare l&#39;integrazione degli adulti nati Neuroni

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Ricerca

Neuroscienze

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

Una descrizione visiva della dissezione del sistema vascolare di superficie cerebrale e Meningi associate, e del plesso coroide da cervello di ratto

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Un isolato semi-intatte Preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di Elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Un<em&gt; In Vitro</emPreparazione muscolare-nervosa&gt; Adult mouse per studiare le proprietà di cottura delle afferenze muscolari

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Modulazioni ambientali del numero di Mesencefalo dopamina neuroni in topi adulti

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

Tuning nella Banda Theta Ippocampale<em&gt; In vitro</em&gt;: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...