Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.

Il protocollo consiste di tre fasi principali: la prima fase comprende la preparazione dell&#39;estratto composito di coltura; la seconda riguarda la primaria gengivali umani fibroblasti (HGF) coltura cellulare, il contatto delle cellule con estratti compositi e colorazione delle cellule; il terzo passo consiste confocale e l&#39;analisi del segnale fluorescente. Per i tessuti gengivali prendere, il protocollo è stato approvato in conformità con la legislazione francese, il consenso informato e del comitato etico locale. 1. composito Estratti Preparazione Utilizzare modificato medie Aquila Dulbecco (DMEM) come mezzo di eluizione. Assicurarsi che il rapporto tra la superficie dei campioni e il volume del mezzo di estrazione è al livello più basso dei requisiti ISO 10993/12. La procedura è descritta di recente 11 e descritto brevemente qui di seguito: <ol><li> Formare campioni sferici del composito dentale non polimerizzato utilizzando una presa su misuraER. La dimensione del supporto è di 2 mm di raggio, che è in accordo con la profondità di polimerizzazione generalmente consigliata nel trattamento clinico orale. </li><li> Preparare pozzetti della piastra, contenenti ciascuna 1 ml di terreno di coltura (DMEM), con una miscela al 5% di penicillina / streptomicina e 1% di amfotericina ma senza siero bovino fetale (FBS). </li><li> Campioni Cure all&#39;interno del pozzetto contenente mezzo DMEM con una lampada a luce LED con un cm -2 intensità di 1.070 mW (λ = 465-475 nm) per 40 sec. Assicurarsi che la distanza tra la punta e la polimerizzazione dei campioni è nel range di 0,5 mm. Utilizzare questa modalità di polimerizzazione per simulare il contatto temporaneo tra dente e il composito dentale non polimerizzato. Nella situazione clinica, il contatto si verifica quando il composito da restauro viene inserito nella cavità orale. </li><li> Incubare campioni (campioni compositi in terreno DMEM) a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria. Incubare terreno DMEM (senza campioni compositi) per le cellule di controllo nelle stesse condizioni. </li></ol> 2. HGF coltura cellulare, Composite Estratti Test e Celle di colorazione <ol><li> Crescita e mantenimento di colture cellulari Isolare fibroblasti gengivali umani provenienti da biopsie dei tessuti gengivali sani di pazienti scattate durante estrazioni ortodontiche di routine. <ol><li> Coltivazione fibroblasti gengivali umani in DMEM in presenza del 10% FBS, 5% di penicillina / streptomicina e 1% Amfotericina B. mantenere le cellule a 37 ° C in incubatore in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria. </li><li> Medie cambiata ogni 3 giorni, e le cellule di passaggio ogni 5 giorni. Dopo aver raggiunto confluenza, le cellule raccolto da tripsinizzazione. </li><li> Centrifugare le cellule a 90 xg per 5 min e risospendere nel mezzo di coltura. Conteggio delle cellule con un contatore di cellule scettro palmare automatizzato. </li><li> Sospensione cellulare Seed ad una densità cellulare di 2,5 x 10 4 cellule / ml in un sistema di scorrimento della camera. Consentire l&#39;incubazione delle cellule durante la notte a 37 ° C in atmosfera al 5%. </li></ol></li><li> L&#39;aggiunta di estratti compositi alle cellule in coltura <ol><li> Sostituire i supporti dei due pozzi della slitta della camera da 1 ml di estratti composti testati (dopo 24 ore di incubazione). </li><li> Mantenere i due pozzetti rimanenti (cellule di controllo) nelle stesse condizioni. </li><li> Incubare il vetrino camera contenente i quattro pozzetti a 37 ° C in incubatore, in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria. </li></ol></li><li> Colorazione fluorescente Utilizzare la macchia citotossicità Live / Dead cellule eucariotiche in base alle istruzioni del produttore. NOTA: il kit prevede un test di fluorescenza a due colori veloce per determinare la vitalità delle cellule in una popolazione sulla base di integrità della membrana plasmatica e l&#39;attività esterasi. La macchia distingue in diretta da cellule danneggiate mediante l&#39;etichettatura in contemporanea con verde fluorescente calceina-AM per indicare l&#39;attività esterasi intracellulare e rosso fluorescente etidio omodimero-1 (EthD-1) per indicare la perdita di Membrane integrità. <ol><li> Preparare una soluzione di lavoro dei due reagenti