Gli autori ringraziano il Dott. Paolo Janmey presso l&#39;Università della Pennsylvania per la fornitura di linee cellulari utilizzate in questo documento. QW anche riconoscere JF Byfield e Evan Anderson per le loro discussioni penetranti sulle tecniche di AFM.

1. Calibrare la Costante molla di sbalzo <ol><li> Caricare il cantilever in AFM in base alle istruzioni del produttore. È necessario pulire il supporto a sbalzo con etanolo prima di qualsiasi esperimenti. Ciò contribuirà a limitare la contaminazione batterica di cultura durante le misurazioni AFM. </li><li> Calibrare InvOLS (Inverse Leva Sensibilità ottica). Questo parametro indica la quantità di risposta fotodiodo (Volt) per nanometro di sbalzo deflessione. </li><li> Caricare un vetrino pulito sul palco del campione, quindi installare la testa AFM e regolare il raggio laser e l&#39;allineamento in base alle istruzioni del produttore. Inserire la punta AFM sul vetrino. </li><li> Con il piezo ritirata, riallineare lo specchio di una lettura fotodiodo di -2 V. Eseguire una misurazione spettroscopia forza con un trigger point (risposta massima fotodiodo) di 2 V. </li><li> Con il piezo ritirata, riallineare lo specchio di una lettura fotodiodo di -2 V. Effettuare un foRCE misura spettroscopia con un trigger point (risposta massima fotodiodo) di 2 V. Nota: I valori di tensione qui sono specifici per l&#39;asilo AFM. Questo valore deve essere impostato in base alle specifiche fornite dal produttore. Dopo l&#39;acquisizione dei dati è completa, lo zoom alla regione ferma-contatto della curva di forza. Eseguire un adattamento lineare a questa regione per trovare la pendenza, che sarà in V / nm. Il reciproco di questo valore descrive la sensibilità ottica dell&#39;insieme cantilever-fotodiodo. </li><li> Ripristinare l&#39;allineamento specchio per una deviazione libero di 0 V. </li><li> Calibrare la costante della molla a sbalzo. Un metodo termico-tune viene utilizzato per determinare la costante di molla a sbalzo 28. </li><li> Dopo aver calibrato i InvOLS, sollevare lo scanner lontano dal palco campione tale che non ci sono interazioni tra la punta e il campione. </li><li> Iniziare l&#39;acquisizione di dati termici. Durante questo processo, la vibrazione termica della trave a sbalzo è Recorded. Il software AFM analizza uno spettro di potenza di un tale vibrazione termica e trame in una finestra di dati. </li><li> Dopo alcuni secondi di acquisizione dati, eseguire un adattamento per il segmento di dati centrata alla frequenza fondamentale più bassa (risonanza fondamentale) picco per determinare la costante della molla. </li></ol> 2. Caricamento del campione <ol><li> Installare il riscaldatore accessorio Piatto sul palco AFM, se non è già dotato. </li><li> Impostare la temperatura a 37 ° C, e attendere 20 min per il sistema di raggiungere un equilibrio termico stabile. </li><li> Posizionare il piatto cultura sul palcoscenico AFM e fissarlo utilizzando il morsetto con il riscaldatore piatto. È importante minimizzare il tempo tra la rimozione del piatto dall&#39;incubatore e posizionandolo sulla scena, per evitare traumi alle cellule. Per misurazioni più lunghi di 30 min, CO 2 medi indipendente dovrebbe essere usato per sostituire il normale mezzo di coltura. </li><li> Applicare una piccola goccia di 37 ° C terreno di coltura alla punta di tegli cantilever AFM, e abbassare la testa AFM finché la punta è appena immerso in un liquido. </li><li> Utilizzo della fotocamera top-view CCD, riallineare il fascio laser sul cantilever (l&#39;allineamento nel liquido sarà diversa in aria, a causa della variazione dell&#39;indice di rifrazione del mezzo). </li><li> Inserire la punta AFM in una zona pulita del piatto cultura. </li><li> Eseguire la calibrazione dei InvOLS come descritto sopra, per la sensibilità cantilever nell&#39;ambiente liquido. </li></ol> Nota: a) Se le cellule sono coltivate su idrogel, la calibrazione di InvOLS dovrebbe essere eseguita in anticipo contro la superficie inferiore di una piastra di coltura riempito di mezzi di coltura cellulare. Quando si passa a campioni di cellule, una particolare attenzione deve essere pagato per non modificare l&#39;allineamento del fascio laser con il cantilever. b) InvOLS deve essere ricalibrato ogni volta che c&#39;è un cambiamento nella allineamento laser. c) Si raccomanda inoltre di prendere InvOLS come media di valore da diverse curve di calibrazione, since ogni calibrazione genera un diverso InvOLS. La variazione InvOLS è, tuttavia, piccolo rispetto al valore medio. Ad esempio, la calibrazione di un Bruker DNP-10 a sbalzo con la costante 0,06 N / m di liquido da 100 volte primavera produrre un valore medio InvOLS di 66,3 nm / V, con deviazione standard di