Questo protocollo descrive un metodo semplice e riproducibile per purificare e coltivare specifici tipi di neuroni primari. Queste colture sono adatte per l'analisi elettrofisiologia, morfologica e di sopravvivenza. Culture di neuroni purificati possono essere utilizzate per studiare i fondamenti della fisiologia neuronale, la formazione di sinapsi e come si sviluppano le reti neuronali.
Mentre ci concentriamo sulle principali cellule glutattergiche corticali e sugli internauri GABAergici, questa procedura può essere facilmente modificata per studiare qualsiasi linea neuronale che esprima proteine fluorescenti. Per preparare le copertine di vetro, scongelare prima un'aliquota di cinque millilitri di 200 microgrammi per soluzione PLL millilitro. Diluire questa soluzione stock a 20 microgrammi per millilitro aggiungendo 45 millilitri di acqua pura di grado di iniezione.
Quindi filtrare sterilizzare la soluzione in un nuovo tubo conico da 50 millilitri ed etichettare questo tubo come sterile PLL. Quindi, posizionare 100 coverlips in vetro sterile rotondo da 12 millimetri nella soluzione PLL sterile. Agitare il tubo ogni cinque-10 minuti per due o tre minuti per garantire un rivestimento uniforme.
Dopo 40 minuti di rivestimento PLL, prendere due pezzi di carta velina e posarli piatti nell'armadio di flusso. Sterilizzare la carta utilizzando il 70% di etanolo, quindi appiattire per rimuovere le pieghe e lasciare asciugare. Dopo aver rivestito i coperchi in vetro per un'ora con PLL, rimuovere la soluzione PLL in eccesso e aggiungere acqua sterile di grado di iniezione.
Agitare delicatamente i copripazzi per due o tre secondi per rimuovere la PLL in eccesso. Ripetere questo passaggio di risciacquo altre due volte. Rimuovere l'acqua in eccesso e quindi trasferire i copripazzo sulla carta velina sterile.
Una volta asciutti, trasferire i copricapo su una piastra di coltura di 24 pozza. Per preparare le soluzioni di coltura cellulare, misurare 12 millilitri di tampone di coltura cellulare in un tubo conico da 15 millilitri ed etichettare come BSA. Misurare cinque millilitri di tampone di coltura cellulare in un diverso tubo da 15 millilitri ed etichettare come papaina.
Successivamente, incubare entrambi i tubi per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere 120 milligrammi di BSA al tubo etichettato BSA. Quindi invertire il tubo per aiutare a sciogliere la soluzione.
Quindi aggiungere sette milligrammi di papaina al tubo etichettato papaina. Riportare entrambi i tubi al bagno d'acqua per 15 minuti. Filtrare sterilizzare la soluzione BSA in un tubo conico fresco.
Dividere la soluzione BSA sterile in tre tubi ed etichettare ogni tubo come BSA sterile e uno, due o tre. Ora filtrare sterilizzare il tubo di papaina ed etichettare il tubo come papaina sterile. Riportare tutti i tubi al bagno d'acqua e continuare a incubare a 37 gradi Celsius fino all'uso.
Per prepararsi alla dissezione tissutale, stendere il bisturi, le forbici, le forcelle e la spatola necessari per la dissezione dell'ippocampo e della corteccia. Posizionare due piastre petri da 35 millimetri e una piastra di Petri da 100 millimetri contenente carta filtrante sterile nell'armadio di flusso. Raccogliere NexCre transgenico; Ai9 o vesicolare GABA trasportatore Venus cuccioli di topo che devono essere sezionati utilizzando una lampada fluorescente con adeguati filtri di eccitazione ed emissione per discriminare i cuccioli fluorescenti dai compagni di litro di tipo selvaggio.
Immediatamente prima di sezionare gli animali, riempire ogni piastra di Petri con tampone di coltura cellulare sterile refrigerato. Dopo la dissezione, trasferire attentamente il cervello del cucciolo transgenico su una carta da filtro sterile. In primo luogo, sezionare il cervelletto e separare i due emisferi.
Quindi separare accuratamente l'ippocampo e la corteccia da ogni emisfero. Trasferire il tessuto sezionato in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente tampone di coltura cellulare refrigerata. Quindi trasferire l'ippocampo sezionato e la corteccia sul coperchio di un'altra piastra di Petri di 35 millimetri.
Usando il bordo piatto di una lama bisturi, tritare accuratamente il tessuto in un movimento incrociato fino a quando rimangono solo piccoli pezzi. Successivamente, trasferire il tessuto tritato con una piccola quantità di soluzione di papaina dal coperchio della piastra di Petri al tubo di papaina sterile. Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per 25 minuti.
