Vorremmo riconoscere il sostegno finanziario della MRC Regno Unito (G0800498). Vorremmo anche ringraziare il professor JM Fritschy, Università di Zurigo, per fornire il GABA A -R specifica subunità γ2 anticorpi e il professor R. Harvey, UCL Facoltà di Farmacia, per fornire la pcDNA 3.1 (+) vettori di espressione contenenti la resistenza agli antibiotici geni per la produzione di linee cellulari stabilmente trasfettate HEK293.

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Anche se questo protocollo non è tecnicamente difficile da eseguire, ci sono diversi passaggi critici che devono essere seguite per raggiungere le più accurate e ripetibili saggi di co-coltura. In primo luogo, colture di neuroni medio spinosi devono essere seminate ad una densità ottimale. Se seminato troppo poco, i neuroni tendono a svilupparsi molto lentamente e la sopravvivenza è notevolmente ridotto. D&#39;altra parte, se seminato troppo densamente, neuroni tendono ad aggregarsi che compromette l&#39;analisi dei contatti con cellule HEK293. In secondo luogo, si consiglia di esprimere transitoriamente un reporter fluorescente GFP o mCherry in cellule HEK293 che esprimono stabilmente recettori GABA A, prima di loro platting in co-coltura. Ciò consente il riconoscimento affidabile di cellule HEK293, che possono essere compromesse dalla somiglianza nella forma e dimensione tra queste cellule e rari cellule glia sopravvivere in colture neuronali. Per ottenere la trasfezione efficiente con GFP o mCherry cDNA, linee cellulari HEK293 devono essere in fase di crescita esponenziale eseminate ad una densità appropriata in piastre da 6 pozzetti. Semina Sparse seguito da trasfezione farà sì che le cellule a crescere poco, mentre oltre-semina impedisce alle cellule di prendere il cDNA. Idealmente, le cellule devono essere seminate in modo che siano tra il 70 - 90% confluenti il ​​giorno della trasfezione. In terzo luogo, trasfezione deve essere ottimizzato per ciascuna linea cellulare utilizzata, come alcune linee cellulari sono più sensibili rispetto agli altri. Questo perché GABA costitutiva Un&#39;espressione R in cellule HEK293 riduce la sopravvivenza delle cellule e la capacità delle cellule di recuperare dopo trasfezione. Inoltre, la sopravvivenza dipende dal tipo di GABA A Rs espressi in cellule HEK293, con alcune linee cellulari essendo significativamente più sensibile rispetto agli altri. La trasfezione usando il reagente liposomiale è un metodo ottimale per esprimere proteine ​​estranee in rapida crescita di linee cellulari, fornendo sia l&#39;elevata efficienza di trasfezione e livello di espressione. Tuttavia, questo reagente provoca troppi danni a crescita lenta linee cellulari, perche utilizziamo regolarmente un reagente di trasfezione non liposomiale. Ciò funziona in modo simile al reagente liposomiale ma la quantità di DNA necessario per la trasfezione efficace è significativamente ridotta. Questo permette una maggiore sopravvivenza cellulare (circa l&#39;80 - 90% rispetto al 60% utilizzando il reagente liposomiale) ma con bassa efficienza di trasfezione (60%). Infine, il numero di HEK293 controllo o α1 / β2 / γ2 HEK293 cellule che esprimono aggiunti a colture neuronali deve essere ottimizzato. L&#39;aggiunta di troppo poche cellule compromette l&#39;analisi di successo di contatti tra le cellule HEK293 e neuroni, perché diventano molto raro. Al contrario, l&#39;aggiunta di un numero eccessivo di cellule HEK293 provoca la morte delle cellule neuronali entro poche ore. Culture medio spinosa neuroni embrionali dovrebbero idealmente essere preparate utilizzando tessuto striatale sezionato dall&#39;età embrionale 15 - 17. Tuttavia, spesso accade che gli embrioni sono leggermente più giovani o più vecchie del periodo ottimale. In questo caso, il numero di neuroni seminati in coltura saràdevono essere variato. Tessuto che è più giovane di E15 può avere bisogno di essere testa di serie con una densità leggermente inferiore, mentre il tessuto che è più vecchio di E17 può avere bisogno di essere seminate ad una densità più elevata, per permettere la sopravvivenza delle cellule ottimale. Inoltre, citosina arabinoside (Ara-C) può essere necessario aggiungere alle culture più anziani per prevenire la crescita di cellule gliali, che è più abbondante nel tessuto vecchio. Quando si crea co-colture, è importante placcare il numero ottimizzato di HEK293 trasfettate o / β2 / γ2 HEK293 cellule esprimenti α1, come detto