di colorazione contenente 2 mM di calceina AM e 4 mM EthD-1 (concentrazione finale segnalato per essere adatto per fibroblasti colorazione). Aggiungere la macchia alle cellule aderenti in coltura in presenza o assenza dei composti estratti selezionati. </li><li> Osservare direttamente e rapidamente le popolazioni di cellule colorate al almeno 15 minuti dopo colorazione e attraverso il time-lapse imaging. Non centrifugare e non fixe le cellule colorate. </li></ol></li></ol> 3. confocale Time Lapse Imaging e analisi del segnale Il sistema utilizzato è dotato di un quattro unità laser a diodi e un&#39;immagine multi-tinto per un massimo di quattro coloranti fluorescenti per ciascun campione. Il sistema può eseguire una mappatura un&#39;immagine (ingrandimento 10X) che fornisce una panoramica del campione su cui si può muovere per osservare una regione di interesse (600X ingrandimenti). <ol><li> Tempo di imaging lapse <ol><li> Posizionare le specimens (la diapositiva camera contenente i campioni colorati) sulla stanza buia dell&#39;incubatore integrato confocale (37 ° C, 5% di CO 2 e atmosfera umida). </li><li> Selezionare i laser corrispondenti. Utilizzare le due sorgenti laser 473 nm (15 mW) e 559 nm (18 mW) per eccitare Calceina e EthD-1. </li><li> Utilizzare una modalità a due sequenziale di acquisire immagini attraverso sequenze di linea senza crosstalk nella diagnostica per immagini con i due coloranti fluorescenti usati. </li><li> Utilizzare un rivelatore con uno spettro di nuova concezione per impostare automaticamente le condizioni in conformità con il colorante fluorescente in unità di scansione. </li><li> Ottimizzare le larghezze di banda di fluorescenza rilevata per ogni canale al massimo. Registra tutte le acquisizioni in sequenza per evitare il potenziale di cross-talking. </li><li> Selezionare le condizioni di imaging più adatte in base alla selezione colorante fluorescente utilizzando il software di acquisizione. </li><li> Acquisire un&#39;immagine di mappa che viene creata automaticamente dal centro, in un percorso a spirale,con l&#39;area di interesse essere facilmente selezionati per un esame più approfondito. </li><li> Selezionare la modalità di osservazione. Selezionare fino a cinque tipi di modalità di osservazione, tra cui time-lapse, Z-stack, e multi-zona a seconda delle necessità. Utilizzare una combinazione di modi time-lapse Z-stack e nel presente studio e completare rapidamente l&#39;acquisizione di immagini, </li><li> Modificare e cambiare il colorante fluorescente. In alternativa, sovrapporre la fluorescenza e le immagini a contrasto di luce con l&#39;altro. Osservare l&#39;immagine dal vivo con il punto selezionato sulla schermata della mappa in basso a sinistra. </li><li> Determinare l&#39;area di esposizione utilizzando l&#39;inquadratura e le funzioni di zoom. Facoltativamente, passare tra le visualizzazioni per ogni tipo di fluorescenza del colorante. NOTA: Il microscopio utilizzato in questo protocollo ha la stessa funzionalità di alto confocale tradizionale in un design compatto. Il microscopio è dotato di obiettivi di acqua-immersion invertiti considerate ottimali per stabile time-lapse imaging di cellule vive con un incubatore built-in semplificato. </li&gt; </ol></li><li> Analisi del segnale e quantificazione <ol><li> Utilizzare il software di imaging per quantificare il segnale di fluorescenza. Ottenere cinque immagini mappa con l&#39;obiettivo 10X sia testato campione e cellule di controllo. </li><li> Ottenuto 1.024 × 1.024 pixel immagini regolari, con una dimensione di 0,231 micron × 0,231 micron pixel. Memorizzare immagini come Formato Olympus immagine (OIF) per l&#39;analisi dei segnali. Questo formato consente di memorizzare varie impostazioni dei parametri e le immagini insieme. Utilizzare diversi strumenti di analisi (misura del profilo di intensità, rapporto di intensità tra i due canali utilizzati). </li><li> Conservare le immagini di proiezione massime come file TIFF a 12 bit / pixel. </li><li> Preforme analisi statistiche utilizzando il software comandante R. Analizzare le differenze con l&#39;analisi a senso unico della varianza (ANOVA) con un test di ripetizione. Riportare i risultati come media deviazione standard (± SD) e significatività statistica p &lt;0.05. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests, they have nothing to disclose.

