We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and &#946;-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

Il seguente protocollo utilizza parametri definiti dagli esperimenti nelle figure 4 e 6 impostazioni di acquisizione relative e delle condizioni sperimentali. Molti di questi parametri possono essere modificati per adattarsi altri esperimenti (ad esempio, i tempi di esposizione, categorizzazione, canali fluorescenti, ecc.). Tutte le procedure devono rispettare le linee guida e regolamenti istituzionali ed essere approvati dal comitato di biosicurezza istituzionale. siti web produttore microscopio contengono informazioni eccellente per l&#39;imaging cellulare dal vivo. 1. microscopi e software di imaging <ol><li> Eseguire l&#39;imaging cellulare dal vivo su una vasta gamma di microscopi invertiti. I microscopi più comuni sono widefield epifluorescenza e confocale spinning-disco. Qui, usare un microscopio automatico e motorizzato widefield epifluorescenza con sorgente luminosa a ioduri metallici da 200 watt. </li><li> Ottenere uno stadio-top o un microscopio camera ambientale. Qui, usare uno stadio-top camera ambientale. </li><li> Utilizzare il software commerciale per operare microscopi con utility per eseguire la microscopia time-lapse. </li><li> Utilizzare software disponibile in commercio o ImageJ per l&#39;analisi delle immagini. Molti altri strumenti di analisi sono disponibili in commercio, e ci sono programmi su misura, molti dei quali sono stati pubblicati 8,18. </li></ol> 2. Visualizzare i processi cellulari e fenotipici Risposte <ol><li> Visualizza le cellule con la microscopia in campo chiaro. Differenziale contrasto interferenziale contrasto di fase e solo può essere molto informativo per studiare le risposte alle risposte farmaco anti-cancro. Questi processi possono includere la mitosi, la motilità cellulare e apoptosi. </li><li> Visualizza strutture cellulari, organelli ei processi con biosensori fluorescenti. sonde fluorescenti sono informativi nel monitoraggio dei processi subcellulare specifici. Questi possono includere dinamica dei microtubuli, mitocondriale e le dinamiche reticolo endoplasmatico, l&#39;accumulo di proteine ​​e localizzazione, esegnali molecolari (ad es., fosforilazione, calcio). </li></ol> 3. Preparazione di campioni <ol><li> Crescere le cellule in piatti certificati di coltura cellulare in uno standard, coltura cellulare umidificata incubatore (ad esempio, 37 ° C, 5% di CO 2, 80% di umidità relativa). <ol><li> Crescere le cellule HT1080 in MEM con EBSS. Integrare la media con il 10% v / v FBS, 1% v / v pen / strep, 1% v / v di sodio piruvato e 1% v / v aminoacidi non essenziali. </li></ol></li><li> Due giorni prima di imaging, le cellule piastra 50.000 HT1080 Fucci in 3 pozzetti di una 12-pozzetti # 1.5 vetro piatto fondo in una cappa a flusso laminare sterile certificata. Regolare il numero di cellule piastrate per raggiungere ~ 60% di confluenza per l&#39;inizio dell&#39;esperimento. A seconda della linea cellulare e la natura dell&#39;esperimento densità cellulare può essere inferiore. Nota: Densità cellulare può avere una profonda influenza sulla crescita della linea cellulare e sui risultati sperimentali. Contare le celle per ridurre al minimo esperimento-to-esperimento variability a causa della densità. <ol><li> A seconda della camera ambientale e le condizioni necessarie per l&#39;esperimento, le cellule piastra in singoli piatti e (di solito 35- o 60-mm), 4 e 35 mm piatti, 6-, piastre di coltura cellulare a 12 o 24 pozzetti, o coprivetrino per diapositive in vari formati. Usare piatti con fondo di vetro con # 1.5 vetro come la maggior parte delle lenti dell&#39;obiettivo sono ottimizzati per questo spessore del vetro, e immagini attraverso plastica coltura cellulare è molto povera. Nota: Alcune linee di cellule non crescono e sopravvivono su vetro. In questi casi, il vetro può essere rivestito per migliorare l&#39;aderenza delle cellule (ad es., Poli-lisina o collagene). Alcune aziende producono ottica di plastica coltura cellulare, occorre determinare empiricamente se questa è una valida opzione. </li></ol></li></ol> 4. Camera ambientale Set-up <ol><li> Prima di qualsiasi sperimentazione, set-up la camera ambientale in modo che funziona a ~ 80% di umidità e quindi la temperatura nella posizione del campione è 37 ° C. Cellule più coltivate crescono in atmosfera al 5% di aria CO 2 / saldo al tampone bicarbonato di sodio in mezzo. A seconda del set-up, impostare il controller ambientale al 5% di CO 2 e si mescolare 100% CO 2 con l&#39;aria, o utilizzare premiscelato, certificata 5% di CO 2 / bilancio dei gas dell&#39;aria. Seguire le istruzioni del produttore per il gas portate. Nota: Alcune linee di cellule crescono in CO 2 media -indipendente nel qual caso essi possono essere mantenuti senza CO 2. supporti di imaging Specificamente progettato è inoltre disponibile che limita l&#39;aggiunta di composti autofluorescenti. La crescita in tesi mezzi per il tipo cellulare desiderato deve essere determinato empiricamente in anticipo. </li><li> Prima di imaging, garantire il serbatoio è pieno (seguendo le indicazioni del produttore) con acqua distillata sterile. Accendere la camera ambientale per l&#39;impostazione della temperatura desiderata e posizionarlo nella inserto palco microscopio. Per salvare il gas, non avviare il flusso, a questo punto. Nota: Se c&#39;è qualche spazio libero tra la camera di fase-top e la fase incasso e / o di qualsiasi tensione sui cavi di