sopra. Tuttavia, può essere necessario determinare questo per ogni linea singola cella, a causa delle differenze nelle loro sopravvivenza. Tipicamente 30.000 cellule in un volume massimo di 50 microlitri dovrebbero essere aggiunti a ciascun pozzetto di un piatto a 24 pozzetti, che già contiene 500 ml di terreno di coltura neuronale, come questo assicura che il mezzo condizionato neuronale non è diluito troppo e che le condizioni all&#39;interno di ogni bene rimanere abbastanza costante, ad esempio, </em&gt; Concentrazione di fattori di crescita. Aggiunta di volumi superiore a 50 ml per ogni pozzetto sarà generalmente uccidere i neuroni. Uno dei principali inconvenienti della tecnica di co-coltura è che le colture neuronali sono creati da cellule dissociate coltivate in monostrato, che significa che i neuroni sono stati rimossi dal loro microambiente normale e sono in grado di stabilire la loro normale organizzazione anatomica. Di conseguenza mancano i collegamenti appropriati, gli ingressi e le molecole secrete da altre cellule che possono influenzare le fasi iniziali dello sviluppo delle sinapsi. Ad esempio, in vivo neuroni spinosi medi sono densamente innervati dal ingressi glutamatergiche dalla corteccia, talamo e altre regioni del cervello 34, tuttavia, nelle nostre colture neuronali sinapsi glutammatergica non formano perché questi ingressi sono danneggiati durante la dissezione del tessuto striatale. Come l&#39;assenza di sinapsi glutamatergiche funzionali in colture di neuroni spinosi medi affette la loro capacità di formare sinapsi GABAergici tra loro e / o cellule HEK293 che esprimono GABA A R rimane una questione aperta. La questione potrebbe essere facilmente risolto coltura neuroni spinosi medi insieme con i neuroni glutamatergici corticali consentendo loro di formare sinapsi funzionali 35 precedenti l&#39;aggiunta di cellule HEK293. Un approccio alternativo sarebbe quello di progettare un sistema modello di co-coltura sulla base di culture fetta organotipica, che mantengono alcuni dei citoarchitettura che può essere importante per la maturazione e la formazione di sinapsi. Tuttavia, culture fetta organotipica hanno neuropilo densa ed eterogenea, che può compromettere l&#39;analisi effettuata qui. Un altro importante svantaggio di utilizzare saggi di co-coltura è che GABAA Rs espresso sulla superficie delle cellule HEK293 non sono raggruppati come sono in neuroni, anche se questo non sembra essere necessario per la formazione delle sinapsi in una espressione superficiale abbastanza alta 30. Ad esempio, nel rcervello Odent e in colture ippocampali, la α1 GABA A R subunità si trova nella maggior parte delle sinapsi GABAergici su tutti i domini post-sinaptici delle cellule piramidali. Tuttavia, l&#39;α2 si trova precisamente in un sottoinsieme di sinapsi sul somata e dendriti, ma è altamente arricchito nel segmento iniziale dell&#39;assone, come rivelato da immunofluorescenza e microscopia elettronica 36. Dato che la formazione di sinapsi in co-colture può ancora essere rilevato in modo affidabile e analizzato 30, questo suggerisce che la densità dei recettori GABA A sulla superficie cellulare delle cellule HEK293 può essere simile o addirittura superiore alla densità di questi recettori all&#39;interno sinaptica cluster di neuroni. Ciò può spiegare, almeno in parte, perché le proteine ​​sinaptiche adesione, quali neuroligin e proteine ​​densità postsinaptica, come gephyrin, non sono necessari per la formazione di sinapsi in co-colture, se sono presenti Rs opportunamente assemblate GABA A a sufficiente densità. È ben documentato che recettori GABA A sono strutturalmente e funzionalmente eterogenea, e che la composizione subunità del recettore determina la loro localizzazione subcellulare e proprietà farmacologiche. Ad esempio, l&#39;incorporazione dei 2 subunità è noto per essere un prerequisito per la localizzazione sinaptica dei recettori GABA A, mentre la subunità è quasi esclusivamente presente in extrasinaptica recettori GABA A. I recettori che incorporano solo αβ combinazioni sono anche pensato di essere prevalentemente localizzato ai domini extrasinaptica 12- 14. Se questa specificità è mantenuta nel nostro sistema di co-coltura può essere facilmente provato da transitoriamente trasfezione 2 o subunità cDNA in linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente α e β subunità, prima di aggiungerli a colture neuronali. I nostri esperimenti preliminari utilizzando