Comportamento del materiale biocompatibilità è il parametro più prerequisito per essere valutato prima uso medico. Norme internazionali riguardano dispositivi medici ISO 10993 33 e in particolare materiali dentali ISO 7405 34. L&#39;assenza di effetti tossici alle cellule circostanti è la norma chiave nella valutazione biocompatibilità di tali materiali. Ecco perché i test di citotossicità ha tale importanza nella valutazione del materiale dentale biocompatibilità 35-37. L&#39;ISO ha suggerito metodi di prova possono essere basati sull&#39;attività metabolica o l&#39;integrità della membrana. Endpoint selezionati devono seguire specifiche condizioni di Classifica effetti negativi indotti da un materiale di prova in modo da minimizzare il tempo e il costo dei test di valutazione. L&#39;attuale metodo di indagine (3D tempo confocale lapse) è l&#39;integrità della membrana base. La valutazione di citotossicità tramite questo endpoint sembra essere un valido indicatore di biocompa cellularepatibilità con materiali testati ed è anche ISO approvato endpoint. In vitro test sono progettati per determinare come un campione di materiale riguarda un particolare tipo di cellula. Il saggio colorimetrico MTT è stato originariamente descritto da Mossman (1983) come un metodo utile per la misura della citotossicità in vitro e proliferazione cellulare. Il test MTT è basato sulla conversione del sale di tetrazolio in cristalli di formazano dalle cellule attive, che determina l&#39;attività mitocondriale. Questo può essere tradotto dal tasso vitalità 38. Gupta e collaboratori hanno riportato che il test MTT è il metodo più utilizzato per misurare la citotossicità delle resine composite. Succinico deidrogenasi e le risposte di fosfatasi alcalina sono stati utilizzati anche per lo stesso scopo 39. Tuttavia, le cellule destino non possono essere seguiti, poiché il saggio MTT richiede uccidere le cellule in ogni punto di misura. Per monitorare più da vicino il comportamento delle cellule colorate in questo studio, diè stata effettuata l&#39;osservazione rect di cellule vive, grazie al tempo di imaging lasso CLSM combinato con una breve colorazione protocollo, l&#39;analisi automatica di immagini e la quantificazione del segnale fluorescente. Compositi dentali entrano in stretto contatto con i tessuti orali, in particolare le cellule gengivali e pulpari. I fibroblasti potrebbero essere bersaglio di componenti rilasciati da questi compositi da restauro 40-41. Inoltre, diversi studi hanno riportato che le cellule immortali e le cellule primarie possono avere diverse risposte cellulari a contatto con biomateriali. Cellule primarie sono risultati essere più opportuno valutare biomateriali effetti 42. Questo spiega l&#39;uso di cellule di fibroblasti gengivali umani primari come modello cellulare per valutare la citotossicità del composito dentale testati in questo studio. Il potenziale tossicità delle sostanze rilasciate dal composito dentale è stato ampiamente studiato 43-44. Per valutare tegli citotossica potenziale dei materiali, due celle modello di contatto potrebbe essere eseguita. Nel sistema modello diretto contatto il materiale viene posto direttamente con le cellule bersaglio mentre nel sistema contatti indiretti, le cellule bersaglio sono in contatto con eluisce da supporti biologica. Nelle applicazioni cliniche e per le procedure di restauro, composito dentale sono messi in contatto diretto con i tessuti gengivali. Per questo motivo, il protocollo sperimentale attuale è focalizzata sul sistema di contatto indiretto con fibroblasti gengivali umani (cellule in presenza di estratti composti testati). Come precedentemente riportato da Dahl e collaboratori, le risposte di citotossicità sono stati classificati come gravi (&lt;30%), moderata (30-60%), leggero (60-90%) o non-citotossico (&gt; 90%) in base alla relativa attività di valori ottenuti per i controlli 45. Pertanto, secondo questa classifica e alla luce dei risultati ottenuti (Tabella 1), composito ELS bassissima ritiro può essere classificato come very leggermente citotossici e ha mostrato un comportamento simile alle cellule di controllo durante l&#39;intero periodo di lasso di tempo. Utilizzando il proprio stesso metodo di indagine, i risultati di questo studio potrebbero essere paragonate a quelle di uno studio recente pubblicato. L&#39;ELS bassissima ritiro composito dimostrato biocompatibilità superiore rispetto ai due composti precedentemente testati utilizzati per la stessa applicazione clinica che è la restaurazione diretta 11. Ulteriori studi sono ancora necessari per stabilire più completo confronto. Al momento di decidere che citotossicità test per l&#39;approvazione di una valutazione specifica endpoint, è importante capire i vantaggi ei limiti di ogni test. Lo scopo principale della confocale è realizzare un&#39;architettura 3-D di cellule e organi. La tecnica è in grado di rivelare non solo la superficie di un campione, ma anche la sua sottosuolo. Il protocollo qui descritto evidenzia l&#39;uso del 3D CLSM tempo di imaging lapse confocale, come SensiMetodo tivo per valutare il comportamento di biocompatibilità in vitro di un composito dentale. Tuttavia, al fine di evitare le limitazioni incontrate in questo lavoro, workstation antivibranti potrebbero essere utilizzati al fine di consentire l&#39;imaging più stabile e più lungo periodo; il piano del tavolo potrebbe isolare il sistema confocale utilizzato dagli effetti dannosi che le vibrazioni in laboratorio possono causare. Inoltre, i materiali da utilizzare nella cavità orale dovrebbe idealmente essere innocuo per i tessuti gengivali e non devono contenere sostanze che potrebbero causare tossicità sistemica. Conformemente alla metodologia utilizzata ed i risultati ottenuti dal presente studio si può concludere che il composto testato (ELS bassissima ritiro) non è citotossica nelle presenti condizioni sperimentali. Dato che il metodo CLSM può dare sensibilmente il tasso iniziale di cellule vitali, altre possibilità potrebbero prevedere per valutare più endpoint. In particolare, come è stato recentemente riportato che i monomeri compositi colpiscono le cellule thrOugh specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) 46- 48, sono necessarie ulteriori indagini per valutare le correlazioni eventuale citotossicità tra le reti e la produzione di ROS segnalazione. Il protocollo futuro potrebbe essere progettato per valutare contemporaneamente la produzione di ROS (H 2 O 2 e / o O 2 - colorazione) e il rapporto di citotossicità (Live colorazione / morti) con tempo di imaging lasso CLSM.