collegamento alla camera si può introdurre artefatti da movimento nella esperimento. <ol><li> Lay pezzi di pellicola di paraffina sui bordi dell&#39;apertura inserto palco prima di inserire la camera in esso per paio camera al palco, e assicurarsi che nessuna connessione stanno tirando sulla camera. </li></ol></li><li> Lasciare che la camera di equilibrare a 37 ° C. Mantenere una temperatura stabile per evitare fluttuazioni di temperatura durante l&#39;imaging che può influenzare la fisiologia cellulare e introdurre deriva. Raggiungendo equilibrazione temperatura richiede tipicamente 30 min a 1 ora, a seconda dell&#39;ambiente. <ol><li> Inserire un piatto di &#39;manichino&#39; con l&#39;acqua nei pozzi nella camera durante il riscaldamento. Un piatto di imaging riempito con acqua imita il campione, contribuendo a garantire la camera è sufficientemente riscaldato e stabilizzata. Riempire la camera con acqua sterile pre-riscaldatoriduce il tempo necessario alla stabilizzazione della temperatura e minimizza la diminuzione di temperatura dopo l&#39;aggiunta del campione sperimentale. </li></ol></li></ol> 5. Microscopio Set-up <ol><li> Accendere il microscopio, computer associato, ed eventuali periferiche necessarie. <ol><li> A seconda della sorgente di luce, l&#39;ora di accenderlo fino al momento dell&#39;uso (es., LED). </li></ol></li><li> Con la torretta obiettivo in una posizione bassa, seleziona l&#39;obiettivo 20X 0,7 NA da utilizzare. </li><li> Posizionare il campione rispetto all&#39;obiettivo - questo renderà più facile trovare le cellule in cui il campione è nella camera. </li><li> Definire i parametri di imaging in questo momento se essi sono noti da precedenti esperimenti. </li></ol> 6. Il trasporto di cellule al microscopio e nella Camera <ol><li> Il trasporto le cellule per essere ripreso dal termostato per la camera ambientale. Assicurarsi che questo è fatto rapidamente per limitare gli effetti di un relativamente basso di CO 2 </sub&gt; atmosfera e diminuite temperatura sulle cellule. Seguire tutte le linee guida di biosicurezza istituzionali per il trasporto del campione e pulizia in caso di fuoriuscita. <ol><li> Collocare le cellule in un contenitore sigillato polistirolo o sacchetto isolato per evitare grandi cambiamenti ambientali. </li></ol></li><li> Inserire il piatto di imaging campione nella camera seguendo le indicazioni del produttore. </li><li> Dopo che le cellule sono stati fissati all&#39;interno della camera ambientale, sigillare la camera per mantenere un ambiente stabile e girare immediatamente sulla fonte (s) di gas atmosferici. <ol><li> Poiché alcune camere ambientali non utilizzano un coperchio stretto, sigillato, per ritardare l&#39;evaporazione, strato sterile, olio minerale embrione certificata sopra del mezzo di crescita. Avvolgere pellicola di paraffina gas permeanti intorno ai perimetrali-bordi del piatto del campione facendo attenzione a non ostacolare l&#39;area di esposizione di vetro. Localizzato, metodi di umidificazione secondari possono essere impiegati. Condensa sul coperchio del piatto del campione può diminuire perforMance della microscopia in campo chiaro. </li></ol></li><li> Al fine di minimizzare gli effetti della deriva termica precoce durante l&#39;esperimento, attendere 30 minuti prima di iniziare il time-lapse. Il tempo necessario varia in base alle dimensioni piatto di imaging e di altri fattori. Determinare empiricamente. </li></ol> 7. Impostazione del Imaging <ol><li> Selezionare le condizioni di imaging che meglio rappresentano i dati. Prendere precauzioni per evitare la fototossicità, limitando i tempi di esposizione, utilizzando la luce minore intensità e selezionando le sonde che vengono eccitati da lunghezze d&#39;onda della luce. </li><li> Definire x, y, z-aereo e desiderata lunghezza d&#39;onda (s) per ciascuna posizione da acquisire. La risoluzione temporale è limitata dal numero di posizioni e lunghezze d&#39;onda. Per lungo termine time-lapse della maggior parte dei processi cellulari, acquisire un&#39;immagine ogni 10 - 20 min; risoluzione temporale superiore (brevi intervalli, per esempio., 1 min) fornisce più punti di dati e quindi più robusto di monitoraggio delle cellule, ma anche i risultati in più integrataesposizione alla luce e set di dati più grandi. <ol><li> Come HT1080 FUCCI hanno proteine ​​fluorescenti verde e rosso dinamici (vedi Rappresentante dei risultati), utilizzare i seguenti tempi di esposizione: FITC / GFP - 50 msec, Texas Red / TRITC - 40 msec, campo chiaro - 20 msec. Utilizzare un bidone 2 x 2. </li></ol></li><li> Attivare il software messa a fuoco automatica a controllo utilizzando i parametri predefiniti in Impostazioni avanzate. Definire un area di lettura di 10 micron con la dimensione del passo consigliato. Essere sicuri di fare questo prima di iniziare il time-lapse. Autofocus con immagini campo chiaro e mai con fluorescenza per ridurre fototossicità e photobleaching. <ol><li> Utilizzare sistemi di autofocus software controllato su qualsiasi microscopio con un palco motorizzato, e mettere a fuoco direttamente sul campione. Tuttavia, possono limitare la velocità di acquisizione dell&#39;esperimento. Hardware controllato i sistemi di messa a fuoco in continuo funzionano bene per la microscopia time-lapse e migliorare la velocità, consentendo un più posizioni per essere ripreso o un più alto tasso di acquisizione. Tuttavia, essiaffidarsi al rilevamento di all&#39;interfaccia aria-vetro e può perdere la concentrazione del campione