soli 0,5 nm / V. 3. Raccolta Forza Curve di cellulare indentazione <ol><li> Selezionare una cella per il rientro. Con l&#39;ausilio del microscopio ottico, spostare la fase di posizionare il cantilever sopra la cella in modo che la punta si trova nella regione peri-nuclei. Regolazione precisa della posizione a sbalzo può essere realizzato mediante l&#39;applicazione di offset per il scanner X e Y. Nota: Il cantilever AFM deve essere ritirato dalla superficie del campione, mentre spostando la fase di campionamento per selezionare una cella di destinazione. Questo protegge il cantilever urti tra il campione, poiché la superficie del campione non può essere piatta. </li><li> Passare a forzare la modalità Spettroscopia. Impostare il rientrotasso nell&#39;intervallo di 1-10 micron / sec, sufficientemente basso da evitare effetti idrodinamici. </li><li> Impostare il punto di innesco di deflessione, che limita la forza massima indentazione per evitare danni alle cellule. Selezionare l&#39;opzione triggering relativa, che correggerà eventuali derive nel segnale di deflessione. Una forza massima di 2 nn è un buon punto di partenza per la maggior parte dei campioni. Questo valore, tuttavia, dovrebbe essere regolata in base alla rigidità del campione. Per campioni morbidi un valore inferiore deve essere utilizzato per evitare un eccesso di indentazioni al campione. Per campioni rigidi un valore elevato dovrebbero essere utilizzati per generare indentazione misurabili. </li><li> Impostare la distanza forza sufficientemente grande da garantire che la punta sarà completamente staccato dalla cella tra le misurazioni di forza. Solitamente, la distanza di forza è fissato a 5 micron. </li><li> Comandare l&#39;AFM per prendere una singola curva forza. </li><li> Raccogliere almeno tre curve di forza in diverse località della regione peri-nuclei di ogni cellula. Anche se è utile per prendere multiplacurve su ogni cella di dati statistici affidabili, prendendo troppe curve di forza possono portare a cambiamenti nella rigidità delle cellule a causa di stress dalla sonda AFM. </li><li> Quando la raccolta dei dati è completa, ritirare la punta, e ripetere i passaggi 3,1-3,6 per le celle come necessario per i buoni dati statistici sulla rigidità delle cellule in una determinata condizione di esempio. Solitamente, 30 celle sono misurati per ogni condizione. </li></ol> Per caratterizzare la distribuzione di rigidezza all&#39;interno di una singola cellula, viene applicata la modalità forza-map. Nella modalità Forza-mappa, impostare un formato di scansione per includere la regione di interesse; impostare una risoluzione appropriata, impostare i parametri di rientro di quelli selezionati per curve di spinta singoli; l&#39;AFM sarà poi raster in tutta l&#39;area del campione definito e prendere curve di spinta singoli ad ogni pixel nella regione campione. 4. Analisi dei dati Le curve di forza registrati vengono analizzati utilizzando una procedura MATLAB personalizzato per calcolare la rigidezza cella. Quello che segue è una breve descrizione del procedimento MATLAB: <ol><li> Il programma MATLAB identifica il punto di contatto e coordinate z0 d0 (vedi Figura 1) usando un algoritmo adottato da un metodo pubblicato da Lin et al 29.: </li><li> Per ciascun punto di dati nella curva di forza, eseguire un adattamento lineare dei dati alla sinistra del punto di interesse, e un modello Hertz adatta a destra (utilizzando il punto selezionato come punto iniziale di contatto), fino al set massima indentazione (200-300 nm consigliati). </li><li> Per ogni punto, calcolare l&#39;errore relativo RMS di entrambi convulsioni ed sommare questi valori. </li><li> Il punto che raggiunge l&#39;errore totale minimo raccordo viene selezionata come punto iniziale di contatto. Nota: il tempo di calcolo può essere ridotto mediante l&#39;attuazione di una ricerca d&#39;oro-sezione piuttosto che la scansione lineare tutta la curva forza. </li><li> Esempio di deformazione δ e rientro forza F sono calcolate come: <img alt="Equazione 1"fo: contenuti-width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> Un raccordo minimi quadrati viene applicato per adattarsi alla F vs dati δ nella regione post-contatto, z ≥ z 0, al modello Hertz per estrarre il modulo di Young, E della cella: <img alt="Equazione 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , Dove v è il modulo di Poisson. Nota: Quando δ è superiore al 10% dello spessore del campione (altezza cella), la rigidezza cella misurata viene influenzato dalla rigidità del substrato. Lo spessore della regione peri-nucleare è solitamente dell&#39;ordine di pochi micrometri. Pertanto, solo i primi 200-300 nm di F-δ curva si adattano al modello di Hertz. </li></ol>