Uno dei principali standard indicati nelle raccomandazioni ISO per definire biocompatibilità è l&#39;assenza di tossicità materiale per le cellule. Compositi dentali a base di resine possono rilasciare i componenti dalla matrice resinosa, che potrebbe essere inizialmente a causa di polimerizzazione parziale, e / o in seguito a causa di processi di degradazione nel tempo 1-4. Questi componenti rilasciati venire a contatto con i tessuti orali e possono avere vari inconvenienti, come orticaria e reazioni della mucosa 5, lo sviluppo di reazioni allergiche e di ipersensibilità in pazienti 6, modifiche di fibroblasti gengivali morfologia e riduzione di collagene di tipo I di proteine ​​7, immunosoppressione o Immunostimolazione su mitogeno -driven proliferazione di purificate linfociti T e delle cellule della milza 8 e danni al DNA in fibroblasti gengivali umani primari, che sottolinea il loro potenziale genotossico 9. Molti parametri possono influenzare la tossicità composito dentale, come l&#39;ombra del composite, la fotopolimerizzazione, la composizione chimica del monomero della resina, il riempimento e il grado di conversione 10- 13. Dal potenziale tossico in vitro dei materiali può prevedere in situazioni in vivo e potrebbe essere paragonato a situazioni cliniche da parte lo studio di alcuni endpoint rilevanti. La citotossicità di compositi dentali e dei loro componenti sono stati ampiamente valutati usando sistemi di colture cellulari 14- 16. Questi sistemi in vitro sono stati sviluppati per valutare compositi dentali biocompatibilità in termini di: crescita cellulare e l&#39;apoptosi delle cellule utilizzando THP-1monocytes come le cellule 17, citotossicità in fibroblasti gengivali umani 18, potenziale infiammatorio in HaCaT cheratinociti come le cellule 2, la funzionalità delle cellule odontoblast- come MDPC-23 cellule 19, la riduzione dei livelli di RNA totale, e aumento significativo di induzione di apoptosi in gengivale cheratinociti umani 20 eDanno al DNA in fibroblasti gengivali e polpa di cellule 21. Diverse metodologie sono suggeriti per studiare la biocompatibilità dei materiali compositi dentali. Saggi colorimetrici, che coinvolgono coloranti specifici e misurazioni di assorbimento di luce, rimangono i più comunemente utilizzati, per la loro relativa semplicità e basso costo 22- 26. Analisi al microscopio per contrasto luce consuma spesso più tempo e comporta costi più elevati. Tuttavia, queste tecniche di microscopia presentano alcuni importanti vantaggi. L&#39;osservazione della struttura cellulare fornisce informazioni estese sugli effetti tossici esperti, fornendo così dati più rilevanti e sensibili. In particolare, l&#39;introduzione di microscopia confocale 27 ha permesso l&#39;osservazione delle strutture biologiche con il miglioramento risoluzione assiale rispetto al livello di campo tradizionali microscopi a fluorescenza. Quindi, l&#39;imaging confocale è diventato un potente strumento di indagine in diversi campi diricerche mediche e scientifiche. In contrasto con tecniche di microscopia elettronica a scansione microscopia confocale offre la possibilità di visualizzare componenti distinti di cellule per incorporazione di marcatori fluorescenti specifici. La maggior parte di questi traccianti specifici sono stabili in ambiente acquoso, sensibilmente misurabili, poco costoso e non tossico 28, permettendo il loro uso in clinica e ricerche di laboratorio. Inoltre, l&#39;essiccamento del campione e la fissazione richiesto per convenzionale analisi al microscopio elettronico non è necessaria per tempo di imaging lapse confocale, rilevamento così dipendente dal tempo è possibile anche su campioni. Rispetto alle immagini bidimensionali, il principio confocale consente una visualizzazione esemplare sottosuolo e la struttura ricostruzione tridimensionale delle diverse immagini in profondità ottenuti; che provocano, più precise e più strutturali particolari 29, 30. Il presente studio video è un esempio dell&#39;uso di tridimensionale Time-lapse Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) in combinazione con l&#39;etichettatura Live / Dead fluorescenti e la quantificazione del segnale come un metodo innovativo. La tecnica presentata in questo documento ha il vantaggio di consentire la valutazione e time-lapse sensibili di imaging di cellule vive senza modificare la struttura cellulare della valutazione. Non ci sono fasi di preparazione sono necessari prima dell&#39;analisi confocale. In precedenza, la stessa colorazione è stata utilizzata per valutare la vitalità delle colture nuclei spongiosa 31 ma senza confocale time-lapse seguente. Allo stesso modo la stessa procedura di time-lapse confocale è stato utilizzato per valutare l&#39;attività eritromicina tempo-kill nei batteri dei fanghi attivi in base al loro tipo Gram 32 utilizzando uno specifico batteri vivi / morti colorazione. Questi metodi sono stati recentemente adattato e utilizzato per confrontare la tossicità dei compositi dentali a base di monomeri di metacrilato 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Olympus Fluoview FV10i&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O2/Co2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Pnasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO 5M</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Live/Dead&#174; Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MP 03224</td>
			<td>Stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ELS extra low shrinkage&#174;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Saremco&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Dental composite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D 6046</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1426</td>
			<td>harvesting cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chamber slide system&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">14220040X</td>
			<td>Culture chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">A11-101</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">00110230TP1</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal time lapse imaging as an efficient method for the cytocompatibility evaluation of dental composites