con variazioni di spessore del vetro attraverso il pozzo. </li></ol></li><li> Sostituire la metà dei mezzi di comunicazione con i media che contiene la concentrazione di farmaco desiderato che è stato riscaldato a 37 ° C. sostituzione dei supporti parziale aiuta a ridurre la deriva termica. Le condizioni di questo esperimento sono veicolo (DMSO), 1 micron selinexor e 10 micron PD0332991. Nota: Questo passaggio può essere fatto anche dopo l&#39;avvio l&#39;acquisizione mettendo in pausa e riavviare l&#39;esperimento. Questo permette il monitoraggio longitudinale delle risposte pre e post-farmaco di singole cellule. Se la stabilità della droga o il metabolismo è una preoccupazione, fermandosi e sostituzione dei supporti può essere fatto con lo stesso metodo. Per eseguire il test per la degradazione di droga o il metabolismo, i media da cellule trattate possono anche essere collocati sulle cellule naive per testare azione dei farmaci. </li><li> Avviare il time-lapse. </li><li> Come il time-lapse corre, in modo che i campi imaged rimangono a fuoco e l&#39;ChambeR mantiene un umido 37 ° C. <ol><li> Regolare la messa a fuoco in base alle esigenze mettendo in pausa l&#39;acquisizione durante l&#39;intervallo di tempo tra i punti di tempo. </li></ol></li><li> Se necessario, aggiungere acqua alla camera durante gli esperimenti più lunghi. Evitare di raffreddare la camera con l&#39;aggiunta di pre-riscaldato, acqua distillata sterile a 37 ° C. </li></ol> 8. Terminare la Time-lapse <ol><li> Quando l&#39;esperimento è stato eseguito fino al completamento, fermare l&#39;acquisizione se non è stato impostato per interrompere automaticamente. </li><li> Assicurarsi che il time-lapse è stato salvato correttamente sul disco rigido, anche se la maggior parte dei pacchetti software salva automaticamente durante l&#39;acquisizione, se non finito correttamente i dati possono essere persi. </li><li> Rimuovere la camera dal microscopio e smaltire le cellule in rifiuti a rischio biologico seguendo le procedure di biosicurezza istituzionale approvate. </li></ol> 9. longitudinale di monitoraggio e analisi dei dati Time-lapse <ol><li> Scegliere la metodologia di analisi che èappropriato per i processi biologici di interesse. Molti plugin per ImageJ, programmi utilizzando Matlab, e le piattaforme su misura sono stati prodotti per applicazioni specifiche. Il seguente metodologia copre inseguimento di nuclei e analisi di sonde fluorescenti nucleari come dimostrato nelle figure 4 e 5. </li><li> Aprire le pile di immagini .tif per i canali utilizzati in ImageJ. In alternativa, aprire i file nativi del programma di acquisizione direttamente in ImageJ utilizzando il plugin Bioformats. </li><li> Disegnare una regione di interesse (ROI) all&#39;interno del nucleo di una cellula utilizzando l&#39;immagine campo chiaro o il canale etichetta nucleare (se utilizzato) e aggiungerlo al gestore ROI. Nota: Se le cellule imaged hanno un&#39;etichetta nucleari (ad esempio, istone H2B-EGFP.), Quindi il monitoraggio delle cellule automatica può essere utilizzata per creare regioni di interesse (ROI) che rappresenta i singoli nuclei attraverso il tempo. </li><li> Passare al successivo punto di tempo e posizionare la ROI all&#39;interno della stessa nucleuS. Aggiungere il ROI al gestore ROI. </li><li> Continuare a monitorare e rendere ROI per la singola cella fino a quando c&#39;è un evento cellulare (mitosi, apoptosi, ecc.) O la cellula non può più essere rintracciato (es., Si muove fuori cornice o termine dell&#39;esperimento). </li><li> Quando ROI sono state stabilite per cellule attraverso il tempo che sono nel campo, sovrapporle sui canali fluorescenti di interesse. Misurare l&#39;intensità media della fluorescenza in ciascun canale per ogni punto di tempo. Salvare l&#39;elenco ROI per un uso successivo. <ol><li> Varie misurazioni possono essere effettuate entro il ROI per applicazioni in diversi esperimenti. Clicca Analisi → Imposta Misure ... per far apparire un menu per scegliere il metodo analitico (ad es., Intensità media all&#39;interno del ROI, intensità integrata, ecc.). </li></ol></li><li> Nota destino di singole celle (ad es., L&#39;apoptosi, la divisione, sopravvivenza) tenendo traccia. Ciò consente la creazione di curve di sopravvivenza e furtheanalisi R popolazione. </li><li> Con l&#39;intensità media per entrambi i canali, creare un diagramma a dispersione per visualizzare dinamiche del ciclo cellulare in risposta terapeutica (Figura 5B, C). Nota: trame possono essere creati per singole celle nel tempo o mediate su una popolazione di cellule cingolati. imaging quantitativo può essere fondamentale per la creazione di risposte complesse e relazioni di cellule in risposta a terapie contro il cancro. A lungo termine la microscopia time-lapse, il monitoraggio longitudinale e l&#39;analisi dei dati è un processo multi-step, con molte opzioni per il tipo di strumenti di microscopia ed analisi, e segue lo schema generale di figura 1. </li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Vantaggi di Microscopia time-lapse e monitoraggio longitudinale Il microscopio è uno strumento ideale per gli studi longitudinali di risposta ai farmaci in quanto consente ai ricercatori di monitorare le singole cellule e il loro destino, nonché l&#39;intera popolazione. La variabilità della risposta ai farmaci all&#39;interno di una popolazione di cellule è una questione importante per l&#39;anti-cancro disegno terapeutico. monitoraggio longitudinale di singole cellule ...