questo approccio hanno suggerito che i contatti sinaptici sono facilmente formate solo in presenza della subunità 2, indicando che le specispe- osservata in vivo potrebbe essere conservato in vitro (dati non mostrati). Inoltre, recettori GABA A che incorporano diverse subunità α sono selettivamente localizzati ai contatti sinaptici formati con specifici tipi di neuroni presinaptici. Ad esempio, nel globo pallido, le Rs α1-GABA A si trovano generalmente a striatopallidali (str-GP) e palliopallidal (GP-GP) sinapsi, che si trovano sui dendriti e regioni somatiche dei neuroni spinosi medi, rispettivamente. Le Rs α3-GABA A si trovano in regioni perisomatic di neuroni spinosi medi e vengono contattati da garanzie reali GP assoni locali, mentre le Rs α2-GABA A si trovano su dendriti distali di questi neuroni e contattato principalmente da input dallo striato 32. L&#39;espressione di specifiche subunità α in diversi tipi di sinapsi e nei diversi compartimenti neuronali è stata dimostrata anche in altre aree cerebrali, come Hippocampus 21 e neocorteccia 18,20. Questi risultati sollevano la questione di come le sinapsi inibitorie specifiche si formano nel cervello. Fa l&#39;adesione di uno specifico tipo di terminale presinaptico indurre l&#39;inserimento di specifici sottotipi GABAA R nei punti di contatto? Sono i recettori vittime della tratta a specifiche posizioni subcellulari in base alla loro composizione subunità, in cui il loro inserimento membrana plasmatica è un prerequisito per l&#39;adesione di terminali assonali di origine specifica? Fino ad oggi, queste domande rimangono senza risposta. L&#39;utilizzo di sistemi modello ridotte, quali il sistema di modello di co-coltura, ci permettono di iniziare a rispondere queste domande complesse perché il sistema è facilmente suscettibile di trasfezione dei costrutti di DNA e l&#39;applicazione dei reagenti e, soprattutto, è adatto per l&#39;analisi di imaging cellulare dal vivo 30. Così, con questo sistema modello possiamo iniziare a testare il ruolo delle singole molecole, tra cui diversi tipi di recettori GABA A, san di essere presenti a contatti sinaptici. Un altro vantaggio è che le sinapsi in questa forma modello di sistema rapidamente, in pochi minuti a ore, riducendo la durata degli esperimenti. Sistemi modello simile co-coltura sono stati impiegati con successo in passato per lo screening per le nuove molecole synaptogenic 27,37,38. Capire come il sistema nervoso centrale si sviluppa, matura e forme connessioni tra i neuroni in modo complicato per il controllo, per esempio, il comportamento o la cognizione, è di fondamentale importanza. Questo obiettivo distante sarà possibile soltanto delineando i meccanismi molecolari che governano le singole fasi di riconoscimento e di comunicazione cellula-cellula durante lo sviluppo. A causa della complessità pura, i dettagli molecolari di queste interazioni cellulari multiple possono attualmente essere studiati con precisione solo in sistemi ridotti. Tuttavia, la capacità di aumentare la complessità di questi sistemi esprimendo molteplici combinazioni di proteine ​​e studiare comeessi interagiscono presenta alcuni vantaggi rispetto, per esempio approcci soppressione genetica. Questo perché l&#39;interpretazione accurata degli effetti di un singolo gene delezione è spesso compromessa dai cambiamenti associati con meccanismi di compensazione mascheramento gli effetti di lesioni originali, in particolare nel cervello in via di sviluppo. La tecnica ma informativo co-coltura semplice qui descritto ha consentito la scoperta del ruolo strutturale di recettori GABA A nella formazione delle sinapsi e ha aperto la possibilità di studiare come recettori GABA A e di altre molecole di adesione cellulare e / o di proteine ​​della matrice sinaptica interagiscono tra loro durante la sinaptogenesi. Proteine ​​della matrice sinaptiche sono di particolare interesse dato che hanno recentemente dimostrato di giocare un ruolo chiave nella formazione del glutammato sinapsi 39. Ulteriore sviluppo di modelli di co-coltura è importante perché essi hanno il potenziale per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi molecolari che guidano la &#39;normale &amp;# 8217; lo sviluppo del cervello e, quindi, aumentare la nostra comprensione di come questi meccanismi sono alterati in numerose malattie dello sviluppo neurologico, come l&#39;epilessia, la schizofrenia, i disturbi dello spettro autistico e molti altri.