E &#39;generalmente accettato che l&#39;interazione in vitro materiale cella è un criterio utile nella valutazione di materiale dentale biocompatibilità. L&#39;obiettivo di questo studio è stato quello di utilizzare 3D CLSM tempo di imaging lasso confocale per valutare la biocompatibilità in vitro di compositi dentali. Questo metodo fornisce un&#39;indicazione precisa e sensibile della frequenza di cellule vitali in contatto con estratti compositi dentali. L&#39;ELS in più basso ritiro, un composito dentale usato per restauro diretto, è stato preso come esempio. In vitro valutazione è stata effettuata su cellule di fibroblasti umani in coltura primarie gengivali utilizzando Live / colorazione Morto. Le immagini sono state ottenute con il sistema invertito confocale biologico FV10i e analizzati con il software 3.1 FV10-ASW. L&#39;analisi delle immagini mostrava un leggero citotossicità in presenza del composto testato dopo 5 ore di time lapse. Una leggera diminuzione della vitalità cellulare è stato mostrato in contatto con il composito estratti Compar testatoed alle cellule di controllo. I risultati hanno evidenziato l&#39;uso del 3D CLSM immagini time lapse come metodo sensibile per valutare qualitativamente e quantitativamente il comportamento biocompatibilità dei compositi dentali.