microscopia Live-cell e il monitoraggio longitudinale di singole cellule, non è una nuova tecnica. Fin dai primi microscopi, gli appassionati e gli scienziati hanno osservato e studiato singole cellule e organismi, i loro comportamenti, e lo sviluppo 1-3. Un esempio famoso della fine del David Rogers alla Vanderbilt University nel 1950 mostra un neutrofili umano in uno striscio di sangue a caccia di un batterio Staphylococcus aureus e, infine, il processo di fagocitosi 4. Questo film live-cell è un eccellente esempio di come i processi multipli possono essere osservati e correlati in un singolo esperimento: rilevamento di un gradiente di chimica, la meccanica e la velocità della motilità cellulare, cellule forme dinamiche, l&#39;adesione e la fagocitosi di un agente patogeno. L&#39;avvento di microscopi completamente automatizzati e fotocamere digitali ad alta sensibilità ha portato ad un crescente numero di ricercatori che utilizzano la microscopia di porre domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule che vanno from come le cellule si muovono 5,6 e 7,8 per dividono organelli dinamica e traffico di membrana 9-11. Non fluorescente, in campo chiaro microscopia, tra cui contrasto di fase (PC), che ha ottenuto il premio Nobel per Frits Zernike nel 1953, e il contrasto di interferenza differenziale (DIC) consentire l&#39;osservazione di cellule e nuclei ma anche strutture sub-cellulari, tra cui fasci microtubuli , cromosomi, nucleoli, dinamica organelli, e fibre di actina spessore 12. Geneticamente codificato proteine ​​fluorescenti e lo sviluppo di coloranti fluorescenti contro organelli hanno notevolmente influenzato time-lapse microscopia a 13-15. Pur non essendo il focus di questo articolo, l&#39;imaging in sferoidi di cellule e in situ (microscopia intravitale) utilizzando la microscopia confocale e multiphoton rappresentano un&#39;altra espansione dell&#39;approccio, e non ci sono articoli in sospeso che usano e trattano questi approcci 16-19. Le risposte delle cellule di anti-cancfarmaci er o prodotti naturali sono determinate sulla scala molecolare e cellulare. Comprensione delle risposte cellulari e sorti in seguito al trattamento spesso comporta saggi popolazione della media (ad es., Immunoblotting, misure e integrali), o il tempo-punti fissi con il rilevamento di immunofluorescenza e citometria a flusso, che misurano singole cellule. L&#39;eterogeneità nelle risposte delle cellule singole a farmaci all&#39;interno di una popolazione, in particolare nei tumori, può spiegare alcune delle variabilità nella risposta visto attraverso le linee cellulari e tumori che vengono trattati con lo stesso farmaco a saturazione. A lungo termine approcci longitudinali seguire una determinata cella singola o di una popolazione di cellule è un approccio meno comune ma molto potente che consente lo studio diretto di percorsi risposta molecolare, diversi fenotipi (ad es., Morte cellulare o divisione cellulare), osservazione cella-a-cella di variabilità all&#39;interno di una popolazione, e come questi fattori contribuiscono alla dinamica di risposta della popolazione 20-22. Ottimisticamente, essendo in gradodi osservare e quantificare le risposte delle cellule singole contribuirà a migliorare la nostra comprensione di come funzionano le droghe, il motivo per cui a volte falliscono, e come li utilizzano al meglio. La tecnica di lungo termine microscopia time-lapse, il monitoraggio longitudinale, e l&#39;analisi delle risposte farmaco è disponibile per molti ricercatori e può essere semplice, utilizzando solo la luce trasmessa per osservare le risposte fenotipo 20,21. I componenti principali del metodo sono: la corretta preparazione delle cellule di interesse, un microscopio automatizzato con camera ambientale, una fotocamera integrata con un computer per acquisire e memorizzare le immagini, e il software di rivedere il time-lapse e misurare e analizzare le cellule e qualsiasi biosensori fluorescenti. Forniamo un protocollo dettagliato con molti suggerimenti per lo svolgimento di time-lapse microscopia di cellule in coltura per tutto il tempo diversi giorni con campo chiaro e / o la microscopia epifluorescente widefield. Questo protocollo può essere utilizzato per qualsiasi linea cellulare che può essere coltivata in colturaper studiare le loro risposte alle terapie anti-cancro. Forniamo esempi di dati acquisiti e analizzati utilizzando più biosensori fluorescenti geneticamente codificati diversi e un esempio di microscopio a contrasto di fase, discutere brevemente i diversi tipi di sonde, i vantaggi e gli svantaggi di lungo termine time-lapse e il monitoraggio longitudinale, ciò che può essere imparato a questo approccio che è difficile da capire da approcci non-diretti, e alcune variazioni che speriamo essere di interesse e valore per i ricercatori inesperti che non hanno pensato di utilizzare l&#39;approccio, e di ricercatori esperti.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>microtubule stabilizing drug</td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>topoisomerase II inhibitor</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>XPO1/CRM1 inhibitor, gift</td></tr><tr><td>Kinesin-5 inhibitor</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Cell growth medium</td><td>HyClone (Fisher) or Mediatech</td><td></td><td>many companies available</td></tr><tr><td>5% CO2/balance air, certified</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish, 20 mm glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>35 mm Dish, gridded glass bottom</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>Multi-well, glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB controller</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III motorized stage</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV chamber</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Environmental Controller Unit</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon laser launch</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA light engine</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT inclubation chamber</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics

La risposta di singole cellule di farmaci anti-cancro contribuiscono a determinare la risposta della popolazione, e quindi è un importante fattore nel risultato complessivo. Immunoblotting, citometria a flusso e esperimenti sulle cellule fisse sono spesso utilizzati per studiare come le cellule rispondono ai farmaci anti-cancro. Questi metodi sono importanti, ma hanno diversi difetti. La variabilità della risposta ai farmaci tra il cancro e cellule normali, e tra le cellule di origine diversa cancro, e transitori e le risposte rare sono difficili da capire usando saggi popolazione calcolo della media e senza essere in grado di monitorare direttamente e analizzarli in senso longitudinale. Il microscopio è particolarmente adatto a cellule vive di immagine. Gli avanzamenti nella tecnologia ci permettono di ordinariamente celle di immagine con una risoluzione che consente non solo di inseguimento cellulare, ma anche l&#39;osservazione di una varietà di risposte cellulari. Descriviamo un approccio in dettaglio che permette di imaging continuo time-lapse dicellule durante la risposta ai farmaci essenzialmente per il tempo desiderato, in genere fino a 96 ore. Utilizzando varianti dell&#39;approccio, le cellule possono essere monitorati per settimane. Con l&#39;impiego di organismi geneticamente codificati biosensori fluorescenti processi numerosi, i percorsi e le risposte possono essere seguite. Mostriamo esempi che includono il monitoraggio e la quantificazione della crescita cellulare e la progressione del ciclo cellulare, la dinamica dei cromosomi, danni al DNA, e la morte cellulare. Discuteremo anche le variazioni della tecnica e la sua flessibilità, e mettere in evidenza alcuni problemi comuni.