GABA è uno dei primi neurotrasmettitori presenti nel cervello embrionale, che precede il più abbondante neurotrasmettitore eccitatorio glutammato 1. Durante lo sviluppo, GABA depolarizza ed eccita i neuroni immaturi, giocando un ruolo chiave nella regolazione della proliferazione cellulare, la migrazione e la formazione di reti neuronali senza indurre eccitotossicità. Nel cervello adulto, il potenziale di inversione per GABA A canali recettore viene spostata verso potenziali più negativi a causa di una diminuzione della concentrazione intracellulare di cloruro. Questo spostamento è causato da up-regolazione del potassio cloruro di co-trasportatore (KCC2), che trasporta cloruro fuori dalla cellula, e, in parallelo, down-regolazione del trasportatore sodio-potassio cloruro (NKCC1), che ha l&#39;effetto opposto 2. Nel cervello, il GABA si lega principalmente al recettore GABA sia A o GABA B di mediare l&#39;inibizione sinaptica veloce o lenta, rispettivamentely. Recettori GABA A sono una classe di recettori noti anche come ionotropici heteropentameric o canali ionici Cys-loop di ligando-dipendenti. Due molecole di GABA sono necessari per l&#39;attivazione del recettore, che è permeabile agli ioni cloruro e in misura minore, ioni bicarbonato. L&#39;aumento in cloruro di conduttanza diminuisce l&#39;efficacia depolarizzanti, eventi eccitatori nell&#39;attivare il neurone postsinaptico 3. Diversità strutturale dei recettori GABA A è da tempo riconosciuta come un fattore chiave nel determinare la loro vasta gamma di proprietà funzionali e farmacologiche. Rs Native GABA A sono etero-pentamers composti da subunità con più isoforme classificati come: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π e θ 3, con un comune topologia transmembrana comprendente un ampio dominio N-terminale extracellulare, quattro domini transmembrana (TM), e un importante dominio intracellulare tra TM 3 e 4 4. Ilβ3 e γ2 subunità sono essenziali per l&#39;inibizione sinaptica e la sopravvivenza dell&#39;organismo, in quanto topi portatori di delezione genetica di queste subunità muoiono dopo la nascita 5,6. Al contrario, le singole isoforme di subunità α sono importanti per la funzione di specifiche connessioni sinaptiche nel cervello associata con differenti comportamenti come ansia, sedazione, eccitazione, e altri, ma non sono, singolarmente, essenziale per la vita 7-9. Recettori GABA A sono i principali siti di azione per una varietà di farmaci con potenti sedativi, ipnotici, ansiolitici e gli effetti anticonvulsivanti, quali le benzodiazepine, barbiturici, neurosteroidi e anestetici 7,10,11. Rs Synaptic GABA A in genere contengono una subunità γ2, due subunità β (più comunemente β2 β3 o) e due subunità α (α1, α2, α3 o α5) 12,13. La classe predominante di recettori extra sinaptica contiene la subunità δ in combinazionecon due subunità α (α4 o α6), e due subunità β (β2 β3) o 14. Localizzazione subcellulare di GABA A R verso assoni, dendriti e soma, e l&#39;inserimento nella membrana plasmatica dipendono dalla presenza di β-subunità 15,16. Tuttavia, l&#39;incorporazione selettiva di diversi GABA A R sottotipi in distinti tipi di sinapsi correla bene con la presenza di specifiche subunità α (α1, α2, α3 o α5) 7,17,18. È importante sottolineare che la cancellazione di α1 o α2 subunità nei topi causa alterazioni ultrastrutturali di sinapsi inibitorie 19. Ciò suggerisce che il GABA A loro RS può svolgere un ruolo diretto nella regolazione della formazione delle sinapsi. Le prove indicano che lo sviluppo delle sinapsi GABAergica è una sequenza precisamente coordinato di eventi, in cui entrambi gli obiettivi neuronali contattati da diversi tipi di assoni inibitori e recettori che vengono raggruppati inciascuna classe di sinapsi inibitorie sono selettivi e funzionale in sintonia 17,20-22. Questo principio fondamentale di specificità a livello delle sinapsi GABAergici solleva la questione di come i partner pre- e post-sinaptici riconoscono l&#39;un l&#39;altro durante l&#39;avvio di contatti sinaptici. In vitro co-coltura sono state applicate con successo per studiare alcuni meccanismi di formazione delle sinapsi e per testare il ruolo delle singole proteine-leporino attraversa sinaptici in questo processo. Una delle combinazioni più comuni trans-sinaptica interagenti proteine ​​che funzionano in modo bidirezionale di mediare la formazione di sinapsi e la maturazione, sono il neurexins (Nrxns) e neuroligins (NLS). Nrxns sono proteine ​​presinaptiche che presentano splicing alternativo all&#39;interno dei loro domini di proteine ​​leganti gli ormoni laminina-neurexin sesso, dando luogo a molte isoforme differenti 23. Mentre il Nrxns anche interagire con altre proteine, NLS si pensa di essere il loro onnipresente pa postsinapticortners 24. Insieme, queste proteine ​​contribuiscono a tenere le membrane presinaptiche e post-sinaptici in stretta e rigida apposizione 25. Le due isoforme più abbondanti sono NL-1 e NL-2, che sono presenti in sinapsi