La figura 1 mostra una panoramica dei morti cellule vive / colorate nelle immagini ottenute mappatura (obiettivo 10 volte) sia per il controllo e cellule esposte agli estratti composti testati (ELS bassissima ritiro). La struttura tridimensionale delle cellule può essere visualizzato alla 600X ingrandimento. Visualizzazione di cellule raccolte nella camera di controllo e di cellule raccolte nella camera alla presenza degli estratti compositi testati è presentato nella figura 2. La sporgenza massima (obiettivo 60X) mostra il destino di popolazioni cellulari selezionate all&#39;inizio del time lapse (a 15 min) e alla fine del periodo di intervallo di tempo (in 5 ore). Cinquanta sette pile di immagini (xyzt scansione mod, 39 immagini per ogni stack, voxel-profondità 1,00 micron) sono stati ottenuti in questo periodo. Una leggera diminuzione del segnale fluorescente verde e molto leggera variazione nella fluorescenza rossa sono stati ottenuti in cellule esposte. Nessuna variazione significativa è stata osservata per il controllocellule. Cellule estratti esposte compositi assunto simile morfologia del mandrino alle cellule di controllo; morfologia non è stata alterata in queste condizioni sperimentali (nonostante la diminuzione segnale verde e l&#39;aumento del segnale rosso in presenza del composto testato). L&#39;analisi delle immagini è stata eseguita su cinque diversi stack di immagini selezionate corrispondenti alle diverse popolazioni cellulari delle immagini ottenute per il composito testato rispetto alle cellule di controllo negativo per il segnale verde e rosso. Il profilo di intensità di cellule colorate è illustrato nella figura 3; l&#39;evoluzione segnale verde e rosso delle cellule a contatto con il composito testato era paragonabile a quelli di cellule di controllo. Calceina e EthD-1 fluorescenza intensità di emissione sono stati misurati in cellule di controllo e in cellule esposte compositi. La misurazione è stata eseguita a intervalli di un ora per fino a cinque ore. Il rapporto verde / rosso di fluorescenza (sulla base di intensità integrata del verde 495-515 nm e 620-650 rossi segnali nm) È stata calcolata durante il periodo di time-lapse. Gli indici di redditività per il controllo e cellule esposte a ELS estratti bassissima contrazione sono mostrati in grado T 1. In presenza del composito testato, la percentuale di cellule vive è stato trovato per diminuire leggermente dal 100% al 93,9% dopo 1 ora di contatto. Differenza significativa è stata osservata tra il composito testato e il controllo negativo (cellule senza estratti compositi) dopo 5 ore del periodo di time-lapse indicato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg" /> Figura 1: Panoramica immagine mappatura delle cellule ha mostrato macchiato di obiettivo 10X, (A), le cellule di controllo e (B), le cellule in presenza di estratti compositi (ELS bassissima contrazione) per l&#39;inizio del periodo di intervallo di tempo (t = 15 min). Le aree verdi sono cellule vive e zone rosse sono le cellule danneggiate. In questocondizioni sperimentali, nessuna variazione (sia per fluorescenza verde e rosso) è stato osservato per compositi esposti cellule rispetto alle cellule di controllo negativo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg" /> Figura 2: immagini CLSM a obiettivo 60X di una popolazione di cellule da (A) e la camera di controllo (B) estratti compositi camera all&#39;inizio e alla fine del periodo di esposizione time-lapse (I: 15 min e II: 5 ore, rispettivamente, ). Le aree verdi sono cellule vive e zone rosse sono le cellule danneggiate. Il pannello delle immagini dimostrata leggero cambiamento nel segnale di intensità (leggera diminuzione del segnale verde e molto leggero aumento quello rosso). Nessuna alterazione morfologia cellulare sono stati osservati in presenza di estratti compositi; esporre le cellule mantenuto la loro morfologia a forma di fuso e fibroblastica come cellule di controllo. Figura 3: Profilo Linea di cellule osservate in microscopia time-lapse cellule (A) di controllo (B), le cellule estratti composito a vista, (I) a 15 min e (II) a 5 ore.. Nessuna variazione visibile nell&#39;evoluzione segnale verde in presenza del composto testato indipendentemente dal tempo di contatto. Tuttavia, leggero aumento del segnale rossa è stata osservata in presenza del composto dopo 5 ore di contatto. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Tempo di contatto (ora) </td><td colspan="5"> Vitalità cellulare (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Cellule di controllo </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; <td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS in più basso ritiro ® </td><td> 93.9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89.5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Corsi dal vivo HGF cellule evoluzione dopo 1, 2, 3, 4 e 5 ore di contatto con gli estratti di compositi La vitalità cellulare è stata valutata mediante colorazione utilizzando il kit di citotossicità Live / Dead. I dati mostrano i valori medi ± DS di cinque immagini stack analisi. I valori sono significativamente diversi da cellule di controllo con p &lt;0,05.