A lungo termine time-lapse microscopia e di monitoraggio longitudinale diretta consente per lo studio di molti effetti anti-cancro durante la risposta ai farmaci. Seguendo lo schema generale della figura 1, più esempi di cellule sono mostrati esprimere reporter fluorescenti convalidati trattata con farmaci antitumorali, cingolati e analizzati utilizzando approcci diversi. Fase microscopio a contrasto da solo ...

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Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Research

JoVE Journal

Medicine

11.0K Views.  University of Colorado, Boulder. Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Video: Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., proliferation, migration, and others) and in vivo models have been developed to investigate and characterize angiogenic and non-angiogenic cell phenotypes, these methods are time and labor intensive, and often require expensive reagents and instruments, as well as significant expertise. In a recent study, we used a novel quantitative phase imaging (QPI) technique to conduct time-lapse and labeling-free characterizations of angiogenic and non-angiogenic human osteosarcoma KHOS cells. A panel of cellular parameters, including cell morphology, proliferation, and motility, were quantitatively measured and analyzed using QPI. This novel and quantitative approach provides the opportunity to continuously and non-invasively study relevant cellular processes, behaviors, and characteristics of cancer cells and other cell types in a simple and integrated manner. This report describes our experimental protocol, including cell preparation, QPI acquisition, and data analysis.

Dormant and active cancer cell phenotypes were characterized using quantitative phase imaging. Cell proliferation, migration, and morphology assays were integrated and analyzed in one simple method.

Una fase di time-lapse, privo di etichetta, quantitativa Imaging Studio delle cellule tumorali umane dormienti e attivo

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

A lungo termine Live cell Imaging per valutare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

Imaging intravitale longitudinale del comportamento delle cellule tumorali cerebrali in risposta a una biopsia chirurgica invasiva

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Medicina

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologia

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Seguita dalla singola cellula di rilevamento a Monitor biologia cellulare e la progressione di lignaggio di popolazioni neurali Multiple immagini dal vivo

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Neuroscienze

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Utilizzo In Vitro cellule vive di Imaging per esplorare chemioterapici consegnato da nanoparticelle di basata sui lipidi

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...