eccitatorie ed inibitorie, rispettivamente 26. Uno dei primi sistemi modello di co-coltura, progettato per studiare le interazioni proteina trans-sinaptici, impiegati diversi tipi di cellule non neuronali, linee cellulari più comunemente immortali come embrionali umane di rene (HEK) 293 cellule, di NL- over-express 2. Quando queste cellule sono state coltivate con neuroni pontini, è stato osservato un accumulo di proteine ​​presinaptiche in prossimità della superficie delle cellule HEK, indicando la formazione di contatti sinaptiche simili. L&#39;aggiunta di β-solubile neurexin a questi co-culture ha inibito la formazione di contatti, suggerendo che le interazioni trans-sinaptica tra Nrxns e NLS sono necessari per il contatto sinaptico formazione 27. Inoltre, espressione transientedi β-neurexin in cellule COS (C V-1 (scimmia) in O rigine, e che trasportano il materiale genetico S V40) co-coltura con dissociato glutammatergico ippocampale e neuroni GABAergici espressione indotta della proteina gephryin postsinaptica e di subunità GABA A R γ2 e α2 nei punti di contatto tra questi due tipi di cellule 28. Un altro esempio di un modello di co-coltura utilizzato per studiare la formazione delle sinapsi coinvolte HEK293 cellule, transitoriamente trasfettate con GABA A R subunità α2 / β3 / γ2 e NL-2, e una popolazione mista di neuroni ipotalamici 29. Questo studio ha concluso che l&#39;espressione di NL-2 è un requisito assoluto per la formazione di sinapsi inibitorie. Α1 Tuttavia, nel recente studio di co-coltura, stabilmente transfettate / β2 / γ2 GABA A R in cellule HEK293 sono risultati sufficienti per indurre sinapsi funzionali quando co-coltura con med GABAergicineuroni spinosi IUM, senza la necessità di ulteriori proteine ​​di adesione trans-sinaptici o post-sinaptici. Tuttavia, un aumento di primo piano nella formazione delle sinapsi e la forza è stata osservata quando è stato co-espresso NL-2 con GABA A Rs 30. Ciò indica che questo sistema modello di co-coltura ha vantaggi rispetto ai sistemi modello precedentemente descritti, più evidentemente una maggiore sensibilità ed affidabilità di rilevamento contatto sinaptico. Due fattori importanti che contribuiscono al miglioramento complessivo della rilevazione dei contatti sinaptici sono: i) uso di linee cellulari stabilmente trasfettate HEK293 con espressione elevata e costante della subunità GABA A R sulla superficie di cellule singole. Tale coerenza facilita il confronto quantitativo tra le diverse condizioni di co-coltura. ii) L&#39;uso di una popolazione pura di neuroni GABAergici medio spinosi coltivate dallo striato embrionale 31 rimuove complicazioni e ambiguità derivanti dall&#39;uso delle popolazioni neuronali miste e alloWS, per esempio, selezione dei più appropriati tipi postsinaptici GABA A R che possono essere comparati con l&#39;altro durante la formazione delle sinapsi. La formazione di sinapsi è pensato di coinvolgere molti segnali trans-sinaptici all&#39;interno di complessi di adesione cellulare pre- e post-sinaptici. A causa della natura bidirezionale di segnalazione sinaptica ed i numeri puri di molecole di adesione cellulare, è difficile identificare i componenti chiave coinvolti nella formazione di sinapsi. Così, transfezione una singola proteina di adesione cellulare in una cellula non neuronali (in questo caso, i due bersagli postsinaptici prevalenti del GABAergici neuroni medio spinosi in vivo, α1 / β2 / γ2 o α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) notevolmente riduce la complessità dei segnali trans-sinaptica disponibili in superficie postsinaptico e permette una precisa analisi quantitativa dell&#39;efficacia di questa proteina nel promuovere la formazione di sinapsi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1601">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name</td>
			<td style="width:627px;">Company/Individual</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:396px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11960-044</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25030-024</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15070-063</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10106-169</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">21103-049</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">B27 Supplement</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glucose</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G8769</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HBSS (10X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14180-046</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15630-056</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">PBS (1X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10010-031</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)</td>
			<td rowspan="2" style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">V790-20</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V860-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V870-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Stable HEK&#945;1&#946;2&#947;2 line</td>