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Wagner, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Softness,+strength+and+self-repair+in+intermediate+filament+networks.">Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks.</a> Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model.">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+prestress.+I.+Stiffness+and+prestress+are+closely+associated+in+adherent+contractile+cells.">Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).</li><li>Kasza, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+A+is+essential+for+active+cell+stiffening+but+not+passive+stiffening+under+external+force.">Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force.</a> Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).</li><li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanics+as+an+indicator+of+cytoskeletal+structure+and+function.">Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).</li><li>Schafer, A., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+myosin+II+activity+on+stiffness+of+fibroblast+cells.">Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells.</a> Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).</li><li>Guck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+deformability+as+an+inherent+cell+marker+for+testing+malignant+transformation+and+metastatic+competence.">Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence.</a> Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).</li><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).</li><li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer.">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).</li><li>Rotsch, C., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+changes+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+in+fibroblasts:+an+atomic+force+microscopy+study.">Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study.</a> Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).</li><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+extract+selectively+targets+nanomechanics+of+live+metastatic+cancer+cells.">Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 22, 215101 (2011).</li><li>Hoffman, B. D., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+dissecting+the+physical+responses+of+cells+to+force.">Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).</li><li>Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consensus+mechanics+of+cultured+mammalian+cells.">The consensus mechanics of cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).</li><li>Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology,+stress+fluctuations,+and+active+behavior+of+living+cells.">Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells.</a> Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+probes+length+scale+dependent+rheology.">Microrheology probes length scale dependent rheology.</a> Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).</li><li>Deng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+slow+dynamics+of+the+cytoskeleton.">Fast and slow dynamics of the cytoskeleton.</a> Nature Materials. 5, 636-640 (2006).</li><li>Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+Aspiration+of+Substrate-attached+Cells+to+Estimate+Cell+Stiffness.">Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness.</a> J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).</li><li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+aspiration+of+living+cells.">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).</li><li>Levental, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+indentation+device+for+measuring+micrometer-scale+tissue+stiffness.">A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness.</a> J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).</li><li>Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+viscoelastic+properties+of+thin+regions+of+fibroblasts+using+atomic+force+microscopy.">Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+elastic+properties+of+biological+samples+with+the+AFM.">Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine &amp; Biology Society. 16, 47-57 (1997).</li><li>Crocker, J. C., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-particle+tracking+and+two-point+microrheology+in+cells.">Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).</li><li>Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mechanical+characterization+of+lung+tissue+using+atomic+force+microscopy.">Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).</li><li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates.">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).</li><li>Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+l929+cells+measured+by+atomic+force+microscopy:+Effects+of+anticytoskeletal+drugs+and+membrane+crosslinking.">Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking.</a> Scanning. 20, 389-397 (1998).</li><li>Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+viscoelastic+properties+of+human+platelets+with+the+atomic+force+microscope.">Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).</li><li>Levy, R., Maaloum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+spring+constant+of+atomic+force+microscope+cantilevers:+thermal+fluctuations+and+other+methods.">Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods.</a> Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).</li><li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft,+inhomogeneous+materials.">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).</li><li>Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muller+cell+expression+of+genes+implicated+in+proliferative+vitreoretinopathy+is+influenced+by+substrate+elastic+modulus.">Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).</li><li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+elasticity:+Measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation.">Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li><li>Lele, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+cell+mechanics+and+mechanotransduction.">Tools to study cell mechanics and mechanotransduction.</a> Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).</li><li>A-Hassan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy.">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).</li><li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Hertzian+approach+to+analyzing+mechanical+properties+of+endothelial+cells+probed+by+atomic+force+microscopy.">Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).</li><li>Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+nanomechanics+of+live+neuronal+growth+cones+analyzed+by+atomic+force+microscopy.">Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).</li><li>Byfield, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+filamin+A+prevents+cells+from+responding+to+stiffness+gradients+on+gels+coated+with+collagen+but+not+fibronectin.">Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin.</a> Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).</li><li>Cross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+analysis+of+human+metastatic+cancer+cells.">AFM-based analysis of human metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 19, 384003 (2008).</li><li>Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+elasticity+in+biological+gels.">Nonlinear elasticity in biological gels.</a> Nature. 435, 191-194 (2005).</li><li>Wen, Q., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+physics+of+the+cytoskeleton.">Polymer physics of the cytoskeleton.</a> Current Opinion in Solid State &amp; Materials Science. 15, 177-182 (2011).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy.">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).</li><li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di indentazione AFM ha vantaggi per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi. Seppur meno sensibile della citometria a torsione magnetica e pinzette ottiche, in grado di misurare le forze a livello piconewton 32, l&#39;AFM in grado di rilevare la forza di resistenza da campioni che vanno da decine di pico-Newton a centinaia di nano-Newton, paragonabili a spaziare di forza che può essere applicato a cellule usando una micropipetta 19. Questo intervallo di forza adatta al...