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Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

L&#39;aspetto più studiato della biocompatibilità dei compositi dentali è la loro citotossicità 3D CLSM lasso di tempo di imaging combinato con fluorescente quantificazione del segnale consente di valutare sensibile del destino delle cellule nel corso del tempo. Utilizzando questo metodo potrebbe essere uno strumento efficace per valutare la citocompatibilità di compositi dentali.

Confocale Time lapse imaging come un metodo efficiente per la valutazione citocompatibilità di compositi dentali

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K Views.  UMR CNRS 5615, Université Lyon1.  L'aspetto più studiato della biocompatibilità dei compositi dentali è la loro citotossicità 3D CLSM lasso di tempo di imaging combinato con fluorescente quantificazione del segnale consente di valutare sensibile del destino delle cellule nel corso del tempo. Utilizzando questo metodo potrebbe essere uno strumento efficace per valutare la citocompatibilità di compositi dentali. 

Video: Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Il<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

Anestesia, chirurgia e metodo di raccolta per la valutazione delle viti transpedicolari utilizzando un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello della colonna vertebrale della deriva

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

Seconda generazione di armoniche segnali coniglio sclera come strumento per la valutazione del tessuto terapeutico reticolazione (TXL) per la miopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful compared to other more aggressive methods such as retro-orbital plexus sample collection. However, this blood collection method is sometimes limited by an unsatisfactory success rate. Here, we introduce a method for blood collection through the subclavian vein puncture. The subclavian vein is located just under the clavicle and this vein is large enough to fulfill the volume requirements of blood collection. Our results show that this method is safe and applicable for blood collection sampling with the required blood volume. Blood collection through the subclavian vein puncture could serve as an alternative blood collection method in case of failed tail vein blood sampling in rats.

Here, we present a protocol to collect blood samples from the rat subclavian vein.

Puntura della vena succlavia come metodo alternativo di raccolta del campione di sangue in ratti

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

Endodonzia guidata: pianificazione tridimensionale e preparazione assistita da template di cavità di accesso endodontico

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...