			<td style="width:627px;">Sanofi-Synthelabo, Paris</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1149</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">G418 disulfate salt (Geneticin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G5013</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Phleomycin D1 (Zeocin)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">R25001</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10687-010</td>
			<td style="width:396px;">Danger: toxic, irritant and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25300-054</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use Danger: Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6282</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Laminin</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">L2020</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">100 &#956;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">734-0004</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C1768</td>
			<td style="width:396px;">Danger: Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Chelating agent (Versene)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15040-033</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:469px;">liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15338-100</td>
			<td style="width:396px;">Alternative transfection method: Effectene Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)</td>
			<td style="width:627px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:111px;">301425</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11058-021</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">105311C5</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal A</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10888-022</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:111px;">27810.364</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glycine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1726</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A3294</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:469px;">Guinea pig anti-&#947;2 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Prof. Jean Marc Fritschy</td>
			<td rowspan="3" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">J. Comp. Neurol. 359 (1) 154&#8211;194 (1995).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:627px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">H5141</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB351</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-synapsin antibody</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">106-011</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-&#946;2/3 antibody (BD17)</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB341</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:469px;">Rabbit anti-&#945;1 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Professor Anne Stephenson</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP1085</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP124S</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A31553</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A21422</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A11008</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;"><a name="RANGE!A49">Mounting reagent (Prolong Gold)</a></td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">P36930</td>
			<td style="width:396px;">Use at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Il protocollo per questo modello di sistema di co-coltura di cellule neurone-HEK293 è stato finemente sintonizzato per consentire la sopravvivenza delle cellule ottimale. In questo sistema, la formazione di contatti sinapsi-simili e loro analisi si basa su espressione stabile e coerente di tutti e tre subunità GABA A R che assemblano in un recettore funzionale. È quindi importante utilizzare analisi immunocitochimica di prova per subunità espressione sulla superficie delle cellule HEK293 prima di aggiungerli a colture neuronali. In questi esperimenti, espressione di superficie cellulare di α1, β2 e subunità γ2 (Figura 1A), o α1, β3 e γ2 subunità (Figura 1B), è stato rilevato utilizzando anticorpi specifici subunità che si legano agli epitopi extracellulari di queste subunità. Un alto grado di co-localizzazione tra queste subunità sulla superficie HEK293 è stata dimostrata. Dopo aver confermato l&#39;espressione di superficie e co-localizzazione di GABA ASubunità R in HEK293 cellule, co-colture sono state preparate utilizzando HEK293 cellule che esprimono le subunità α1 / β2 / γ2 GABA A R e neuroni medio spinosi in coltura per 14 giorni (14 giorni in vitro (DIV)). Le cellule in co-coltura sono state incubate per 24 ore, fissa e analizzati con immunocitochimica e microscopia confocale. Analisi dei contatti