Proprietà meccaniche, in particolare rigidità, di singole cellule e loro matrici extracellulari circostanti (ECM) sono fondamentali per molti processi biologici che comprendono la crescita cellulare, la motilità, divisione, differenziazione e omeostasi tissutale. 1 È stato dimostrato che cellule rigidità meccanica è determinata principalmente dalla il citoscheletro, specialmente le reti di actina e filamenti intermedi e altre proteine ​​ad essi associati. 2 risultati di prove meccaniche su reti in vitro di actina e filamenti intermedi suggeriscono che la meccanica delle cellule dipende in gran parte la struttura del citoscheletro e la pre-stress in il citoscheletro. 3-5 Rigidità di cellule vive è quindi considerato come un indice per valutare la struttura del citoscheletro 6, 7 attività miosina e molti altri processi cellulari. Ancora più importante, i cambiamenti nelle proprietà meccaniche delle cellule sono spesso trovati ad essere strettamente associatiato con diverse condizioni di malattia come la formazione di tumori e metastasi 8-10 Monitoraggio della rigidità meccanica delle cellule viventi può quindi fornire un nuovo modo di monitorare la fisiologia cellulare,. di rilevare e diagnosticare le malattie 8;. ed a valutare l&#39;efficacia dei trattamenti farmacologici 11 , 12 Metodi multipli comprese microrheology particella-tracking, 13-16 torsione magnetica citometria, 17 micropipetta aspirazione 18,19 e micropenetrazione 20-22 sono stati sviluppati per misurare l&#39;elasticità delle cellule. Particella di monitoraggio microrheology ripercorre le vibrazioni termiche di entrambi particelle fluorescenti inferiori al micron iniettati in cellule o marcatori fiduciali all&#39;interno del citoscheletro delle cellule. 23 proprietà elastiche e viscose di cellule sono calcolati gli spostamenti delle particelle misurate usando il teorema di fluttuazione-dissipazione. 14,23 Questo metodo permette di misurazioni simultanee di localeproprietà meccaniche con alta risoluzione spaziale in luoghi diversi in una cella. Tuttavia, l&#39;iniezione di particelle fluorescenti in cellule può portare a cambiamenti nella funzione cellulare, la struttura del citoscheletro, e quindi la meccanica delle cellule. Il metodo di aspirazione micropipetta applica pressione negativa in una micropipetta di diametro compreso tra 1 e 5 um succhiare un piccolo pezzo di membrana cellulare nella pipetta. Cella rigidezza viene calcolata dalla pressione negativa applicata e deformazione della membrana cellulare. 18 Questo metodo, tuttavia, non può rilevare la distribuzione eterogenea della rigidezza attraverso la cella. Citometria torsione magnetica (MTC) applica campo magnetico per generare coppia sulla super-perline paramagnetiche attaccati alla membrana cellulare. 17 Cella rigidezza è derivato in questo metodo dal rapporto tra la coppia applicata e la deformazione torsione della membrana cellulare. È difficile controllare la posizione di perline magnetiche nel metodo MTC, ed è anche challenging per caratterizzare la deformazione torsione con alta risoluzione. Micropenetrazione applica un penetratore con geometrie ben definite a pugni nella cella. La forza di rientro e il rientro risultato cellule seguono spesso la previsione del modello Hertz. Di Young dei moduli delle celle può essere calcolata dalle curve forza indentazione dotandoli al modello Hertz. Questo metodo è stato ampiamente applicato per testare le proprietà meccaniche del tessuto e di cellule dispetto delle sue