Dopo l'incubazione della papaina, trasferire il tubo sterile di papaina e i tubi BSA sterili nell'armadio di flusso. Quindi utilizzare una pipetta Pasteur da un millilitro per trasferire solo il tessuto corticoippocampale dal tubo di papaina nel tubo BSA. Al fine di rompere eventuali grandi grumi di tessuto, triturare il tessuto più volte usando una pipetta Pasteur da un millilitro.
In seguito, triturare il tessuto sette volte usando una pipetta Pasteur a punta fine. Dopo 30 secondi, trasferire un millilitro della soluzione inferiore e del tessuto dal tubo BSA uno al tubo BSA due. Triturare il tessuto nel tubo BSA due volte utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine.
Dopo la triturazione, trasferire un millilitro del tessuto inferiore e la soluzione dal tubo BSA uno al tubo BSA tre. Triturare il tessuto nel tubo BSA tre volte. Dopo la triturazione, trasferire tutta la soluzione e il tessuto dai tubi due e tre nel tubo BSA uno.
Triturato da due a tre volte in più e centrifuga a 3.000 volte g per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il supernatante dal tessuto pelletato e rimescolare le cellule utilizzando una pipetta P1000 in due millilitri di ibernato completo Un mezzo a bassa fluorescenza. Quindi triturare il tessuto 20 volte per garantire la completa resuspensione della soluzione tissutale.
Successivamente, filettare la sospensione cellulare attraverso un setaccio cellulare di 30 micrometri in un tubo campione di polistirolo. Preparare i tubi di raccolta dello smistamento cellulare pipettando 300 microlitri di supporti A completamente ibernati al numero richiesto di tubi in polipropilene. Per ordinare ogni tipo di cella fluorescente, scegliere i filtri di eccitazione ed emissione appropriati.
Eccitare la proteina Venus usando una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e rilevare la luce emessa attraverso il set di filtri di emissione 530/40. Eccitare la proteina TdTomato utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione di 531 nanometri e rilevare la luce emessa attraverso il set di filtri di emissione 575/30. Per un'elevata purezza, ordinare le celle fluorescenti con etichetta brillante.
Dopo lo smistamento delle cellule, trasferire le celle raccolte in due tubi di centrifuga del fondo rotondo millilitro. Quindi centrifugare le cellule a 3.000 volte g per tre minuti per formare un pellet cellulare. Rimospendare il pellet cellulare nella quantità richiesta di mezzo NBA completo preri warmed per ottenere una densità cellulare di 1.000 celle per microlitro.
Per confermare la presenza di cellule dissociate, controllare la soluzione cellulare al microscopio utilizzando un obiettivo 4X o 10X. Prima di placcare le cellule, vortice a una velocità media per due o tre secondi per garantire una sospensione uniforme delle celle. Dopo il vortice, pipettare rapidamente 10 microlitri della sospensione cellulare al centro di ogni coverlip.
Dopo un'ora, nutrire le cellule con 500 microlitri di mezzo NBA completo preri warmed e tornare all'incubatore a 37 gradi Celsius. Per co-colturare i neuroni purificati e le cellule gliali, passare le cellule gliali al numero richiesto di inserti di coltura cellulare. Questo viene fatto placcando 40.000 cellule gliali in una goccia da 500 microliter di mezzo NBA completo.
Dopo un'ora, trasferire gli inserti di coltura cellulare gliale ai neuroni purificati. Rimuovere i supporti in eccesso dagli inserti di coltura e riportare le piastre all'incubatore per la coltura. Dopo lo smistamento riuscito, i neuroni placcati dovrebbero apparire di forma rotonda con una membrana liscia e dovrebbero essere visti risparmiare neuroidi dopo circa un'ora in vitro.
Entro sette giorni in vitro, anche se può essere evidente una morte cellulare, le cellule vitali dovrebbero essere presenti in tutte le condizioni di coltura. L'analisi delle colture purificate rivela che sia i neuroni glutattergici che GABAergici sono stati in grado di estendere assoni e dendriti dai loro corpi cellulari e mantenere la capacità di generare potenziali d'azione in risposta alle iniezioni di corrente depolarizzante super soglia. In particolare a seguito della purificazione, solo i neuroni GABAergici hanno ricevuto una quantità significativa di trasmissione sinaptica spontanea e i neuroni glutattergici hanno ricevuto pochissima trasmissione sinaptica in assenza di cellule gliali.
È importante sottolineare che coltivare neuroni purificati con cellule gliali migliora la crescita e la sopravvivenza dei neuroni, oltre a promuovere la trasmissione sinaptica nelle colture glutatergiche. Un sufficiente rivestimento polarizzante dei coprispasti e il mantenimento del pH fisiologico dei mezzi di coltura durante tutta la procedura sono fondamentali per garantire colture cellulari di buona qualità. Seguendo questo protocollo, dovrebbe essere possibile eseguire il sequenziamento dell'RNA e la spettroscopia di massa proteica su colture purificate consentendo di indagare processi traslazionali e trascrizionali in specifici tipi neuronali.