indicato che assoni terminali GABAergici GAD65-positivi formate solo contatti sporadici con controllo HEK293 cellule (Figura 2A, 2B). Il numero di contatti rilevati in 4 ore era 7,3 ± 0,9 per cellulare HEK293, e questo numero è stato ridotto a 5,5 ± 0,5 connessioni (media ± SEM) per cella HEK293 a 24 ore dopo l&#39;aggiunta di cellule HEK293 ai neuroni in coltura. Al contrario, i terminali GAD65-positivi assoni GABAergici formano numerosi contatti sinapsi-come con cellule HEK293 che esprimono recettori GABA A. Il numero di contatti ottenuti a 4 ore dopo l&#39;aggiunta di cellule HEK293 era 28,3 ± 4,7 per cella HEK293, e questo numero è stato un ulteriore aumentod di 52,1 ± 6,3 (media ± SEM) per cella HEK293 a 24 ore in co-coltura (Figura 2A, 2B). Per determinare se questi contatti sinapsi, come fossero &#39;attivi&#39;, vale a dire supportato rilascio del trasmettitore vescicolare, un anticorpo Cy5 coniugato vescicole-luminale specifico del dominio anti-synaptotagmin è stato aggiunto al mezzo di co-coltura dopo 23 ore di incubazione. Questo anticorpo è incorporato in terminazioni nervose presinaptiche solo quando si forma un poro tra il lume vescicole sinaptiche e il liquido extracellulare nella fessura sinaptica durante il rilascio dei neurotrasmettitori. Dopo il rilascio, il poro si chiude, lasciando il synaptotagmin immunofluorescenza Cy5 coniugato attaccato al synaptotagmin all&#39;interno della vescicola. In questo modo, solo le vescicole attivamente impegnati nel rilascio di neurotrasmettitore sono etichettati con l&#39;anticorpo. In questi esperimenti pochi se eventuali contatti tra il controllo HEK293 cellule e dei terminali dei neuroni medio spinosi erano &#39;attiva &amp; #8217; come mostrato dalla mancanza di co-localizzazione tra la presinaptico GAD65 / synaptotagmin fluorescenza e mCherry fluorescenza in cellule HEK293 (Figura 3A). Al contrario, molti contatti &quot;attivi&quot; si sono formate tra i terminali dei neuroni spinosi medi e α1 / β2 / γ2-cellule che esprimono HEK293, come rivelato da un alto grado di co-localizzazione tra GAD 65 / synaptotagmin e mCherry, espressa in particolare nelle cellule HEK293 ( Figura 3B). Α1 Per verificare se un diverso sottotipo di GABA A R può anche promuovere la formazione di sinapsi, come in vitro, abbiamo co-coltura / β3 / γ2 cellule che esprimono HEK293 con neuroni spinosi medi. Anche in questo caso, di controllo HEK293 cellule raramente hanno ricevuto contatti con sinapsina-positivi terminali presinaptici che raggiungono il 10,8 ± 0,48 contatti al cellulare HEK293 dopo 24 ore in co-coltura (Figura 4A sinistra, 4B) (± SEM media). Tuttavia, le cellule HEK293 che esprimonoα1 / β3 / γ2 forma GABA A Rs significativamente più contatti sinapsi-like con sinapsina-positivi terminali presinaptici dei neuroni spinosi medi che raggiungono 25,3 ± 0,27 (media ± SEM) i contatti per cella HEK293 dopo 24 ore in co-coltura (Figura 4A destra, 4B). Ciò indica che α1 / β3 / γ2 GABAA Rs espresso in cellule HEK293 sono anche in grado di promuovere la formazione di contatti sinaptici, seppure la loro potenza è inferiore alla potenza di α1 / β2 /-γ2 contenenti recettori GABA A. Questi esperimenti indicano che il sistema di co-coltura modello sviluppato nel nostro laboratorio consente l&#39;analisi quantitativa della formazione contatto sinaptica in vitro e valutazione dell&#39;efficacia dei diversi sottotipi di GABA A R in questo processo. Questi esperimenti dimostrano inoltre che i recettori GABA A, oltre ad essere componenti critici funzionali di sinapsi GABAergici, possono svolgere un ruolo chiavenel processo di riconoscimento e di formazione di contatti sinaptici tra neuroni inibitori e le opportune cellule bersaglio neuronali, indipendentemente da altre proteine ​​di adesione sinaptiche. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. immunocitochimica analisi di espressione del GABA A R α1 / β2 / γ2 o α1 / β3 / γ2 nelle linee di cellule HEK293 stabili. Gli anticorpi che riconoscono i domini extracellulari di subunità GABA A R sono stati usati per i recettori di etichette espresse sulla superficie cellulare. ( A) linea cellulare HEK293 che esprimono α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) e γ2 (Cy5) ad alti livelli. (B) linea cellulare HEK293 che esprimono α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) e γ2 (Cy5)subunità ad alti livelli. Scala bar:. 10 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. neuroni GABAergici di medie spinosi formano contatti sinapsi-like con α1 / β2 / γ2- che esprimono le cellule HEK293 in co-coltura. (A) l&#39;etichettatura fluorescente di terminali presinaptici con anticorpi anti-GAD65 (in verde) e le cellule HEK293 con mCherry (in rosso, a sinistra) o del GABA A R subunità γ2 (in blu, a destra), i punti di co-localizzazione tra queste ha rivelato marcatori che indicano la formazione di contatti sinapsi, come dopo 4 o 24 ore in co-coltura. Scala bar:. 