limitazioni quali l&#39;incertezza nella determinazione contatto puntiforme, applicabilità del modello Hertz, e il potenziale di danneggiare fisicamente le cellule. Tra i molti dispositivi per microindentaion 20, il microscopio a forza atomica (AFM) è disponibile in commercio ed è stato ampiamente applicato per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule e tessuti viventi 21,24-27. Questo documento dimostra la procedura di utilizzo di un asilo MFP3D-Bio AFM per la caratterizzazione meccanica delle cellule. AFM non suly fornisce topografia ad alta risoluzione di cellule, ma anche è stato ampiamente applicato per caratterizzare le proprietà meccaniche delle cellule dei tessuti. Il principio della AFM indentazione è illustrato in Figura 1. Il cantilever AFM avvicina alla cella da pochi micrometri sopra; fa contatto con la cellula; trattini la cella in modo che la flessione della leva raggiunge un punto di regolazione preselezionata; e tira via dalla cella. Durante questo processo la flessione della leva viene registrata come funzione della sua posizione come mostrato nella Figura 1. Prima di prendere contatto con la cellula, il cantilever muove nel medio senza alcuna deviazione apparente. Quando rientro in cella, le curve a sbalzo e di aumento del segnale di deflessione. I cantilever sono modellati come travi elastica in modo che la loro deflessione è proporzionale alla forza applicata alla cella. Impostando la massima flessione della leva, la grandezza massima della forza applicata al campione viene limitata per evitare dAMAGE alle cellule. La porzione della curva di forza dal punto B al punto C in figura 1, dove i trattini punta nella cellula, viene adattata al modello hertz per estrarre la rigidità cella. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Figura 1. Illustrazione di AFM micropenetrazione e l&#39;interpretazione della curva di forza. Il pannello superiore mostra il movimento del cantilever AFM guidato dallo scanner piezoelettrico. La posizione verticale della mensola z e flessione della leva segnale d viene registrato durante il processo. Il cantilever parte da un punto, di pochi micrometri sopra la cella. Mentre si avvicina la cella, la rientranza δ campione rimane zero fino a raggiungere il punto b, in cui la punta viene a contatto con la cellula. Le coordinate del punto b nel grafico sono valori criticiper l&#39;analisi dei dati, indicato con (z 0, d 0&gt;). Da B a C, i trattini sbalzo nella cella finché flessione della leva raggiunge un punto di regolazione, che è impostato per essere il rapporto tra la forza massima indentazione mirata e la costante elastica cantilever. Una volta che il segnale di deflessione raggiunge il valore massimo prestabilito, il cantilever viene poi ritirato dalla cella a punto d, dove spesso viene tirata verso il basso a causa di punta-campione adesione, stacca dalla cella e ritorna alla sua posizione iniziale a e. Il pannello destro mostra la relazione tra la rientranza e la z registrata e segnale d. In sul pannello di sinistra inferiore è un diagramma di una curva rappresentativa forza, il rientro massimo di un cantilever, la cui costante elastica è misurata essere 0.07N / m, è impostato per essere 17 nm, in modo che la forza massima applicata al rientro campione è 1,2 nN. Le posizioni chiave durante il rientro sono contrassegnati.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Atomic Force Microscope </td>
<td>Asylum Research</td>
<td>MFP3D-BIO</td>
</tr>
</tbody>
</table>

measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy

Proprietà meccaniche delle cellule e la matrice extracellulare (ECM) svolgono un ruolo importante in molti processi biologici tra cui la differenziazione di cellule staminali, la formazione del tumore, e la guarigione delle ferite. Cambiamenti nella rigidità delle cellule e ECM sono spesso segni di cambiamenti nella fisiologia o malattie nei tessuti delle cellule. Quindi, rigidità cellula è un indice per valutare lo stato di colture cellulari. Tra la moltitudine di metodi applicati per misurare la rigidità di cellule e tessuti, micro-indentazione usando un microscopio a forza atomica (AFM) fornisce un modo per misurare in modo affidabile la rigidità delle cellule viventi. Questo metodo è stato ampiamente applicato per caratterizzare la rigidezza micro-scala per una varietà di materiali, tra cui superfici metalliche a tessuti biologici molli e cellule. Il principio di base di questo metodo è di rientrare una cella con una punta AFM di geometria selezionata e misurare la forza applicata dalla flessione del cantilever AFM. Montaggio della curva forza-indentazione per la modalità di Hertzl per la corrispondente geometria della punta può dare misure quantitative di rigidezza materiale. Questo documento illustra la procedura per caratterizzare la rigidezza delle cellule viventi mediante AFM. Passaggi chiave, tra cui il processo di AFM calibrazione, acquisizione forza-curva, e l&#39;analisi dei dati utilizzando una routine di MATLAB sono dimostrati. Vengono anche discussi limiti di questo metodo.

La figura 2a mostra tre curve di forza rappresentativi tratti da fibroblasti 3T3 in coltura su superficie di plastica, gel di poliacrilammide di moduli di Young 3.000 Pa e 17.000 Pa, rispettivamente. Dopo aver identificato con attenzione i punti di contatto delle curve, la forza di rientro in funzione della deformazione delle cellule è tracciata in Figura 2b. Sotto una forza di grandezza inferiore a 0,3 nN, una piramide forma della punta del trattini 3 micrometri in una cellula in colt...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

measuring-mechanical-properties-living-cells-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

39.6K Views.  Worcester Polytechnic Institute. Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Video: Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Ricerca

Bioingegneria

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificare le proprietà meccaniche del glicocalice endoteliale con microscopia a forza atomica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Utilizzando biologia sintetica per Ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Un sistema di prova millimetro scala flessionale per misurare le proprietà meccaniche di spicole di spugna marina

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...