10 micron (B) Analisi quantitativa di sinapsi, come co<html> ntacts. Cellule HEK293 sono stati identificati in base alla loro forma, come rivelato da DIC imaging e / o l&#39;espressione mCherry, e il numero di contatti tra GAD-65 puncta positivo (in verde) e la superficie di cellule HEK293 è stato contato occhio in ciascuna sezione ottica di un Serie Z-stack (8 - 10) per cella utilizzando il software di imaging, ed espressa come numero di contatti / cell. Il grafico mostra il numero di contatti tra neuroni medi spinosi e controllo HEK293 cellule (grigio chiaro) o / β2 cellule / γ2-HEK293 α1 (nero) dopo 4 e 24 ore in co-coltura (media ± SEM, n = 8 in ogni condizione da due esperimenti indipendenti). Questo dato è stato modificato da Fuchs et al. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html> annuncio / 52115 / 52115fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; R Figura 3. GABA A promuovere la formazione di contatti sinaptici attivi. Immunomarcatura di contatti sinapsi, come si formano dopo 24 ore di co-coltura tra i terminali dei neuroni medio spinosi positivi per GAD65 (Alexa Fluor 405 ciano) e (A) di controllo HEK293 cellule, o (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 cellule, sia transitoriamente trasfettate con mCherry costruire (rosso). Contatti attivi sono identificati da co-localizzazione tra la vescicola luminale specifico dominio anticorpo anti-synaptotagmin (Cy5) e di anticorpi specifici per GAD65 sia nei terminali presinaptici, e mCherry espressi in cellule HEK293. Scala bar:. 10 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> IGURA 4 &quot;fo: content-width =&quot; &quot;src =&quot; 6in / file / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 4. neuroni GABAergici di medie spinosi formano contatti sinapsi-like con α1 / β3 / subunità γ2- esprimere HEK293 cellule in co-coltura. (A) l&#39;etichettatura fluorescente di terminali presinaptici con anti-sinapsina I anticorpi (in verde), e controllo HEK293 cellule (a sinistra), o α1 / β3 / γ2 cellule che esprimono HEK293, sia transitoriamente trasfettate con mCherry (in rosso), i punti di rivelato co-localizzazione tra questi marcatori che indicano la formazione di contatti sinapsi, come dopo 24 ore in co-coltura. Scala bar: 10 micron (B). L&#39;analisi quantitativa dei contatti sinapsi-like. Cellule HEK293 sono state identificate dall&#39;espressione mCherry, e il numero di contatti tra synapsin I-positivi puncta (in verde) e la superficie di cellule HEK293 è stato contato occhio in ciascuna sezione ottica di una serie Z-stack (8 - 1.0) per cella utilizzando il software di imaging, ed espressa come numero di contatti / cell. Il grafico mostra il numero di contatti tra neuroni medi spinosi e controllo HEK293 cellule (grigio chiaro) o / β3 cellule / γ2-HEK293 α1 (nero) dopo 24 ore in co-coltura (media ± SEM, n = 8-12 cellule in ciascuna condizione, da due esperimenti indipendenti). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

I meccanismi molecolari che coordinare la formazione di sinapsi inibitorie GABAergici durante l&#39;ontogenesi sono in gran parte sconosciuti. Per studiare questi processi, abbiamo sviluppato un sistema di co-coltura modello che incorpora embrionali i neuroni GABAergici di medie spinosa coltivate insieme stabilmente trasfettate rene embrionale umano 293 (HEK293), le cellule che esprimono i recettori GABA A funzionali.

Inibitorio formazione di sinapsi in un co-coltura modello che incorpora GABAergici di medie spinosa neuroni e cellule HEK293 che esprimono stabilmente GABA<sub&gt; A</sub&gt; Recettori

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

17.3K Views.  University College London.  I meccanismi molecolari che coordinare la formazione di sinapsi inibitorie GABAergici durante l'ontogenesi sono in gran parte sconosciuti. Per studiare questi processi, abbiamo sviluppato un sistema di co-coltura modello che incorpora embrionali i neuroni GABAergici di medie spinosa coltivate insieme stabilmente trasfettate rene embrionale umano 293 (HEK293), le cellule che esprimono i recettori GABA A funzionali. 

Video: Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-imaging di traslocazione della PKC in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

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Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell&#39;orecchio interno del mouse in citometria a flusso

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Un gruppo motore funzionale nella piastra di coltura: Co-coltura degli espianti midollo spinale e le cellule muscolari

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Coltura cellulare primaria di neuroni GABAergici o glutamatergici purificati stabiliti attraverso la selezione di cellule attivate a fluorescenza

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Elettroporazione a cella singola attraverso diverse culture di fette organotipiche di neuroni eccitatori ippocampali del topo e specifici della classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...